本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種長非編碼rna--enst00000588480.1在診斷及制備膽管癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膽管癌(cholangiocarcinoma,cca)是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，起病隱匿，早期診斷困難，平均生存期小于24月，五年生存率小于5％。手術(shù)是目前有效的治療手段，但初診患者僅30％適合手術(shù)，其余已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會。因此，早期診斷早期治療是提高膽管癌患者手術(shù)率和生存率的關(guān)鍵。目前膽管癌診斷金標(biāo)準(zhǔn)依靠組織和細(xì)胞學(xué)病理，臨床常用經(jīng)內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影術(shù)(endoscopicretrogradecholangiopancreatography,ercp)行組織活檢和細(xì)胞學(xué)刷片檢查，但活檢取材困難，刷片診斷陽性率僅約20％。膽汁作為膽管上皮細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，蘊(yùn)含豐富的膽道疾病信息，是應(yīng)用價值很高的液體活檢標(biāo)本。與細(xì)針穿刺和組織病理檢查相比，體液標(biāo)本取材方便、可重復(fù)、創(chuàng)傷小，可應(yīng)用于臨床實(shí)時動態(tài)個體化診療中。而傳統(tǒng)血液和膽汁腫瘤標(biāo)志物ca199、cea、ca125的檢測主要基于蛋白質(zhì)組學(xué)，具有不統(tǒng)一、特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。因此，尋找膽管癌特異性腫瘤標(biāo)記物對早期診斷具有重要理論意義和實(shí)用價值。

外泌體exosome是由胞內(nèi)體分泌而來，晚期內(nèi)涵體膜向內(nèi)出芽形成，細(xì)胞內(nèi)多泡體(multivesicularbody,mvb)與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約30-120nm的膜性囊泡。exosome廣泛存在于許多體液中如血清、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁等。目前常用超高速差速離心法、聚合沉淀法從體液中提取，兩種方法各有優(yōu)勢，前者提取的濃度和純化率高，后者多使用試劑盒進(jìn)行提取，具有濃度和純化率高、樣本量少、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。目前報(bào)道的2篇關(guān)于膽汁樣本exosome的提取均采用超高速差速離心法。exosome可用電鏡觀察大小和形態(tài)，或檢測標(biāo)志物來鑒定exosome，常選取的標(biāo)志物有alix、tsg101、cd81、cd82、cd63、cd9、cd24、epcam、hsc70等。研究發(fā)現(xiàn)，exosome可通過囊泡運(yùn)輸方式，在體內(nèi)充當(dāng)細(xì)胞間通訊使者的角色；在免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中均有作用；有證據(jù)顯示，腫瘤來源的exosome有利于致瘤微環(huán)境的產(chǎn)生和重建。因脂質(zhì)雙分子層的保護(hù)作用，exosome可在體液中穩(wěn)定存在且半衰期長，且其中的標(biāo)記蛋白以及非編碼rna可選擇性富集，可提供豐富、穩(wěn)定、靈敏且特異的生物信息。穩(wěn)定的生物學(xué)特性、內(nèi)容物富集和多樣性、非侵入性及檢測迅速，使exosome有望成為應(yīng)用前景廣闊的新型循環(huán)生物標(biāo)志物。近年來針對exosome應(yīng)用于疾病診斷的開發(fā)研究逐年增長，其中70％以上均是exosome在腫瘤性疾病中的研究，此外，心血管疾病、腎臟疾病、自身免疫病等多種疾病中也亦有exosome作為疾病循環(huán)標(biāo)志物的相關(guān)研究。exosome作為大分子信息物質(zhì)的載體，含有豐富的蛋白質(zhì)、mrna、非編碼rna等信號分子，其中非編碼rna發(fā)揮重要的作用，是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)之一。

