本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于番茄的干旱和/或高鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p及其應(yīng)用，該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在干旱和/或高鹽脅迫條件下在植物中表達(dá)。
背景技術(shù)：
：我國(guó)是世界三大番茄種植區(qū)域之一，出口占世界貿(mào)易量30％，而我國(guó)的番茄種植地主要分布在新疆、內(nèi)蒙古和甘肅(馬貞，2013)。近年來(lái)由于該類(lèi)地區(qū)生態(tài)環(huán)境日益惡化和極端天氣頻發(fā)，如干旱、高溫、土地鹽堿化和沙漠化等逆境脅迫，嚴(yán)重影響了番茄的種植與生產(chǎn)，進(jìn)而給番茄生產(chǎn)造成了重大損失(李景富，2011)。因此，培育和推廣抗逆品種是保證番茄穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的有效途。利用植物自身的抗逆基因,通過(guò)常規(guī)育種和分子標(biāo)記輔助育種方法可以培育抗逆新品種，然而，抗性基因在種屬間的利用具有一定的局限性，比如說(shuō)水稻的抗逆基因就不能在番茄中應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)的出現(xiàn)克服上述局限，為作物抗逆育種開(kāi)辟一條新途徑。植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件。它是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段dna序列，能活化rna聚合酶，使之與模板dna準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心，根據(jù)基因的表達(dá)情況，可將啟動(dòng)子分為兩類(lèi)：組成型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能在所有細(xì)胞、任何時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；特異性啟動(dòng)子又可分為組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子平時(shí)不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性很低，但在某些特定的逆境信號(hào)刺激下,轉(zhuǎn)錄活性能夠顯著地提高。在轉(zhuǎn)基因植物中,組成型啟動(dòng)子持續(xù)過(guò)量地表達(dá)轉(zhuǎn)化的外源基因會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)并且減少其產(chǎn)量(kasugaetal,1999；karabaetal,2007)，因?yàn)橥庠椿虻倪^(guò)量表達(dá)往往會(huì)競(jìng)爭(zhēng)植物在正常生長(zhǎng)條件下需要的能量并且阻礙蛋白質(zhì)或者rna的合成(raietal.,2009)。因此，培育抗逆作物新品種最好使用逆境誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子，使外源基因只在脅迫的情況下才大量表達(dá)，這樣不僅會(huì)獲得目的產(chǎn)物、達(dá)到預(yù)定目標(biāo),而且也不會(huì)產(chǎn)生副作用。目前能應(yīng)用于番茄轉(zhuǎn)基因抗逆研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少，對(duì)于新的相關(guān)逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)、克隆、順勢(shì)作用元件分析仍然是今后研究的重點(diǎn)，將功能明確且高效的逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子成功應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控抗逆基因的表達(dá)是植物抗逆基因工程的研究方向。目前研究表明，wrky家族中逆境相關(guān)基因往往對(duì)多種逆境脅迫響應(yīng)，這大部分是由于該類(lèi)基因啟動(dòng)子上含有多種逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件(eulgemetal.,2007)。我們?cè)诜阎械难芯堪l(fā)現(xiàn)，番茄中存在81個(gè)slwrky基因，并通過(guò)基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析鑒定出了其中的27個(gè)slwrky基因分別受到6種不同的生物逆境(病原菌)和非生物逆境(干旱、高鹽)的誘導(dǎo)表達(dá)(huangetal.,2012)。因此通過(guò)對(duì)上述逆境相關(guān)的wrky家族基因啟動(dòng)子的研究可以得到多種與脅迫相關(guān)的關(guān)鍵dna片段和順式作用元件，對(duì)構(gòu)建有效的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有重要意義。為此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來(lái)源于番茄的干旱和/或高鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子slwrky8p，在植物基因工程改造中具有良好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1.