本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16的克隆、表達(dá)和應(yīng)用及其生物學(xué)活性的測定方法。

背景技術(shù)：

成纖維細(xì)胞生長因子-16(fibroblastgrowthfactor16,fgf16)是fgf家族成員之一，屬fgf9亞家族(fgf9、fgf16、fgf20)，與fgf9、fgf20間約有73％、62％的同源性，并與已發(fā)現(xiàn)的fgf家族其他成員間也約有30％的相似性。人fgf16基因是定位于x染色體q21.1上的一個隱性遺傳基因，由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成。其編碼的蛋白由207個氨基酸組成，不含信號肽，理論分子量約為23.7kd的堿性蛋白。fgf16與其他fgfs成員一樣，其功能的發(fā)揮主要是通過激活不同受體及其亞型來完成的，具體有fgfr1c、fgfr2c、fgfr3b、fgfr3c、fgfr4。早期研究表明，fgf16是通過激活fgfr4來促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞的增殖，也能與fgf2競爭fgfr1的結(jié)合位點(diǎn)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，fgf16與胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)聯(lián)，特別是在早期心臟發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

fgf16與心臟發(fā)育及心肌損傷修復(fù)有密切的關(guān)聯(lián)。fgf16起始于大鼠心臟中分離，主要在棕色脂肪細(xì)胞中表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞的增殖。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎時期fgf16主要分布在心內(nèi)膜和心外膜，并能促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖以及參與心臟的發(fā)育，于圍產(chǎn)期轉(zhuǎn)移到心肌層表達(dá)并維持其基本形態(tài)和功能的正常。敲除fgf16的小鼠，易死亡并伴有心臟的出血、心室膨脹、心房心室壁變薄以及弱小梁的形成等心臟缺陷方面的表現(xiàn)。此外，fgf16能抵制血管緊張素ii誘發(fā)的心肌肥大和纖維化，同時也能抵制阿奇霉素誘發(fā)的急性心肌損傷作用，說明fgf16在心臟發(fā)育方面是一個不可缺少的因子，其具體功能以及與疾病的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。(wangj,etal.cytokine&growthfactorreviews,2015,26:59-66；matsumotoe,etal.genestocells,2013,18:544-553；hottay,etal.developmentaldynamics,2008,237:2947-2954；lus.y,etal.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2008,373:270-274.)

fgf16與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)聯(lián)。在以skov-3和oaw-42兩種卵巢癌細(xì)胞為研究對象進(jìn)行fgf16生物學(xué)功能的探究中，發(fā)現(xiàn)fgf16在癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，wnt-signaling和pitx2能協(xié)同調(diào)控fgf16的表達(dá)。fgf16通過激活mapk信號通路能促進(jìn)兩種癌細(xì)胞的增殖以及侵襲行為，以此為靶點(diǎn)可作為癌癥治療方面的一個契機(jī)加以利用。(basum,etal.thejournalofbiologicalchemistry,2014,289:1415-1428；suny.l,etal.fishphysiologyandbiochemistry,2012,38:1427-1439.)

fgf16在胚胎發(fā)育時期扮演著重要的角色。如在腦部發(fā)育中，fgf16能促進(jìn)前腦和中腦細(xì)胞的增殖以及端腦和丘腦的發(fā)育，同時fgf16也能促進(jìn)γ-氨基丁酸能神經(jīng)元以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化；如在耳部發(fā)育中，fgf16在耳部部分平行和垂直袋有強(qiáng)烈的表達(dá)且在聽覺系統(tǒng)中，fgf3與fgf16的表達(dá)于早期起協(xié)同作用參與耳蝸管的形成；另外，fgf16與4-5掌骨融合遺傳疾病相關(guān)，也參與了卵母細(xì)胞的發(fā)育以及促進(jìn)人心血管上皮細(xì)胞中的遷移。(nomurar,etal.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2006,347:340-346；miyakea,etal.plosone,2014,30；9(10):e110836；hatche.p,etal.developmentaldynamics2009,238:358-366；olaya-sanchezd,etal.brainstructfunct,2017,222(1):131-149；suny.l,etal.fishphysiologyandbiochemistry,2012,38:1427-1439；jamsheera,etal.birthdefectsresa,2014,100:314-318.)