非編碼rna主要包括小分子單鏈rna(microrna,mirna)和長鏈非編碼rna(longnoncodingrna,lncrna)。lncrna是一類長度>200nt的非編碼rna，在基因印記、染色質(zhì)重塑、細(xì)胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、mrna降解和翻譯調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用。exosome內(nèi)lncrna的研究已有少量報(bào)道，研究顯示：lncrna占血漿exosome的測序rna的3％，由rna通過控制超級增強(qiáng)子的活性調(diào)節(jié)。senfter等研究顯示：因lncrna不穩(wěn)定，exosome可能是其血行轉(zhuǎn)移的載體；mustafa等發(fā)現(xiàn)，尿液exosome中l(wèi)ncrna-p21可鑒別前列腺良惡性腫瘤。exosome中l(wèi)ncrna具有以下特點(diǎn)：①組織和循環(huán)特異性：cabili等收集lincrna轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)lncrna具有高度的組織特異性，可作為診斷及預(yù)后標(biāo)志物。②富集性：gezer等研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中exosome內(nèi)多種lncrna含量較細(xì)胞培養(yǎng)液中高。本研究將對膽汁提取exosome前后lncrna的表達(dá)量進(jìn)行檢測，分析膽汁exosome是否存在富集現(xiàn)象。③穩(wěn)定性：ban等指出，低ph有助于exosome的提??；malik等研究顯示，exosome內(nèi)hsp60在一定溫度、ph值和乙醇中具有穩(wěn)定性。綜合以上特點(diǎn)，表明exosome中l(wèi)ncrna可作為腫瘤的臨床診斷標(biāo)志物。最近的研究顯示：膽汁exosome中5種mirna可作為膽管癌診斷組合，敏感度和特異度分別為67％和96％，優(yōu)于血清ca199檢測。與mirna比較，lncrna在膽管癌領(lǐng)域較少，僅有2篇組織中的研究：在肝內(nèi)膽管癌組織芯片中研究發(fā)現(xiàn)lncrnacps1和cps1-it1可做為肝內(nèi)膽管癌判斷預(yù)后的標(biāo)志；wang等研究表明，lncrna與mrna聯(lián)合診斷可預(yù)測肝內(nèi)膽管癌患者生存期。目前尚沒有l(wèi)ncrna在膽管癌體液中研究，更沒有膽管癌體液exosome中l(wèi)ncrna的研究，因此，本研究具有較好的創(chuàng)新性和應(yīng)用前景。因lncrna的研究較少，現(xiàn)有l(wèi)ncrna的具體功能機(jī)制尚待探索，新的lncrna尚待發(fā)現(xiàn)。因此，發(fā)展高通量、高分辨率的成像及實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步從膽汁中篩查靈敏度及特異度更高的lncrna分子將為膽管癌的早期診斷提供理論依據(jù)。

課題組前期通過對5位膽管良性狹窄和5位膽管癌患者膽汁中exosome進(jìn)行l(wèi)ncrna全轉(zhuǎn)錄組測序(廣州市銳博生物科技有限公司)，發(fā)現(xiàn)兩者差異在1倍以上的lncrna有54條(其中19個上調(diào)，35個下調(diào))，進(jìn)一步采用熒光實(shí)時定量rt-pcr(qrt-pcr)在32對有膽管良性狹窄和膽管癌患者膽汁標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)lncrna：enst00000588480.1在膽管癌患者膽汁中表達(dá)平均上調(diào)4.87倍；roc曲線顯示曲線下面積0.688(95％可信區(qū)間：0.55-0.82)，敏感度:63％，特異度:75％。與患者的tnm分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示enst00000588480.1在方面具有重要的作用。以上的結(jié)果表明enst00000588480.1是膽管癌潛在的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供lncrnaenst00000588480.1在診斷膽管癌及在制備治療膽管癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及一種長非編碼rna，其基因位于19號染色體:1,989,903-1,990,370，長度為468核苷酸，其核苷酸序列為seqidno：1；

seqidno:1：

ggctttccgcagtgaactcgggggcactatcctcggtacccagatgcccacctgtgtgccactcccctcccaaaccagcccctgagcccgagctctgttacctgcagcgaactcctcgatggtcatgagcgggaagcgaatgaggcccagggccttgcccagaaccttccgcctgttctctggcgtcacctgcagctgctgccgctgacactcggcctcggaccagcggacaacggcattgaacagccgcacctcacggatgcccagtgtgtcgcgctccaggacagccaccagcgtgtctgtggggtggaggaaggggctgcgtgaacacgacacccacatgcccaccctgcaggaggcagtgagactaacgtgaggaccagcagttaaagccgggctggcaactatggcccgtggcccaaatctggccctgtgagtgtgtttataaataaagctttatcaacacaa