馬貞.新疆番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展問(wèn)題研究.吉林大學(xué),20132.李景富.中國(guó)番茄育種學(xué).中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,20113.kasugam,liuq,miuras,etal.improvingplantdrought,salt,andfreezingtolerancebygenetransferofasinglestress-inducibletranscriptionfactor.[j].naturebiotechnology,1999,17(3):287.4.karabaa,dixits,grecor,etal.improvementofwateruseefficiencyinricebyexpressionofhardy,anarabidopsisdroughtandsalttolerancegene.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2007,104(39):15270.5.raim,hec,wur.comparativefunctionalanalysisofthreeabioticstress-induciblepromotersintransgenicrice[j].transgenicresearch,2009,18(5):787-799.6.eulgemt,somssichie.networksofwrkytranscriptionfactorsindefensesignaling.currentopinioninplantbiology,2007,10(4):366-3717.huangs,gaoy,liuj,etal.genome-wideanalysisofwrkytranscriptionfactorsinsolanumlycopersicum.moleculargeneticsandgenomics,2012,287(6):495-513技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明目的在于：提供一種番茄干旱和/或高鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子slwrky8p及其應(yīng)用。本發(fā)明的slwrky8p對(duì)通過(guò)啟動(dòng)目的基因在干旱和/或高鹽脅迫下的高表達(dá)，來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱和/或高鹽的耐受性，具有重要意義。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)或(c)的序列：(a)具有seqidno:1所示的核苷酸序列；或(b)與a)限定的核苷酸序列具有75％以上一致性，且具有啟動(dòng)子功能的dna分子；或(c)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的dna分子。一種包含所述dna分子的表達(dá)盒。一種包含所述表達(dá)盒的重組載體，所述重組載體優(yōu)選為pbi121k-slwrky8p。所述重組載體為雙元載體、共合載體。一種包含所述重組載體的重組微生物。一種包含所述重組載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述重組微生物優(yōu)選為大腸桿菌或根癌農(nóng)桿菌eha105。一種引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增上述誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所述引物對(duì)為：正向引物：5’-ggtaccaaattcatttagcgttgcat-3’；反向引物：5’-ggatccctccacagccatattatagtaac-3’。一種所述誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p在植物中表達(dá)的應(yīng)用。一種所述誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p在干旱和/或高鹽誘導(dǎo)下啟動(dòng)目的基因在植物中表達(dá)的應(yīng)用。所述植物為雙子葉植物。所述雙子葉植物為番茄、擬南芥或煙草；所述目的基因優(yōu)選為耐旱、耐鹽抗逆基因。本發(fā)明還公開(kāi)了一種提取、擴(kuò)增番茄誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p的pcr方法，包括以下步驟：1)提取番茄a(bǔ)c+的基因組dna；2)以番茄a(bǔ)c+的基因組dna為模板，使用引物，利用高保真酶primestarhs，擴(kuò)增slwrky8p啟動(dòng)子；其中，擴(kuò)增總體積50μl，其中正向引物1μl，反向引物1μl，dna模板1μl，primestarhs25μl，ddh2o22μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃10秒，55℃5秒，72℃5秒，30個(gè)循環(huán)；所述引物為：正向引物：5’-ggtaccaaattcatttagcgttgcat-3’；反向引物：5’-ggatccctccacagccatattatagtaac-3’。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種番茄干旱和/或高鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子slwrky8p及其應(yīng)用，本發(fā)明中的啟動(dòng)子，名稱(chēng)為slwrky8p，來(lái)源于番茄，是如下a)、b)或c)的dna分子：a)核苷酸序列是序列表seqidno.1的dna分子；b)與a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上一致性，且具有啟動(dòng)子功能的dna分子；c)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的dna分子。其中，seqidno.1由1097個(gè)核苷酸組成，具體序列如序列表seqidno.1所示。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是在2×ssc(檸檬酸鈉)，0.1％sds(十二烷基硫酸鈉)的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min；然后用0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的啟動(dòng)子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表達(dá)靶基因的啟動(dòng)子活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。同時(shí)，基于本發(fā)明的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，含有slwrky8p的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在所述表達(dá)盒中，啟動(dòng)子slwrky8p的下游連接結(jié)構(gòu)基因、或調(diào)節(jié)基因、或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因、或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小rna的編碼dna，用于驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)基因、或調(diào)節(jié)基因、或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因、或者天然小rna或人工合成的小rna的表達(dá)。所述表達(dá)盒可由所述啟動(dòng)子slwrky8p、所述啟動(dòng)子slwrky8p啟動(dòng)表達(dá)的目的基因以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述啟動(dòng)子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，目的基因具體為β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase,gus)基因。所述重組載體可為含有上述表達(dá)盒的重組載體，包括但不限于質(zhì)粒和病毒。所述重組載體也可為重組植物表達(dá)載體。所述重組植物表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_(dá)盒轉(zhuǎn)送進(jìn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達(dá)盒整合宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。所述宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代是指所有植物細(xì)胞或植物組織或植物器官或由這些細(xì)胞、組織或器官通過(guò)組織分化或無(wú)性胚再生并且發(fā)育成熟的整體植株(包括種子)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組載體具體為將pbi121k(pbi121k是由pbi121載體改造而來(lái)，參考劉繼愷等，2017)的35s啟動(dòng)子替換為所述啟動(dòng)子得到的重組載體。所述目的基因具體為β-葡萄糖苷酶基因(β-glucuronidase,gus)。所述重組表達(dá)載體可以通過(guò)使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物器官或組織或細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無(wú)性系或其后代。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。上述slwrky8p在植物中啟動(dòng)目的基因表達(dá)的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物，例如番茄、擬南芥、水稻和/或煙草。擴(kuò)增slwrky8p的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。申請(qǐng)人對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了實(shí)際驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本申請(qǐng)的干旱和/或高鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子slwrky8p在300mm甘露醇(mannitol)處理24小時(shí)的環(huán)境下啟動(dòng)的目的基因的表達(dá)量分別約為正常生長(zhǎng)情況下的2.6倍，slwrky8p在200mmnacl處理24小時(shí)的環(huán)境下啟動(dòng)的目的基因的表達(dá)量約為正常生長(zhǎng)情況下的2.7倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的slwrky8p為干旱和/或高鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，具有較好的效果。綜上，本發(fā)明的slwrky8p可作為構(gòu)建植物表達(dá)載體的元件，將其連接在目的基因之前，使目的基因的表達(dá)受干旱和/或高鹽誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明的slwrky8p對(duì)通過(guò)啟動(dòng)目的基因在干旱和/或高鹽脅迫下的高表達(dá)，來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱和/或高鹽的耐受性，具有重要意義。附圖說(shuō)明圖1為slwrky8p啟動(dòng)子的pcr擴(kuò)增電泳圖，其中m為dl2000dnamarker；泳道1為slwrky8p啟動(dòng)子的pcr擴(kuò)增條帶。圖2為將slwrky8p啟動(dòng)子構(gòu)建于pbi121k載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖a為pbi121k示意圖；圖b為pbi121k-slwrky8p示意圖，其中示出了利用slwrky8p啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位于其下游的gus基因表達(dá)。圖3為轉(zhuǎn)pbi121k-slwrky8p的番茄幼苗分別在300mmmannitol和200mmnacl處理24小時(shí)環(huán)境下幼苗中g(shù)us的染色情況，其中圖a為正常培養(yǎng)24小時(shí)的gus染色情況；圖b為300mmmannitol處理24小時(shí)的gus染色情況；圖c為200mmnacl處理24小時(shí)的gus染色情況。圖4為轉(zhuǎn)pbi121k-slwrky8p的番茄幼苗分別在300mmmannitol和200mmnacl處理24小時(shí)環(huán)境下幼苗中g(shù)us活性的定量統(tǒng)計(jì)分析。具體實(shí)施方式本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類(lèi)似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類(lèi)似特征中的一個(gè)例子而已。以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)現(xiàn)，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1(一)干旱和/或高鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p的獲得1、植物材料番茄野生型種子為ac+，由四川大學(xué)劉永勝教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。2、載體克隆載體peasy-bluntcloningkit購(gòu)自北京全式金公司。3、試劑與藥品高保真酶primestarhs購(gòu)自takara公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自omegabio-tek公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，測(cè)序由華大基因科技股份有限公司完成。緩沖液、試劑、細(xì)菌培養(yǎng)基配方參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，作者：著[美]j.莎姆布魯克、黃培堂譯，出版社：科學(xué)出版社，isbn：7030103386)。4、番茄slwrky8p啟動(dòng)子的克隆根據(jù)sgn(http://solgenomics.wur.nl/)提供的番茄全基因組序列，依據(jù)番茄slwrky8基因的上游序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，正向引物中含有kpni識(shí)別序列，反向引物中含有bamhi識(shí)別序列：正向：5’-ggtaccaaattcatttagcgttgcat-3’；反向：5’-ggatccctccacagccatattatagtaac-3’。用上述引物以番茄a(bǔ)c+的基因組dna為模板，利用高保真酶primestarhs，擴(kuò)增slwrky8p啟動(dòng)子。擴(kuò)增總體積50μl，其中正向引物1μl，反向引物1μl，dna模板1μl，primestarhs25μl，ddh2o22μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃10秒，55℃5秒，72℃5秒，30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后膠回收與目的啟動(dòng)子大小相近的片段。連接克隆載體peasy-blunt。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37℃恒溫培養(yǎng)16-18小時(shí)。挑取大腸桿菌單克隆，接種含有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，置于37℃，150轉(zhuǎn)/每分鐘的搖床中擴(kuò)大培養(yǎng)16-18小時(shí)。將擴(kuò)大培養(yǎng)的大腸桿菌送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的克隆用以構(gòu)建表達(dá)載體。5、膠回收所用bindingbuffer(xp2)、spwbuffer和elutionbuffer全部來(lái)自于omegabio-tek公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒。(1)在紫外燈下切下含有目的dna的瓊脂糖凝膠，置于1.5ml的離心管中。(2)在離心管中加入與切下的凝膠塊等體積的bindingbuffer(xp2)?；旌暇鶆蚝笥?5-60℃中放置約7分鐘，期間不斷晃動(dòng)(每2-3分鐘一次)，直至凝膠塊完全融化。(3)將dna吸附管置于2ml離心管中(試劑盒內(nèi)提供)，將上一步完全融化的凝膠液加入到dna吸附管中，8000-10000×g室溫離心1分鐘，棄濾液。(4)將dna吸附管重新置回2ml離心管中，加入300μl的bindingbuffer(xp2)，10000×g室溫離心1分鐘，棄濾液。(5)將dna吸附管重新置回2ml離心管中，加入700μl的spwbuffer，靜置2-3分鐘，10000×g室溫離心1分鐘，棄濾液。(6)將dna吸附管重新置回2ml離心管中，10000×g室溫離心1分鐘。(7)將dna吸附管置于1.5ml離心管中，在吸附管的膜中央加入30-50μl的elutionbuffer，室溫靜置1分鐘。10000×g室溫離心1分鐘洗脫dna片段。經(jīng)測(cè)序，所得膠回收片段的核苷酸序列如序列seqidno.1所示。6、與克隆載體的連接在200μl離心管中依次加入：膠回收dna片段4μl，peasy-bluntcloningvector1μl，輕輕混合，室溫反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上，用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化。7、大腸桿菌轉(zhuǎn)化(1)加連接產(chǎn)物于50μltrans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中(peasy-bluntcloning試劑盒提供)，輕彈混勻，冰浴20-30分鐘。(2)42℃熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。(3)加250μl平衡至室溫的soc/lb，200轉(zhuǎn)每分鐘，37℃孵育1小時(shí)。將菌液于4000轉(zhuǎn)每分鐘離心1分鐘，棄掉部分上清，保留100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。(二)重組表達(dá)載體pbi121k-slwrky8p的構(gòu)建1、菌株及載體大腸桿菌dh5ɑ、根癌農(nóng)桿菌eha105、表達(dá)載體pbi121k均由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生物技術(shù)系保存。2、試劑與藥品限制性內(nèi)切酶購(gòu)自thermo公司，taq酶購(gòu)自tiangen公司，t4dna連接酶購(gòu)自promega公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒及小批量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自omegabio-tek公司。測(cè)序由華大基因科技股份有限公司完成。緩沖液、試劑、細(xì)菌培養(yǎng)基配方、大腸桿菌感受態(tài)制備參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，作者：著[美]j.莎姆布魯克、黃培堂譯，出版社：科學(xué)出版社，isbn：7030103386)。3、質(zhì)粒提取將測(cè)序正確的含有啟動(dòng)子的peasy-blunt-slwrky8p克隆以及pbi121k大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。所用溶液i、溶液ii、溶液iii、bufferhb、washbuffer和elutionbuffer全部來(lái)自于omegabio-tek公司的小批量質(zhì)粒提取試劑盒。(1)在10-20ml試管中，將攜帶有所需質(zhì)粒的大腸桿菌接種到5ml含有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。(2)取1.5-5ml菌液室溫10000×g離心1分鐘。(3)去上清，加250μl溶液i，渦旋震蕩器震蕩至菌體完全懸浮。(4)加入250μl溶液ii，溫和顛倒離心管4-6次，獲得澄清的裂解液，室溫孵育2分鐘。(5)加入350μl溶液iii，溫和顛倒數(shù)次混合，至出現(xiàn)白色絮狀沉淀。(6)室溫13000×g離心10分鐘。(7)小心吸取上清，移至潔凈的裝配好容積2ml離心管的吸收柱中。室溫10000×g離心1分鐘。(8)棄濾液，加500μlbufferhb，10000×g離心1分鐘。(9)棄濾液，用700μlwashbuffer清洗吸收柱，10000×g離心1分鐘。(10)重復(fù)第(9)步。(11)將吸收柱重新置回2ml離心管中，13000×g離心2分鐘。將吸收柱放入干凈的1.5ml離心管，在吸附柱的膜中央加30-50μlelutionbuffer，13000×g離心1分鐘。4、slwrky8p片段和pbi121k載體的酶切和膠回收對(duì)提取的peasy-blunt-slwrky8p和pbi121k質(zhì)粒同時(shí)用kpni和bamhi進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下表1所示，反應(yīng)條件為37℃酶切2小時(shí)。將酶切后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收slwrky8p啟動(dòng)子片段和pbi121k載體片段。表1反應(yīng)體系加入的試劑pesay-blunt-slwrky8ppbi121k10×buffer55質(zhì)粒1043kpni11bamhi11ddh2o330總體積50505、slwrky8p片段和pbi121k載體的連接用t4dna連接酶連接slwrky8p啟動(dòng)子片段和pbi121k載體片段，反應(yīng)體系為：10×t4ligasebuffer1μl，slwrky8p啟動(dòng)子片段5μl，pbi121k載體片段3μl，t4ligase1μl。反應(yīng)條件為：4℃冰箱過(guò)夜連接16-18小時(shí)。6、大腸桿菌轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。(1)從超低溫冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。(2)將連接產(chǎn)物加入到解凍后的感受態(tài)細(xì)胞中，小心混勻，冰浴30min。(3)將含有感受態(tài)細(xì)胞的離心管置于42℃中，熱擊90秒。(4)快速將熱擊后的離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2-3分鐘。(5)向冷卻后的離心管中加入800μl的soc，混勻后置于37℃搖床中120轉(zhuǎn)每分鐘振搖培養(yǎng)1小時(shí)。(6)將菌液于4000轉(zhuǎn)每分鐘離心1分鐘，棄掉部分上清，保留100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。(7)挑取大腸桿菌單克隆進(jìn)行菌落pcr，將陽(yáng)性克隆接種含有硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，置于37℃，150轉(zhuǎn)/每分鐘的搖床中擴(kuò)大培養(yǎng)16-18小時(shí)。將擴(kuò)大培養(yǎng)的大腸桿菌送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的克隆提取質(zhì)粒后，用以轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌eha105。7、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌eha105(1)從超低溫冰箱中取出根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。(2)將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒10μl加入到解凍后的感受態(tài)細(xì)胞中，小心混勻，冰浴30min。(3)將含有感受態(tài)細(xì)胞的離心管置于液氮中，速凍1分鐘。(4)快速將速凍后的離心管轉(zhuǎn)移至37℃水浴鍋中，放置2-3分鐘。(5)向離心管中加入800μl的soc，混勻后置于28℃搖床中120轉(zhuǎn)每分鐘振搖培養(yǎng)4小時(shí)。(6)將菌液于4000轉(zhuǎn)每分鐘離心1分鐘，棄掉部分上清，保留100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，28℃培養(yǎng)2天。(7)挑取農(nóng)桿菌單克隆進(jìn)行菌落pcr。(8)挑取陽(yáng)性克隆搖菌，并用甘油保存菌液備用。實(shí)施例2利用啟動(dòng)子slwrky8p驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在番茄中表達(dá)1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化將含有pbi121k-slwrky8p質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄，具體方法如下。(1)將番茄種子滅菌后播種于含有1/2ms固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，暗培養(yǎng)4d左右，露白后轉(zhuǎn)置于光照下，培養(yǎng)條件為：25℃，16小時(shí)光照，23℃，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度為80μmolm-2s-1，并在其第一片真葉長(zhǎng)出前取下子葉，置于預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d。(2)將含有pbi121k-slwrky8p質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌接種于5ml含有50μg/ml利福平和50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)，得到5mlpbi121k-slwrky8p種子液。接種1mlpbi121k-slwrky8p種子液至50ml含有50μg/ml利福平和50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)至od600為0.8左右，得到pbi121k-slwrky8p培養(yǎng)液。將pbi121k-slwrky8p培養(yǎng)液于室溫4000轉(zhuǎn)每分鐘，離心4分鐘，棄上清收集菌體，用約10ml誘導(dǎo)培養(yǎng)液重懸菌體，備用。(3)在滅菌的培養(yǎng)皿中加入40ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用移液器吸取800μl重懸菌體加入到含有誘導(dǎo)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，混勻。將預(yù)培養(yǎng)2天后的番茄子葉浸入誘導(dǎo)培養(yǎng)液和菌體的混合物中10分鐘，期間可用無(wú)菌鑷子尖部對(duì)子葉進(jìn)行垂直打孔。將子葉撈出置于無(wú)菌濾紙上吸干液體，隨后將子葉置于共培養(yǎng)基上，于22±1℃、黑暗條件下培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上；然后，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：25℃，16小時(shí)光照，23℃，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度為80μmolm-2s-1。