綜上所述，fgf16具有多種生物學(xué)功能。但迄今為止，國內(nèi)外對于fgf16的研究較少，其相關(guān)的功能及作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。目前，通常采用微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16(recombinanthumanfibroblastgrowthfactor16，rhfgf16)蛋白，但是現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵表達(dá)rhfgf16蛋白的表達(dá)量、純度以及生物學(xué)活性低，難以滿足規(guī)?；瘧?yīng)用及基礎(chǔ)研究需求。

因此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種編碼人成纖維細(xì)胞生長因子-16的核苷酸序列，本發(fā)明的第二個目的在于提供包含所述核苷酸序列的重組表達(dá)載體，本發(fā)明的第三個目的在于提供包含所述重組表達(dá)載體的重組菌株，本發(fā)明的第四個目的在于提供重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白的生產(chǎn)方法，本發(fā)明的第五個目的在于提供按照所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)得到的重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白，本發(fā)明的第六個目的在于提供重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白生物學(xué)活性的測定方法，本發(fā)明的第七個目的在于提供重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白的應(yīng)用，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白表達(dá)量、純度以及生物學(xué)活性低的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種編碼人成纖維細(xì)胞生長因子-16的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如seqidno.1所示的序列。

另外，本發(fā)明還提供了包含所述的核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體源始于pet3a、pet3b、pet3c或pet3d，優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體源始于pet3d。

另外，本發(fā)明還提供了包含所述的重組表達(dá)載體的重組菌株，所述重組菌株源始于大腸桿菌bl21、rosetta或c41，優(yōu)選的，所述重組菌株源始于bl21(de3)plyss。

另外，本發(fā)明還提供了重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白的生產(chǎn)方法，所述生產(chǎn)方法包括：將所述的核苷酸序列構(gòu)建重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，得到重組菌株，培養(yǎng)所述重組菌株，并用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到蛋白粗品，對所述蛋白粗品進(jìn)行純化處理，得到重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白精品。

進(jìn)一步的，所述用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)包括：

在所述重組菌株的對數(shù)生長中期，加入iptg作為誘導(dǎo)劑至終濃度為0.5mm，在ph7.0～7.2條件下，37℃培養(yǎng)4h～5h，得到包涵體形式的蛋白粗品；

或，在所述重組菌的對數(shù)生長中期，加入iptg作為誘導(dǎo)劑至終濃度為0.2mm或加入乳糖作為誘導(dǎo)劑保持終濃度為10g/l左右，16℃～20℃培養(yǎng)20h～24h，得到可溶性形式的蛋白粗品。

進(jìn)一步的，

所述包涵體形式的蛋白粗品的純化處理方法包括：

將變性后的所述蛋白粗品進(jìn)行復(fù)性后經(jīng)過cm或sp離子交換、再經(jīng)肝素柱層析得到所述重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白精品；

或，將變性后的所述蛋白粗品經(jīng)過cm或sp離子交換，進(jìn)行復(fù)性后再經(jīng)肝素柱層析得到所述重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白精品；

或，將變性后的所述蛋白粗品經(jīng)cm或sp離子交換進(jìn)行柱上復(fù)性、純化，再經(jīng)肝素柱層析得到所述重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白精品；

所述變性的方法包括：用變性緩沖液對所述蛋白粗品進(jìn)行處理，使所述蛋白樣品變性、溶解。

進(jìn)一步的，

所述可溶性形式的蛋白粗品的純化處理方法包括：

將菌體破碎后的上清用cm或sp離子交換、再經(jīng)肝素柱層析得到所述重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白精品。

另外，本發(fā)明還提供了所述的生產(chǎn)方法生產(chǎn)得到的重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白。

另外，本發(fā)明還提供了一種重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白生物學(xué)活性的測定方法，所述測定方法包括：以nih3t3、h460或者h(yuǎn)9c2細(xì)胞株為靶細(xì)胞株，結(jié)合mtt法檢測所述的重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白對靶細(xì)胞株的促增殖能力。