一種長非編碼rna在制備治療膽管癌藥物中的應(yīng)用；

一種長非編碼rna在制備診斷膽管癌試劑中的應(yīng)用；

一種檢測enst00000588480.1的引物，如seqidno.2和seqidno.3所示，

enst00000588480.1primerf(seqidno：2)：5'-gcttcccactccaaagtcc-3',

primerr(seqidno：3)：5’-ctagagggagctgacggatg-3’。

plaprimerf(seqidno：4)：5'-aagttcttgatccccaatgctt-3',

primerr(seqidno：5)：5'-gtctgataggatgtgttggttgc-3'。

一種試劑盒，包括所述引物；

一種包括所述長鏈非編碼rna的藥物組合物；

所述引物在制備診斷膽管癌試劑中的應(yīng)用；

所述藥物組合物在制備治療膽管癌藥物中的應(yīng)用。

所述藥物組合物，其中還包括輔料。輔料包括：(lip2000,opti-mem培養(yǎng)液,pbs磷酸緩沖鹽溶液)。

技術(shù)方案

標(biāo)本收集

本研究納入了南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2013年2015年于消化內(nèi)科行ercp的患者樣本為患者ercp術(shù)中插管后抽取得到的膽汁。其中膽管癌患者32例作為實(shí)驗(yàn)組，良性膽管狹窄患者32例作為對照組，所有病例均經(jīng)過影像學(xué)/病理學(xué)檢查確認(rèn)。所有患者術(shù)前均空腹，手術(shù)均由熟練的操作者實(shí)施，獲取的膽汁提取后均立即儲存于-80℃冰箱待用。本研究得到了南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)，納入研究的患者均于術(shù)前簽署知情同意書。

外泌體分離

本研究采用傳統(tǒng)的超高速差速離心法分離膽汁中的外泌體，分步提純外泌體，低溫常規(guī)轉(zhuǎn)速和高速離心外泌體使用常規(guī)ep管，過濾步驟使用的0.22μm濾器購自merckmillipore公司，超速離心步驟使用與beckman超速離心機(jī)適配的beckman超速離心管(10.4ml，beckmancoulter，美國)。離心過程中配平均使用1xpbs緩沖液。

rna提取和定量pcr分析

根據(jù)試劑的使用說明，用trizol試劑分離總rna。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用biotekesupermoⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(bioteke，北京，中國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對0.4μg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終體積為20μl。熒光定量pcr應(yīng)用sybrgreenmastermix試劑盒(vazymebiotech，南京，中國)。結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到ct值，采用相對量法與內(nèi)參進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。

數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)皆用spss17.0軟件分析，以三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異用雙尾student’st檢驗(yàn)。生存分析用kaplan-meier方法。單因素分析中p<0.05的隨后再使用多因素分析。

附圖說明

圖1.膽汁外泌體的鑒定

1a：膽汁外泌體電鏡圖；

1b：外泌體粒徑圖；

1c：流式細(xì)胞儀檢測外泌體標(biāo)志蛋白cd63和cd81的表達(dá)。

圖2.lncrna差異表達(dá)和鑒定及其診斷價值

2a：enst00000588480.1在患者膽汁中表達(dá)水平；

2b：enst00000588480.1和ca199roc曲線比較。

圖3.enst00000588480.1在預(yù)后評估中價值

3a：enst00000588480.1表達(dá)與患者tnm分期關(guān)系；

3b：enst00000588480.1表達(dá)與患者生存分析關(guān)系。

圖4.enst00000588480.1靶基因功能和通路預(yù)測

4a：enst00000588480.1功能預(yù)測；

4b：kegg通路分析。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

一般性說明：

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照sambrook，j等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(molecularcloning：alaboratorymanual，3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來說是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請中提及的超速離心管、濾器等均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。

實(shí)施例1外泌體的分離和鑒定

(1)取出儲存于-80℃冰箱的患者膽汁標(biāo)本，用預(yù)冷的pbs配平后于4℃以300xg離心10分鐘后棄沉淀以去除沉淀的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，將上清移至新的標(biāo)記好的10ml離心管。

(2)取出的上清用預(yù)冷的pbs配平后于4℃以16,500xg離心20分鐘，棄沉淀進(jìn)一步去除上清中的碎片，用注射器吸取上清并通過0.22μm濾器過濾，將濾液收集至標(biāo)記好的超速離心管。

(3)在裝有濾液的超速離心管中加入預(yù)冷的pbs至離心管容積的2/3以上并用pbs配平。在4℃下以120,000xg在超速離心機(jī)真空離心70min，可于管底觀察到黃色沉淀，即為分離的外泌體。棄上清，可用50μl預(yù)冷的pbs溶液懸浮外泌體并轉(zhuǎn)移至新的、標(biāo)記好的無酶ep管，置于-80℃冰箱保存，也可加入1ml的trizol裂解液充分吹勻管底的黃色沉淀并移至新的、標(biāo)記好的1.5mlep管以進(jìn)行后續(xù)的rna提取。

(4)將外泌體pbs懸浮液送至南京醫(yī)科大學(xué)分析測試中心做電鏡鑒定。

實(shí)施例2檢測enst00000588480.1r在膽汁外泌體中的表達(dá)情況

rna提取

用trizol吹勻的外泌體冰上靜置5min后，加入約0.2ml的氯仿(三氯甲烷，體積比氯仿：trizol＝1：5)，快速劇烈混勻，冰上靜置5min；

上述混合液于4℃以12000rpm/min離心20min，后分為三層(水相/白色沉淀/紅色有機(jī)物)，用移液器輕輕吸取上層無色透明液體至新的無酶ep管，盡量避開白色沉淀；