每2周更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)出2.0cm左右的新芽時(shí)，切取嫩芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上生根，培育約4周后獲得完整的硫酸卡那霉素抗性植株。待根系發(fā)達(dá)后轉(zhuǎn)移至盆中，在溫室內(nèi)24±1℃、16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)至番茄果實(shí)成熟，并收獲成熟的番茄種子(即t1代轉(zhuǎn)基因種子)。各培養(yǎng)基成分見(jiàn)表2。表2番茄組織所用培養(yǎng)基注：6-ba：6－芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine)，iaa：吲哚乙酸(indoleaceticacid)，kt：激動(dòng)素(kinetin)，2，4-d：2,4－二氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid)。(5)將t1代轉(zhuǎn)基因番茄種子進(jìn)行滅菌處理得到無(wú)菌t1代番茄種子。將無(wú)菌t1代番茄種子播種于含50μg/ml硫酸卡那霉素的1/2ms固體選擇培養(yǎng)上，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：25℃，16小時(shí)光照，23℃，8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度為80μmolm-2s-1。經(jīng)篩選培養(yǎng)，得到含有硫酸卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)基因番茄幼苗。將含有硫酸卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)基因番茄幼苗轉(zhuǎn)移至盆中，在溫室內(nèi)24±1℃、16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)至番茄果實(shí)成熟，并收獲成熟的番茄種子(即t2代轉(zhuǎn)基因種子)。2、干旱和高鹽誘導(dǎo)slwrky8p將t2代轉(zhuǎn)基因番茄種子進(jìn)行滅菌處理，得到無(wú)菌t2代番茄種子。將無(wú)菌t2代番茄種子播種在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的1/2ms固體選擇培養(yǎng)。隨后，將兩周大的無(wú)菌轉(zhuǎn)基因番茄幼苗6株置于含有300mmmannitol的1/2ms液體培養(yǎng)基中、將兩周大的無(wú)菌轉(zhuǎn)基因番茄幼苗6株置于含有200mmnacl的1/2ms液體培養(yǎng)基中、將兩周大的無(wú)菌轉(zhuǎn)基因番茄幼苗6株置于1/2ms液體培養(yǎng)基中，并分別于25℃、16小時(shí)光照、23℃、8小時(shí)黑暗、平均光照強(qiáng)度為80μmolm-2s-1條件下培養(yǎng)24小時(shí)，分別得到300mmmannitol處理的番茄幼苗(即干旱脅迫24小時(shí)番茄幼苗)、200mmnacl處理的番茄幼苗(即鹽脅迫24小時(shí)的番茄幼苗)和正常培養(yǎng)24小時(shí)的番茄幼苗(作為對(duì)照)，然后將上述所得的材料進(jìn)行g(shù)us組織化學(xué)染色。3、gus組織化學(xué)染色gus能與顯色底物x-gluc反應(yīng)，呈現(xiàn)藍(lán)色，因而可以通過(guò)組織化學(xué)染色定性的研究gus的表達(dá)水平和表達(dá)模式。(1)gus染色底物的配制：50ml0.5m磷酸緩沖液(ph7.0)，50μl100mm鐵氰化鉀k3fe(cn)6(將3.2924g鐵氰化鉀溶于水，定容至100ml，4℃保存)，50μl100mm亞鐵氰化鉀k4[fe(cn)6]·3h2o(將4.2239g亞鐵氰化鉀溶于水，定容至100ml，4℃保存)，1ml0.5medta，250μl1mg/mlx-gluc(用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存)。(2)染色步驟染色：將待測(cè)樣品浸到gus染液中，37℃保溫箱中放置24-36小時(shí)。脫色：將染色后的樣品經(jīng)系列濃度乙醇脫色，濃度分別為：50％，75％和90％，至完全脫色后又降低濃度，依次為：90％，70％和50％，最后將樣品保存在50％的乙醇溶液中。(3)觀察用體視鏡(leicam205c)分別觀察脫色后的正常培養(yǎng)24小時(shí)的番茄幼苗、脫色后的300mmmannitol處理24小時(shí)的番茄幼苗和脫色后的200mmnacl處理24小時(shí)的番茄幼苗并拍照，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)24小時(shí)的番茄幼苗經(jīng)gus染色后，番茄幼苗的根、莖和葉片都呈現(xiàn)淡藍(lán)色，而300mmmannitol處理24小時(shí)的番茄幼苗的根、莖和葉片都呈現(xiàn)深藍(lán)色，并且在200mmnacl處理24小時(shí)的番茄幼苗的根、莖和葉片也都呈現(xiàn)深藍(lán)色。gus染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)正常培養(yǎng)的番茄，300mmmannitol或200mmnacl處理的番茄gus表達(dá)量在根、莖和葉片中都顯著增加。