另外，本發(fā)明還提供了所述的重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白在下述i～vii任意一種中的應(yīng)用：

i、促進(jìn)心肌損傷修復(fù)；

ii、燒燙傷；

iii、組織損傷修復(fù)；

iv、生物美容；

v、制備肺癌檢測試劑盒，或其抗體制備治療肺癌的藥物；

vi、制備卵巢癌檢測試劑盒，或其抗體制備治療卵巢癌的藥物。

本發(fā)明通過對人成纖維細(xì)胞生長因子-16基因進(jìn)行優(yōu)化及適宜的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的組合，獲得高效穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株；通過建立高密度培養(yǎng)方法，可使重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16蛋白的表達(dá)水平達(dá)到菌體總蛋白的30％以上。通過溫度、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑及添加方式的優(yōu)化，增加可溶性表達(dá)蛋白的含量，并建立了可溶性蛋白和包涵體形式表達(dá)蛋白的純化方法。另外，本發(fā)明還建立了用nih3t3、h460及h9c2細(xì)胞株進(jìn)行rhfgf16蛋白促增殖作用活性的測定方法。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為優(yōu)化前后人fgf16核苷酸序列對比圖；

圖2為pet3d-hfgf16重組表達(dá)載體示意圖；

圖3為pet3d-hfgf16重組載體的酶切鑒定電泳圖；

圖4a為rhfgf16蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的westernblot鑒定圖；

圖4b為rhfgf16蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的sds-page圖；

圖5為不同發(fā)酵條件下rhfgf16蛋白的可溶性分析sds-page圖；

圖6為16℃可溶性表達(dá)rhfgf16蛋白純化后的sds-page圖；

圖7a為37℃包涵體表達(dá)rhfgf16蛋白陽離子柱層析純化后的sds-page圖；

圖7b為37℃包涵體表達(dá)rhfgf16蛋白肝素親和柱層析純化后的sds-page圖；

圖8為mtt法測定rhfgf16蛋白對nih3t3細(xì)胞的促增殖生物學(xué)活性；

圖9為mtt法測定rhfgf16蛋白對h460細(xì)胞的促增殖生物學(xué)活性；

圖10為mtt法測定rhfgf16蛋白對h9c2心肌細(xì)胞的促增殖生物學(xué)活性；

圖11a為rhfgf16蛋白對erk,p38,akt的磷酸化作用圖；

圖11b為不同濃度rhfgf16蛋白下erk蛋白表達(dá)量組別間的差異圖；

圖11c為不同濃度rhfgf16蛋白下p38蛋白表達(dá)量組別間的差異圖；

圖11d為不同濃度rhfgf16蛋白下akt蛋白表達(dá)量組別間的差異圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明中涉及的rhfgf16為重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16(recombinanthumanfibroblastgrowthfactor16，rhfgf16)，涉及的hfgf16為人成纖維細(xì)胞生長因子-16(humanfibroblastgrowthfactor16，hfgf16)，涉及的fgf16為成纖維細(xì)胞生長因子-16(fibroblastgrowthfactor16，fgf16)。

本發(fā)明提供了編碼hfgf16的核苷酸序列，編碼hfgf16的核苷酸序列包含seqidno.1所示的序列。本發(fā)明提供的編碼hfgf16的核苷酸序列可包括：僅seqidno.1所示的序列，或者在seqidno.1所示的序列的5’端或者3’端添加起始密碼子、終止密碼子、蛋白純化標(biāo)簽或者酶切位點(diǎn)等序列得到的核苷酸序列。即，編碼hfgf16的核苷酸序列可能不僅包含seqidno.1所示的序列，還可能包含其他的功能性核苷酸序列。

另外，本發(fā)明還提供了包含編碼hfgf16的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體的制備方法包括，通過在seqidno.1所示的序列的5’端與3’端分別添加起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點(diǎn)等操作，然后將編碼hfgf16的核苷酸序列連接到表達(dá)載體上，得到重組表達(dá)載體。此處涉及的表達(dá)載體，表示尚不包含seqidno.1所示序列的載體。其中，表達(dá)載體可以是pet3a、pet3b、pet3c或pet3d。相對得到的重組表達(dá)載體可以表示為pet3a-hfgf16、pet3b-hfgf16、pet3c-hfgf16或pet3d-hfgf16。

另外，本發(fā)明還提供了包含上述重組表達(dá)載體的重組菌株。重組菌株通過將上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中制備而成。宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌，發(fā)明人對多種大腸桿菌的菌株進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21菌株、c41菌株或者rosetta菌株時，得到的重組表達(dá)菌株有較好的rhfgf16蛋白表達(dá)量。其中，尤以將重組表達(dá)載體pet3d-hfgf16轉(zhuǎn)入到表達(dá)宿主bl21(de3)plyss中，獲得的重組表達(dá)菌株pet3d-hfgf16/bl21(de3)plyss的rhfgf16蛋白表達(dá)量最高。

另外，本發(fā)明還提供了rhfgf16蛋白的生產(chǎn)方法、rhfgf16蛋白的活性檢測方法以及rhfgf16蛋白的應(yīng)用。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明，現(xiàn)通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的介紹。如未明確指出，以下實(shí)施例中涉及的實(shí)驗(yàn)操作方法為常用的分子生物學(xué)操作方法，涉及的試劑、儀器為常規(guī)的市售試劑或者儀器。

實(shí)施例1rhfgf16蛋白高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建

根據(jù)genbank中公布的人fgf16天然序列(seqidno.2)(登錄號：nm-003868)和氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的條件下，得到優(yōu)化后的編碼hfgf16蛋白的核苷酸序列(seqidno.1)。(如圖1所示為優(yōu)化前的天然序列和優(yōu)化后序列的比較圖，其中optimized表示優(yōu)化后，original表示優(yōu)化前的原始序列，標(biāo)有下劃線的表示氨基酸所對應(yīng)的優(yōu)化后的三聯(lián)密碼子)

在hfgf16優(yōu)選序列(seqidno.1)的5’端與3’端分別加起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點(diǎn)ncoi和bamhi，再用ncoi和bamhi雙酶切分別處理合成于克隆載體上的hfgf16基因和表達(dá)載體pet-3d，37℃酶切3h～4h后回收相應(yīng)的片段，用t4dna連接酶16℃連接過夜，構(gòu)建重組表達(dá)載體(見圖2)。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21(de3)plyss，在含有載體抗性的的lb平板上挑選陽性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定，證實(shí)表達(dá)序列已正確插入載體中(見圖3。其中，m1:dnamarkerdl15,000；m2:dnamarkerdl2,000；1:pet3d質(zhì)粒；2:pet3d載體雙酶切片段；3:pet3d-hfgf16雙酶切片段；4,5:puc57-hfgf16雙酶切片段；6:puc57-hfgf16重組質(zhì)粒)。委托基因測序公司進(jìn)行正向、反向序列分析測定，證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，誘導(dǎo)后測定目的蛋白表達(dá)量占總蛋白30％左右，并進(jìn)行免疫印跡(westernblot)檢測呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，證實(shí)所表達(dá)的重組外源蛋白為rhfgf16(見圖4a和圖4b，其中，m:marker；1:誘導(dǎo)前；2,3:不同單菌落誘導(dǎo)后rhfgf16蛋白表達(dá))。進(jìn)一步，將pet3d載體構(gòu)建的重組子轉(zhuǎn)入bl21(de3)plyss及bl21(de3)、rosetta(de3)plyss及rosetta(de3)、c41表達(dá)菌株中，測定目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果分別為32.1％、28.8％、15.2％、15.9％、20.3％。表明，pet3d-hfgf16/bl21(de3)plyss重組表達(dá)菌株中目的蛋白表達(dá)量優(yōu)于其他表達(dá)宿主的組。

實(shí)施例2rhfgf16蛋白高密度培養(yǎng)方法的建立

在本發(fā)明中，工程菌表達(dá)rhfgf16蛋白的發(fā)酵條件沒有特別限制?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。通常，工程菌培養(yǎng)基以胰蛋白胨、酵母粉、銨鹽等為氮源，葡萄糖、甘油等為碳源，磷酸鹽為緩沖體系、無機(jī)鹽、生長因子及微量元素組成，誘導(dǎo)劑可以是iptg或乳糖。具體為：將rhfgf16工程菌株以1:50～100(v：v)接種至lb培養(yǎng)基中進(jìn)行活化制備一代種子，以溫度37℃、轉(zhuǎn)數(shù)180rpm～200rpm，振蕩培養(yǎng)至a600達(dá)到0.6～0.8左右，按1:10～20(v：v)的比例接種至含有磷酸鹽緩沖對的lb培養(yǎng)基中擴(kuò)增制備二代種子，以溫度37℃、轉(zhuǎn)數(shù)180rpm～200rpm，振蕩培養(yǎng)至a600達(dá)到3～5左右，按1:10～20(v:v)的比例接種至包含罐內(nèi)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并加入無機(jī)鹽、生長因子及微量元素，以溫度37℃、ph值6.8～7.0，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量以及流加碳源保持do>30％，至a600達(dá)到20～25時加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。各階段培養(yǎng)基組成見表1。

誘導(dǎo)后的培養(yǎng)按最終所需蛋白是包涵體形式還是可溶性形式表達(dá)要求，采用不同的控制方式。包涵體形式表達(dá)方式為，a600達(dá)到20～25時，加入iptg至終濃度為0.5mm，誘導(dǎo)后溫度控制在35℃～37℃、ph值7.0～7.2并通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量以及流加碳源、氮源及磷酸鹽緩沖溶液保持do>25％，誘導(dǎo)4h～6h?？扇苄孕问奖磉_(dá)方式為，a600達(dá)到20～25時，將罐溫度降至16℃～20℃，加入iptg至終濃度為0.2mm或加入乳糖作為誘導(dǎo)劑維持終濃度為10g/l，ph值7.0～7.2并通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量以及流加碳源、氮源及磷酸鹽緩沖溶液保持do>25％，誘導(dǎo)20h～24h。發(fā)酵結(jié)束后，低溫高速離心，菌體-20℃以下凍存。發(fā)酵全過程中間隔取樣測a600值，并在誘導(dǎo)前進(jìn)行鏡檢；誘導(dǎo)后留樣進(jìn)行sds-page檢測。(見圖5，其中，m：marker；1：37℃表達(dá)細(xì)胞破碎離心后上清；2：37℃表達(dá)細(xì)胞破碎離心后沉淀；3：16℃表達(dá)細(xì)胞破碎離心后上清；2：16℃表達(dá)細(xì)胞破碎離心后沉淀)

表1各階段培養(yǎng)基組成

實(shí)施例3rhfgf16蛋白純化方法的建立

1、菌體破碎

將菌體以1:20～40(g:ml)比例充分懸浮于細(xì)胞裂解緩沖液(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mmnacl,1％tritonx-100,1mmpmsf,5mmdtt,ph8.0)中，以高壓均質(zhì)方式破碎細(xì)胞。具體操作為，200bar～300bar循環(huán)1次充分混勻，再以800bar～850bar均質(zhì)1～2次，鏡檢在可見視野范圍內(nèi)無完整大腸桿菌后，低溫高速離心。

2、按蛋白可溶性形式和包涵體形式表達(dá)采用不同純化方式。

2.1可溶性表達(dá)蛋白純化

高壓均質(zhì)后的溶液低溫高速離心，棄沉淀、取上清。上清亦可采用中空纖維超濾裝置去除小分子量雜質(zhì)或大分子量雜質(zhì)，所采用的截留分子量為10kd或50kd。

純化—陽離子交換：

層析介質(zhì)：cm或sp或其他型號陽離子交換填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

再生液：20mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將離心后或超濾后可溶性蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫1：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白。

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

純化—肝素親和層析：

層析介質(zhì)：heparinsepharose親和層析填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,1.2mnacl,ph7.5

再生液：25mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將離子交換柱層析收集的rhfgf16蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫1：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白。

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

樣品經(jīng)過此兩步純化，即陽離子交換、親和層析，純度提高至95％以上(見圖6，其中，m：marker；1：可溶蛋白上清；2：陽離子上樣穿出；3：陽離子0.3mnacl洗脫峰；4：陽離子0.6mnacl洗脫峰；5：肝素上樣穿出；6：肝素1.2mnacl洗脫峰)。

2.2包涵體表達(dá)蛋白純化

2.2.1包涵體清洗：

高壓均質(zhì)后的溶液低溫高速離心，棄上清、取沉淀。沉淀加入10～20倍量(g：ml)清洗緩沖液1(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,1％tritonx-100,0.5％去氧膽酸鈉,ph7.5)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈?h后，高速離心，4℃，30min，棄上清，收集沉淀。再加入10～20倍量(g：ml)清洗緩沖液2(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,1％tritonx-100,ph7.5)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈?h后，高速離心，4℃，30min，棄上清，收集沉淀。再加入10～20倍量(g：ml)清洗緩沖液3(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,1％tritonx-100,2m脲，ph7.5)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈?h后，高速離心，4℃，30min，棄上清，收集沉淀即為包涵體。

2.2.2包涵體變性

稱取適量包涵體，加入10～20倍量(g：ml)變性緩沖液(25mmtris，2mmedta-2na,0.15mnacl，5mmdtt,8m～9m脲，ph7.5)溶解包涵體。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，在磁力攪拌條件下4℃溶解15h以上，離心，20000rpm，4℃，30min，去除未溶物，得到包涵體變性溶液。

2.2.3包涵體純化

方法1：復(fù)性后純化

復(fù)性：

(1)稀釋復(fù)性

取包涵體變性溶液，在4℃磁力攪拌條件下，緩慢滴入10～40倍量(v:v)復(fù)性緩沖液(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,0.5％tritonx-100,ph7.5)，復(fù)性緩沖液中還可添加氧化/還原型谷胱甘肽、dtt、精氨酸、甘油等，復(fù)性過程控制16h以上。復(fù)性完畢，離心去除沉淀或采用中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離，所采用的截留分子量為10kd或50kd。

(2)透析復(fù)性

取包涵體變性溶液，裝入截留分子量為10kd的透析袋中，在4℃磁力攪拌條件下，依次放入30～50倍量(v:v)透析緩沖液1(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,0.5％tritonx-100,5mmdtt,4m脲ph7.5)、復(fù)性緩沖液2(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,0.5％tritonx-100,5mmdtt,2m脲ph7.5)、復(fù)性緩沖液3(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,0.5％tritonx-100,5mmdtt,1m脲ph7.5)、復(fù)性緩沖液4(25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,ph7.5)中，透析液中還可添加氧化/還原型谷胱甘肽、精氨酸、甘油等，8h～12h小時更換復(fù)性液。復(fù)性完畢，離心去除沉淀或采用中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離，所采用的截留分子量為10kd或50kd。

純化—陽離子交換：

層析介質(zhì)：cm或sp或其他型號陽離子交換填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

再生液：20mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將離心后或超濾后的復(fù)性蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫1：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白.

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

純化—肝素親和層析：

層析介質(zhì)：heparinsepharose親和層析填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,1.2mnacl,ph7.5

再生液：25mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將離子交換柱層析收集的rhfgf16蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫1：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白。

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

樣品經(jīng)過此兩步純化，即陽離子交換、親和層析，純度提高至95％以上(見圖7a和圖7b。其中圖7a中，m:marker；1:稀釋復(fù)性后上清；2:陽離子0.6mmnacl洗脫峰。其中圖7b中，m:marker；1:肝素上樣穿出；2:肝素1.2mnacl洗脫)。

方法2：純化后復(fù)性

純化—陽離子交換：

層析介質(zhì)：cm或sp或其他型號陽離子交換填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,8m脲,0.15mnacl,ph7.5

洗脫液：25mmtris,2mmedta-2na,8m脲,0.3mnacl,ph7.3

再生液：25mmtris,2mmedta-2na,8m脲,2.0mnacl,ph7.3

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將變性后的蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用不含脲的平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

復(fù)性：

將陽離子交換收集的rhfgf16蛋白溶液進(jìn)行復(fù)性，具體方法同上(稀釋復(fù)性或透析復(fù)性)

純化—肝素親和層析：

層析介質(zhì)：heparinsepharose親和層析填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,1.2mnacl,ph7.5

再生液：25mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將復(fù)性的離子交換柱層析收集的rhfgf16蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫1：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白。

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

方法3：柱上復(fù)性

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,8m脲，ph7.5

復(fù)性液：25mmtris,2mmedta-2na,0.15mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

再生液：25mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：cm或sp或其他型號陽離子層析柱用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將變性后的蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

柱上復(fù)性：設(shè)置a泵為含8m脲平衡液，梯度從100％至0％；設(shè)置b泵為復(fù)性液，梯度從0％至100％，經(jīng)溶液混合器后進(jìn)入離子交換柱，此梯度變化過程16h以上。