在無色透明上清液中加入與之等體積的異丙醇，低速渦旋混合后冰上靜置10min，于4℃以12000rpm/min離心15min，棄上清；

在上述沉淀中加入1ml預(yù)冷的現(xiàn)配75％乙醇(0.1％depc水：無水乙醇＝1：3)后，于4℃以7500rpm/min離心5min，盡量吸盡上清并棄上清；

將棄去上清的ep管倒置于濾紙上，室溫干燥約15min；

干燥后加入適量depc水(15-20μl)，輕吹混勻。

用depc水將超微量紫外分光光度計(jì)調(diào)零后，吸取1μl的rna溶液滴于one-drop儀器中進(jìn)行rna濃度及a260/a280的檢測，a260/a280比值范圍在1.8到2.1表明符合要求；

用瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的完整性。配制1％的瓊脂糖凝膠后，實(shí)驗(yàn)用微波爐加熱溶解瓊脂糖至瓊脂糖完全溶解，將溶液冷卻至60-65℃左右，加入溴化乙錠(eb，10mg/ml)。搖勻后倒膠，待膠冷凝后，置于電泳槽中，浸于1×tae緩沖液中平衡10min待用。點(diǎn)樣。按1：4的體積比將5×核酸電泳上樣緩沖液與樣本混合，將各樣本含有1μg的rna加入凝膠孔中。80v恒壓電泳50min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

tris-乙酸(tae)緩沖液配方(1l)50×：

實(shí)時定量pcr

從膽汁外泌體提取的rna，逆轉(zhuǎn)錄和定量pcr分析(以20μl為例)：

(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用biotekesupermoⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

逆轉(zhuǎn)錄體系如下：

按以下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

①50℃，60min；

②70℃，10min；

之后隨即冰上冷卻，得到的cdna即可直接用于后續(xù)的qpcr。根據(jù)xx提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物序列。

qpcr應(yīng)用steponereal-timepcr系統(tǒng)。

qpcr體系如下：

qpcr反應(yīng)條件如下：

結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到ct值。將所選常用內(nèi)參的ct值導(dǎo)入bestkeeper，篩選出表達(dá)相對最穩(wěn)定的內(nèi)參pla。根據(jù)篩出的內(nèi)參pla和目的基因的ct值，使用2^-δδct法，計(jì)算目的基因lncrna的相對表達(dá)量。計(jì)算公式為：2^-δδct。

結(jié)果表明，enst00000588480.1r在膽管癌患者膽汁外泌體中表達(dá)較對照組上調(diào)4.87倍(圖2a)。

實(shí)施例3enst00000588480.1在膽管癌診斷和預(yù)后評估中的價值

為了檢測enst00000588480.1在診斷膽管癌中的價值，roc曲線顯示曲線下面積0.688(95％可信區(qū)間：0.55-0.82)，敏感度:63％，特異度:75％(圖2b)。膽管癌中enst00000588480.1高表達(dá)與患者的tnm分期(ⅰ-ⅱvs.ⅲ-ⅳ，p＝0.027，圖3a)相關(guān)，根據(jù)enst00000588480.1在膽管癌患者中和不良預(yù)后(p＝0.0231，圖3b)呈正相關(guān)。

實(shí)施例4enst00000588480.1靶基因功能和通路預(yù)測

lncrna靶基因預(yù)測整合了ncbi，rnacentral,genecode等數(shù)據(jù)庫，對lncrna作用于靶基因的cis作用和trans作用進(jìn)行預(yù)測，csnk1g2，btbd2。然后通過kobas,http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php對其進(jìn)行功能(圖4a)和通路(圖4b)預(yù)測。

sequencelisting

<110>南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

<120>一種長非編碼rna及其在診斷/治療膽管癌中的應(yīng)用

<130>

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>468

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggctttccgcagtgaactcgggggcactatcctcggtacccagatgcccacctgtgtgcc60

actcccctcccaaaccagcccctgagcccgagctctgttacctgcagcgaactcctcgat120

ggtcatgagcgggaagcgaatgaggcccagggccttgcccagaaccttccgcctgttctc180

tggcgtcacctgcagctgctgccgctgacactcggcctcggaccagcggacaacggcatt240

gaacagccgcacctcacggatgcccagtgtgtcgcgctccaggacagccaccagcgtgtc300

tgtggggtggaggaaggggctgcgtgaacacgacacccacatgcccaccctgcaggaggc360

agtgagactaacgtgaggaccagcagttaaagccgggctggcaactatggcccgtggccc420

aaatctggccctgtgagtgtgtttataaataaagctttatcaacacaa468

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcttcccactccaaagtcc19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctagagggagctgacggatg20

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aagttcttgatccccaatgctt22

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtctgataggatgtgttggttgc23