本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從頂花板凳果中提取東莨菪亭的方法。

背景技術(shù)：

頂花板凳果(pachysandraterminalissieb.etzucc.)為黃楊科板凳果屬植物，又名頂蕊三角咪、長青草、捆仙七、轉(zhuǎn)筋草和富貴草。該植物具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、鎮(zhèn)靜安神的功效，故陜西民間主要用于治療風(fēng)濕麻痹、肢體麻木、跌打損傷、月經(jīng)過多、煩躁不安等，也可作為復(fù)方藥治療老年慢性支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。迄今為止，國內(nèi)外對(duì)頂花板凳果的研究大多僅限于其甾體生物堿成分及三萜類成分的報(bào)道，未見對(duì)該植物香豆素類化合物提取分離方法的報(bào)道。

東莨菪亭在植物中分布廣泛，其中在茄科植物東莨菪(scopoliajaponicamaxim)中含量較高。東莨菪亭為香豆素類化合物，其化學(xué)名為：7-羥基-6-甲氧基香豆素。東莨菪亭的結(jié)構(gòu)式為：

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，東莨菪亭有明顯的藥理作用，東莨菪亭不僅能夠抑制主動(dòng)脈收縮，緩解動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的心肌缺血，還能夠?qū)褂筛吣蛩嵫Y引起的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。具有抗癌、抗氧化、抗關(guān)節(jié)炎和降溫等臨床藥理作用；另外，也有對(duì)東莨菪亭代謝方面的報(bào)道。但是目前提取東莨菪亭的方法所用的溶劑不夠環(huán)保，對(duì)人體有毒害，且成本較高，不夠經(jīng)濟(jì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從頂花板凳果中提取東莨菪亭的方法，該方法成本低廉，溶劑環(huán)保，操作簡(jiǎn)單，提取得到的東莨菪亭純度高。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

包括以下步驟：

1)將頂花板凳果粉末進(jìn)行提取處理，得到頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏；

2)取頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏，上樣于硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，將石油醚:乙酸乙酯體積比為(25:1)～(10:1)洗脫的餾分合并，蒸干溶劑，得到第一次過柱部分；

3)取第一次過柱部分，上樣于硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸系統(tǒng)為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，合并主斑點(diǎn)相同的餾分后，蒸干溶劑，得到第二次過柱部分；

4)將第二次過柱部分，上樣于硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸系統(tǒng)為洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，蒸干溶劑，得到東莨菪亭。

進(jìn)一步地，步驟1)中頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏的制備，具體包括以下步驟：

(1)將頂花板凳果粉末用8～15倍量體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶液回流提取，回收提取液后濃縮得浸膏；

(2)將浸膏用8～15倍量體積分?jǐn)?shù)為1～2％的鹽酸溶解后過濾，得到濾渣；

(3)將濾渣用8～15倍量乙酸乙酯溶解后過濾，回收濾液并濃縮得乙酸乙酯部位浸膏。

進(jìn)一步地，步驟(1)所述的用體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇回流提取次數(shù)為2～4次，每次2～3h；步驟(3)用乙酸乙酯溶解過濾的重復(fù)次數(shù)為2～4次，每次1～2h。

進(jìn)一步地，步驟2)的洗脫液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為(200:1)～(0:1)。

進(jìn)一步地，步驟3)的洗脫液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為(25:1)～(1:3)。

進(jìn)一步地，步驟3)將石油醚和乙酸乙酯的體積比為(2:1)～(1:1)洗脫的餾分合并。

進(jìn)一步地，步驟4)的洗脫液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為(5:1)～(1:1)。

進(jìn)一步地，步驟4)將石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1洗脫的餾分合并。

進(jìn)一步地，步驟3)和步驟4)的洗脫液中，石油醚和乙酸乙酯的總體積與甲酸的體積之比均為100：(0.1～0.4)。

進(jìn)一步地，硅膠柱中所用硅膠的粒度均為200～300目；對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)是采用薄層色譜法進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下進(jìn)行檢視。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明方法將頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏首先過硅膠柱進(jìn)行第一次梯度洗脫，收集的相同餾分再經(jīng)反復(fù)硅膠柱的梯度洗脫，分離得到東莨菪亭，是首次從中藥材頂花板凳果中分離得到單體化合物東莨菪亭的方法。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行、成本低廉，分離得到的東莨菪亭的純度達(dá)到99％以上。本發(fā)明在第一次硅膠柱分離之后使用含甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為流動(dòng)相，該流動(dòng)相體系成本低廉、環(huán)保低毒，不僅大大降低了環(huán)境污染及對(duì)人體的毒性傷害，而且節(jié)約了成本；更重要的是，在流動(dòng)相中加入甲酸，不僅能夠提高分離效率，而且有效避免了東莨菪亭的開環(huán)分解和異構(gòu)化，更加改善了分離效果。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提取過程簡(jiǎn)單，溶劑環(huán)保低毒，且保證提取效率。