4、gus酶活的測(cè)定按照cote等的方法(cotec,rutledgerg.animprovedmugfluorescentassayforthedeterminationofthegusactivitywithintransgenictissueofwoodyplants.plantcellreport,2003,21(6):619-624.)對(duì)正常培養(yǎng)24小時(shí)的番茄幼苗、300mmmannitol處理24小時(shí)的番茄幼苗和200mmnacl處理24小時(shí)的番茄幼苗進(jìn)行g(shù)us活性熒光定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常培養(yǎng)24小時(shí)的番茄的gus活性值為1.16nmol4-mumin-1mg-1蛋白，300mmmannitol處理24小時(shí)的番茄的gus活性值為2.96nmol4-mumin-1mg-1蛋白，200mmnacl處理24小時(shí)的番茄的gus活性值為3.14nmol4-mumin-1mg-1蛋白，mannitol處理和nacl處理24小時(shí)下gus活性分別是正常培養(yǎng)的2.6倍和2.7倍，呈極顯著差異。上述結(jié)果表明啟動(dòng)子slwrky8p受干旱和或高鹽誘導(dǎo)。本發(fā)明并不局限于前述的具體實(shí)施方式。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說(shuō)明書(shū)中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過(guò)程的步驟或任何新的組合。序列表<110>西南科技大學(xué)<120>一種來(lái)源于番茄的干旱和/或高鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子slwrky8p及其應(yīng)用<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1446<212>dna<213>aaattcatttagcgttgcatggtttttattcaatttgaacgagtcgtaagcttaagtctt60<400>1aaattcatttagcgttgcatggtttttattcaatttgaacgagtcgtaagcttaagtctt60ttgttttatttttttctaccatttggaagagagtttagttccaacttacaagaatgataa120aattctcctagttgtttttcttttctaatttaaacaacttttttttttgtaataattaat180ataagttagtcaagcttaaaatatattgtcaacggaattatgctggctaaaaccaattga240gggggtaagactagtaaaatactttatacattctagaagaagatgaacccaaccatcaaa300gataaaaaatcaaacttaaataattaaagtggccaaaatggaattgaaacgaaattcctt360ttattcaaaaaagagatgaggacaaatggaattgaaacaaaattccaaccctgctaagta420aattaaatgatataatacaaagacaaaaagattcagaaaagtcaactaaaatgggagggg480aaaaaatgaagtagaagaagtaatacgtaaccgaaaaccactaatttatatgcgttttac540atctaaatcttacttataacttataatttagtgataagttatgtttttttttaaaaaaaa600taaataagtaaggacatatcaatgctattacaaagtaatgaaagatcttgaataattttt660tcctagatccataacaattgtatttttctttgatgttctagtatgtatgttaataataat720taaaaaaaaaatggttactaagaacaaatcctccaaatcaaacacaagcatctcgtgaat780cagacggcgttgtcacactcctttgacctgatcagttcaaatttccccaaaagagacccc840actcactcttatttccccaaagaaaaggtcaatgaaccattactctcatgacccacccta900caccacaacaatctaaatcattttccccttttattaaagcaacataatattctcttcttt960cacaatcctcgagaaagaaaaaataaaagttacttctcactatacaataatttaacaaaa1020aaataaagtgacaatttacaagtaaaattatttagtaatcttgtttttttataacttact1080cattggcagaatcggagtactcatataagaatgatagagtatattggatagcatacaaaa1140ttttacttttattttatgaagatatatttttatgggaagtaaaaataaaagaagcgctag1200tatatgtgtgcgatcgtattcgcacctaatcttgacgaggcagaagttagattagagtga1260caggtaagtcacctactgtttactttatcataactttcttcttcttttttatactaataa1320ataccctcaccaaagccatcactttgactctttatcaaactctctcatttacattaatgt1380ttctattttctgagatcagtatacttctcatttgtctaaattagttactataatatggct1440gtggag1446<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列<400>2ggtaccaaattcatttagcgttgcat26<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列<400>3ggatccctccacagccatattatagtaac29當(dāng)前第1頁(yè)12