洗脫1：復(fù)性完成后，用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白。

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用不含脲的平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

肝素親和層析：

層析介質(zhì)：heparinsepharose親和層析填料

緩沖溶液：

平衡液：25mmtris,2mmedta-2na,0.3mnacl,ph7.5

洗脫液1：25mmtris,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.5

洗脫液2：25mmtris,2mmedta-2na,1.2mnacl,ph7.5

再生液：25mmtris,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.5

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

上樣：將離子交換柱層析收集的rhfgf16蛋白溶液上樣。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，至基線穩(wěn)定。

洗脫1：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，去除雜蛋白。

洗脫2：用3～5個柱體積洗脫液清洗層析柱，收取蛋白峰，測定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測其純度。

再生：清洗后用3～5個柱體積的再生液沖洗層析柱。

平衡：用平衡液平衡3～5個柱體積，待用。

實(shí)施例4rhfgf16蛋白細(xì)胞活性檢測方法建立

基因工程重組蛋白的生物學(xué)活性是反映藥物質(zhì)量及功效的重要指標(biāo)，因此建立穩(wěn)定、靈敏的活性測定方法對于產(chǎn)品的生產(chǎn)及質(zhì)量檢測具有重要意義。本發(fā)明根據(jù)rhfgf16蛋白特異性促進(jìn)上皮和間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的功能，采用細(xì)胞增殖法，選擇小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(nih3t3細(xì)胞)為靶細(xì)胞，結(jié)合mtt比色法檢測蛋白體外生物學(xué)活性；根據(jù)rhfgf16蛋白在心肌中高表達(dá)的特性，采用細(xì)胞增殖法，選擇大鼠心肌細(xì)胞(h9c2細(xì)胞)為靶細(xì)胞，結(jié)合mtt比色法檢測蛋白體外生物學(xué)活性；根據(jù)試驗(yàn)中rhfgf16蛋白能顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的特性，選擇人肺癌細(xì)胞(h460細(xì)胞)為靶細(xì)胞，結(jié)合mtt比色法檢測蛋白體外生物學(xué)活的方法。其包括如下步驟：

4.1細(xì)胞傳代培養(yǎng)

維持培養(yǎng)液：含10％(v/v)胎牛血清(fbs)、1％(v/v)雙抗(青霉素-鏈霉素)的dmem。

用維持培養(yǎng)液分別培養(yǎng)上述三種細(xì)胞。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化計(jì)數(shù)后，按8×10³～1×10⁴/孔的細(xì)胞鋪板到96孔板，每孔加入100μl維持培養(yǎng)液，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4.2饑餓培養(yǎng)

用含0.5％fbs(其余成分同維持培養(yǎng)液)的饑餓培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

4.3mtt試驗(yàn)

加入不同濃度的rhfgf16蛋白到96孔板中，設(shè)置陰性對照孔或陽性對照孔。加入后繼續(xù)培養(yǎng)48h后每孔加入25μl的mtt(5mg/ml)，再培養(yǎng)4h，吸掉孔中的液體，每孔加入150μldmso，震蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀以630nm為參比波長，在波長570nm測定吸光度，記錄測定結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)表明，純化的rhfgf16蛋白在8ng/ml～128ng/ml濃度時，對nih3t3細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，并呈線性相關(guān)；10ng/ml～100ng/ml濃度時，對h9c2細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，并呈線性相關(guān)。10.0ng/ml～100ng/ml濃度時，對h460細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，并呈線性相關(guān)。(見圖8、圖9和圖10)。

rhfgf16蛋白對h9c2細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，基于這一原理，rhfgf16蛋白能夠用于制備促進(jìn)心肌損傷修復(fù)的藥物。nih3t3細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)，rhfgf16蛋白對nih3t3細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，基于這一原理，rhfgf16蛋白能夠用于制備治療燒燙傷、促進(jìn)組織損傷修復(fù)的藥物以及制備用于生物美容的產(chǎn)品等。