進(jìn)一步地，本發(fā)明中甲酸的用量在1％～4％，有效防止影響洗脫液極性，避免導(dǎo)致目標(biāo)化合物過早地被洗脫出，出現(xiàn)不能成功與其他極性相近的化合物分離的現(xiàn)象。

附圖說明

圖1為本發(fā)明分離得到的東莨菪亭的¹h-nmr圖譜(400mhz)；

圖2為本發(fā)明分離得到的東莨菪亭的¹³c-nmr圖譜(100mhz)；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)制備頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏；具體包括以下步驟：

(1)將頂花板凳果粉末用8～15倍量體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶液回流提取，提取次數(shù)為2～4次，每次2～3h，回收提取液后濃縮得浸膏；其中倍量均是所加溶液體積相對(duì)原料質(zhì)量的倍數(shù)，此處是指95％的乙醇溶液所加的體積是頂花板凳果粉末質(zhì)量的8～15倍；

(2)將浸膏用8～15倍量體積分?jǐn)?shù)為1～2％的鹽酸溶解后過濾，得到濾渣；

(3)將濾渣用8～15倍量乙酸乙酯溶解后過濾，重復(fù)次數(shù)為2～4次，每次1～2h，回收濾液并濃縮得乙酸乙酯部位浸膏。

2)取頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏，上樣于硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚:乙酸乙酯＝(200:1)～(0:1)的體積比進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，將石油醚:乙酸乙酯＝(25:1)～(10:1)的體積比洗脫的餾分合并，蒸干溶劑，得到第一次過柱部分；

3)取第一次過柱部分，上樣于硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚:乙酸乙酯＝(25:1)～(1:3)的體積比進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，即將石油醚:乙酸乙酯＝(2:1)～(1:1)的體積比洗脫的餾分合并，蒸干溶劑，得到第二次過柱部分；

4)將第二次過柱部分，上樣于硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚:乙酸乙酯＝(5:1)～(1:1)的體積比進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，將石油醚:乙酸乙酯＝3:1的體積比洗脫的餾分合并，蒸干溶劑，得到東莨菪亭。

步驟2)、3)、4)中所用的洗脫液為無毒、低刺激性的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑，相比其他常用分離溶劑(如氯仿、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙腈等)，本方法所采用的溶劑系統(tǒng)更為環(huán)保，且對(duì)人體傷害極小。

步驟3)和4)中石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)洗脫液中含有體積分?jǐn)?shù)為0.1～0.4％的甲酸，即石油醚和乙酸乙酯的總體積與甲酸的體積之比均為100：(0.1～0.4)。

本發(fā)明所用硅膠的粒度為200～300目。對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)是采用薄層色譜法進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下進(jìn)行檢視。

實(shí)施例1

從頂花板凳果中提取東莨菪亭的方法，包括以下步驟：

1)將頂花板凳果粗粉約7.5kg，用10倍量的95％乙醇回流提取3次，每次2h，回收提取液，減壓濃縮得乙醇提取浸膏，將1.0kg浸膏用10倍量2.0％的鹽酸溶解后過濾，濾渣用10倍量的乙酸乙酯研溶后過濾，重復(fù)次數(shù)為2次，每次2h，將濾液濃縮干燥得乙酸乙酯部位浸膏(32.6g)。

2)取30.0g頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏過常壓硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚與乙酸乙酯體積比為(200:1)～(0:1)的梯度進(jìn)行洗脫，等量收集洗脫液，每份500ml，收集的餾分用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并相同餾分，蒸干溶劑，共得到27個(gè)部分，分別命名為a1-a27，收集洗脫液梯度為石油醚-乙酸乙酯(25:1)～(10:1)的餾分，即a6～a9的餾分，回收溶劑，蒸干，得到第一次過柱部分。其中，所述硅膠粒度為200～300目。

3)將第一次過柱部分過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(25:1)～(1:3)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到第二次過柱部分；

4)將第二次過柱部分再過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(5:1)～(1:1)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到單體化合物85.9mg，通過高效液相色譜法分析純度在99％以上。

將分離得到的單體化合物采用¹h-nmr和¹³c-nmr等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定該化合物結(jié)構(gòu)為7-羥基-6-甲氧基香豆素，即東莨菪亭。

核磁共振圖譜參照?qǐng)D1和圖2，核磁數(shù)據(jù)如下：淡黃色針狀結(jié)晶(dmso)，分子式c10h8o4，相對(duì)分子質(zhì)量192。

¹h-nmr(400mhz,dmso)δppm:10.33(s,1h),7.92(d,j＝9.4hz,1h),7.23(s,1h),6.79(s,1h),6.23(d,j＝9.4hz,1h),3.82(s,3h)。

¹³c-nmr(100mhz,dmso)δppm:56.30(och3),103.05(c-8),109.87(c-5),110.86(c-10),112.02(c-3),144.80(c-4),145.52(c-6),149.80(c-9),151.39(c-7),160.99(c-2)。

將本發(fā)明得到的東莨菪亭與參考文獻(xiàn)中報(bào)道的c譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表1所示：(其中，文獻(xiàn)1：wuyb,zhengcj,qinlp,etal.antiosteoporoticactivityofanthraquinonesfrommorindaofficinalisonosteoblastsandosteoclasts[j].molecules,2009,14,573-583.文獻(xiàn)2：wuq,zoul,yangxw,etal.antiosteoporoticnovelsesquiterpeneandcoumarinconstituentsfromthewholeherbsofcrossostephiumchinense[j].journalofasiannaturalproductsresearch,2009,11,85-90.)

表1東莨菪亭核磁c譜數(shù)據(jù)比對(duì)

從表1中可以看出，本發(fā)明從頂花板凳果中分離得到的單體化合物的c譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的東莨菪亭的數(shù)據(jù)基本一致。

實(shí)施例2

從頂花板凳果中提取東莨菪亭的方法，包括以下步驟：

1)將頂花板凳果粗粉約7.5kg，用8倍量的95％乙醇回流提取2次，每次3h，回收提取液，減壓濃縮得乙醇提取浸膏，將1.0kg浸膏用8倍量1.5％的鹽酸溶解后過濾，濾渣用8倍量的乙酸乙酯研溶后過濾，重復(fù)次數(shù)為3次，每次1h，將濾液濃縮干燥得乙酸乙酯部位浸膏(30.2g)。

2)取28.0g頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏過常壓硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚與乙酸乙酯體積比為(200:1)～(0:1)的梯度進(jìn)行洗脫，等量收集洗脫液，每份500ml，收集的餾分用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并相同餾分，蒸干溶劑，收集洗脫液梯度為石油醚-乙酸乙酯(25:1)～(10:1)的餾分，回收溶劑，蒸干，得到第一次過柱部分。其中，所述硅膠粒度為200～300目。

3)將第一次過柱部分過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(25:1)～(1:3)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到第二次過柱部分；

4)將第二次過柱部分再過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(5:1)～(1:1)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到單體化合物，即東莨菪亭，通過高效液相色譜法分析純度在99％以上。

實(shí)施例3

從頂花板凳果中提取東莨菪亭的方法，包括以下步驟：

1)將頂花板凳果粗粉約7.5kg，用12倍量的95％乙醇回流提取4次，每次2.5h，回收提取液，減壓濃縮得乙醇提取浸膏，將1.0kg浸膏用12倍量1.0％的鹽酸溶解后過濾，濾渣用12倍量的乙酸乙酯研溶后過濾，重復(fù)次數(shù)為4次，每次1.5h，將濾液濃縮干燥得乙酸乙酯部位浸膏(29.7g)。

2)取28.0g頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏過常壓硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚與乙酸乙酯體積比為(200:1)～(0:1)的梯度進(jìn)行洗脫，等量收集洗脫液，每份500ml，收集的餾分用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并相同餾分，蒸干溶劑，收集洗脫液梯度為石油醚-乙酸乙酯(25:1)～(10:1)的餾分，回收溶劑，蒸干，得到第一次過柱部分。其中，所述硅膠粒度為200～300目。

3)將第一次過柱部分過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(25:1)～(1:3)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到第二次過柱部分；

4)將第二次過柱部分再過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(5:1)～(1:1)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到單體化合物，即東莨菪亭，通過高效液相色譜法分析純度在99％以上。

實(shí)施例4

從頂花板凳果中提取東莨菪亭的方法，包括以下步驟：

1)將頂花板凳果粗粉約7.5kg，用15倍量的95％乙醇回流提取2次，每次2h，回收提取液，減壓濃縮得乙醇提取浸膏，將1.0kg浸膏用15倍量1.0％的鹽酸溶解后過濾，濾渣用15倍量的乙酸乙酯研溶后過濾，重復(fù)次數(shù)為3次，每次1.5h，將濾液濃縮干燥得乙酸乙酯部位浸膏(27.8g)。

2)取25.0g頂花板凳果乙酸乙酯部位浸膏過常壓硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按石油醚與乙酸乙酯體積比為(200:1)～(0:1)的梯度進(jìn)行洗脫，等量收集洗脫液，每份500ml，收集的餾分用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并相同餾分，蒸干溶劑，收集洗脫液梯度為石油醚-乙酸乙酯(25:1)～(10:1)的餾分，回收溶劑，蒸干，得到第一次過柱部分。其中，所述硅膠粒度為200～300目。

3)將第一次過柱部分過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(25:1)～(1:3)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到第二次過柱部分；

4)將第二次過柱部分再過硅膠柱，以含0.1％甲酸的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為洗脫液，按體積比(5:1)～(1:1)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液用tlc進(jìn)行檢測(cè)，于365nm紫外燈下檢視，合并主斑點(diǎn)相同的餾分，收集365nm紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)色亮熒光的部分，得到單體化合物，即東莨菪亭，通過高效液相色譜法分析純度在99％以上。

對(duì)比例1

步驟3)和步驟4)中的洗脫液均采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，其它條件同實(shí)施例1。

經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，若體系中沒有加入甲酸，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物在色譜柱中拖尾并與其他化合物交叉，影響分離度。

對(duì)比例2

步驟3)和步驟4)的洗脫液中甲酸的體積濃度依次調(diào)節(jié)為2％、4％、5％、6％和8％，其它條件同實(shí)施例1。

經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，甲酸含量超過0.4％，則會(huì)影響洗脫液極性，導(dǎo)致目標(biāo)化合物過早地被洗脫出，不能成功與其他極性相近的化合物分離。因此，本發(fā)明的洗脫液中甲酸含量最多不能超過洗脫液總體積的0.4％。

對(duì)比例3

將甲酸替換成有機(jī)酸冰醋酸，其它條件同實(shí)施例1。

發(fā)現(xiàn)常用的有機(jī)酸冰醋酸雖然也可達(dá)到改善分離效果的目的，但因?yàn)槠浞悬c(diǎn)較甲酸更高，會(huì)增加后續(xù)蒸干濃縮的時(shí)間及難度，故不采用冰醋酸。

對(duì)比例4

將甲酸替換成堿性溶劑，其它條件同實(shí)施例1。

發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物發(fā)生變化，這是因?yàn)闁|莨菪亭中的α-吡喃酮環(huán)結(jié)構(gòu)具有α,β-不飽和內(nèi)酯的性質(zhì)，在稀堿性溶液中會(huì)發(fā)生水解，生成不穩(wěn)定的順式鄰羥基異阿魏酸鹽，后者經(jīng)酸化即閉環(huán)恢復(fù)為內(nèi)酯；但若長時(shí)間處在堿性環(huán)境中或經(jīng)紫外光照射，則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的反式鄰羥基異阿魏酸。故在東莨菪亭的提取分離過程中，不得有堿性物質(zhì)加入。而甲酸的加入，也會(huì)防止東莨菪亭開環(huán)分解。東莨菪亭在酸、堿性溶液中的轉(zhuǎn)化過程見下反應(yīng)方程式：

對(duì)比例5

步驟1)中的溶劑乙酸乙酯替換為甲醇，其它條件同實(shí)施例1。

發(fā)現(xiàn)無法在后續(xù)提取液及洗脫液中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物東莨菪亭，故使用甲醇提取時(shí)無法提取得到該化合物。

通過以上實(shí)施例和對(duì)比例可知，本發(fā)明使用有機(jī)酸甲酸加入到洗脫液中可以顯著改善拖尾，使化合物更好的與其他成分分離，同時(shí)流動(dòng)相體系中始終不得加入任何堿性溶劑，避免產(chǎn)物分解和異構(gòu)化，其用量也不能超過4％。