另外，rhfgf16蛋白還能夠作為標(biāo)記物，判斷是否患有肺癌或者卵巢癌。而且，rhfgf16蛋白能夠作為治療靶點(diǎn)，通過降低rhfgf16蛋白的含量，來實(shí)現(xiàn)治療肺癌或者卵巢癌的目的。例如，以rhfgf16蛋白的抗體作為治療藥物，rhfgf16蛋白抗體與rhfgf16蛋白結(jié)合后，能夠降低體內(nèi)rhfgf16蛋白的含量，從而減少rhfgf16蛋白對癌細(xì)胞的促增殖作用，從而達(dá)到治療癌癥的目的。

實(shí)施例5rhfgf16蛋白對h460細(xì)胞促增殖作用機(jī)制研究

通過蛋白質(zhì)免疫印跡(westernblot，wb)方法驗(yàn)證增殖信號通路。依次檢驗(yàn)了gsk-3β,nf-κb,erk1/2,p38,jnk以及akt蛋白在相關(guān)增殖信號通路中，在對應(yīng)rhfgf16濃度順序依次分別為0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml濃度下，對h460細(xì)胞的促增殖作用。發(fā)現(xiàn)其中erk1/2,p38,akt隨rhfgf16蛋白濃度的升高，相關(guān)蛋白的表達(dá)量明顯的增加(見圖11a、圖11b、圖11c、圖11d)，而對jnk,nf-κb以及gsk沒有磷酸化作用。進(jìn)一步的，利用mtt法檢測經(jīng)mapk以及akt信號通路抑制劑處理前后rhfgf16對h460細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明，加入抑制劑的處理組的吸光度值明顯小于沒有加入抑制劑的組別，且隨著抑制劑濃度的增加，其抑制效果愈加的明顯。試驗(yàn)結(jié)果表明，rhfgf16蛋白能激活mapk信號通路中erk和p38的磷酸化作用以及akt的磷酸化作用進(jìn)而促進(jìn)h460細(xì)胞的增殖。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>溫州醫(yī)科大學(xué)李校堃

<120>重組人成纖維細(xì)胞生長因子-16的克隆、表達(dá)和應(yīng)用及其生物學(xué)活性的測定

方法

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>624

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggccgaagtgggtggcgtgtttgccagcctggactgggatctgcatggttttagcagc60

agcctgggcaatgttccgctggcagatagcccgggctttttaaacgaacgcctgggccag120

atcgaaggtaaactgcagcgcggcagtccgaccgatttcgcacacctgaagggtattctg180

cgtcgccgccagctgtattgtcgcaccggctttcacctggagatctttccgaacggtacc240

gttcatggcacccgtcatgatcatagccgcttcggcatcctggaatttatcagcctggcc300

gtgggcctgattagcatccgtggtgtggatagcggtctgtatctgggcatgaatgagcgc360

ggtgaactgtatggcagcaagaaactgacccgcgaatgtgtgttccgcgaacagttcgag420

gagaattggtacaacacctacgccagcaccctgtacaagcatagcgatagcgagcgccag480

tattacgttgccctgaataaggacggcagtccgcgtgaaggttaccgcaccaaacgccac540

cagaagttcacccactttctgccgcgtccggttgatcctagcaaactgccgagcatgagc600

cgcgatctgttccattatcgctaa624

<210>2

<211>624

<212>dna

<213>人

<400>2

atggcagaggtggggggcgtcttcgcctccttggactgggatctacacggcttctcctcg60

tctctggggaacgtgcccttagctgactccccaggtttcctgaacgagcgcctgggccaa120

atcgaggggaagctgcagcgtggctcacccacagacttcgcccacctaaaggggatcctg180

cggcgccgccagctctactgccgcaccggcttccacctggagatcttccccaacggcacg240

gtgcacgggacccgccacgaccacagccgcttcggaatcctggagtttatcagcctggct300

gtggggctgatcagcatccggggagtggactctggcctgtacctaggaatgaatgagcga360

ggagaactctatgggtcgaagaaactcacacgtgaatgtgttttccgggaacagtttgaa420

gaaaactggtacaacacctatgcctcaaccttgtacaaacattcggactcagagagacag480

tattacgtggccctgaacaaagatggctcaccccgggagggatacaggactaaacgacac540

cagaaattcactcactttttacccaggcctgtagatccttctaagttgccctccatgtcc600

agagacctctttcactataggtaa624