本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)的方法。
背景技術(shù)：
：下一代測(cè)序(next-generationsequencing，ngs)由于高通量、高靈敏度、高度自動(dòng)化等特性，近年來(lái)在疾病的研究和診斷治療中越來(lái)越多地被應(yīng)用。ngs技術(shù)能實(shí)現(xiàn)多基因平行檢測(cè)，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法節(jié)省樣本，且靈敏度更高，能更真實(shí)還原腫瘤變異全景。但lifengs平臺(tái)中傳統(tǒng)的構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)的方法步驟繁瑣，需要經(jīng)過(guò)pcr擴(kuò)增、消化、加接頭、純化等步驟，需要花費(fèi)約5h；并且由于多步驟操作中需要開(kāi)蓋，因此文庫(kù)易被污染，文庫(kù)損失率高；另外在傳統(tǒng)的構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)的方法中，單個(gè)樣品建立文庫(kù)的成本較高，為200-1000元/例。公開(kāi)于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)的方法。該方法可以簡(jiǎn)便、快速的經(jīng)1步pcr構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)，且由于在pcr起始時(shí)就引入barcode，使得樣本及文庫(kù)間交叉污染的可能性大大降低，并能簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地分區(qū)的要求，該方法還能將單個(gè)樣品建立文庫(kù)的成本控制在30元/例。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：一種用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法，包括以下步驟：1、合成用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的融合引物組合，所述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的融合引物組合包括：根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物，所述根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第一接頭序列(a序列)、barcode序列、第二接頭序列和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列；和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物，所述根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第三接頭序列(trp1序列)和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列；2、構(gòu)建dna樣品的pcr反應(yīng)體系，將根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物混合以作為pcr反應(yīng)體系中的引物組合；3、進(jìn)行pcr。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述第一接頭序列包括seqid:1序列，seqid:1序列的核苷酸序列為ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述barcode序列是與樣本相對(duì)應(yīng)的，不同樣品之間的barcode序列不同，只要能區(qū)分不同樣本就可以。barcode序列不是特異性的，其序列可以變動(dòng)。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述第二接頭序列包括核苷酸序列g(shù)at。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述第三接頭序列包括seqid:2序列，seqid:2序列的核苷酸序列為cctctctatgggcagtcggtgat。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)任意一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物和根據(jù)任意一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物的濃度均為100μm。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，當(dāng)同一個(gè)pcr反應(yīng)中的目標(biāo)擴(kuò)增子的數(shù)量＞1時(shí)，所述根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物為根據(jù)每一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物的組合，所述根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物為根據(jù)每一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物的組合。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)任意一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物和根據(jù)該目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物的摩爾比為1:1。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述dna樣品為基因組dna。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，基因組dna提取自組織樣本或福爾馬林固定石蠟包埋樣本。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述目標(biāo)擴(kuò)增子包括選自下組22種目標(biāo)擴(kuò)增子中的至少一個(gè)：alk基因的chr2:29432588-29432707(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:3所示：taagggacaagcagccacaccccattcttgaggggctgaggtggaagagacaggcccggaggggtgaggcagtctttactcacctgtagatgtctcgggccatcccgaagtctccaatcttggccactcttccagggcctggacaggtcaagaggcagt；alk基因的chr2:29443616-29443730(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:4所示：cggaggaaggacttgaggtctccccccgccatgagctccagcaggatgaaccggggcagggattgcaggctcaccccaatgcagcgaacaatgttctggtggttgaatttgctgcagagcagagagggatgtaaccaaaattaactgagctgagtctgg；braf基因的chr7:140453091-140453197(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:5所示：cctcaattcttaccatccacaaaatggatccagacaactgttcaaactgatgggacccactccatcgagatttcactgtagctagaccaaaatcacctatttttactgtgaggtcttcatgaagaaatatatctgaggtgtagtaagtaaaggaaaacagtag；egfr基因的chr7:55241604-55241726(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:6所示：tgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataaggtaaggtccctgg；egfr基因的chr7:55242398-55242513(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:7所示：acaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtgt；egfr基因的chr7:55248970-55249096(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:8所示：gaagccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacac；egfr基因的chr7:55259505-55259621(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:9所示：ccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgttta；erbb2基因的chr17:37880969-37881082(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:10所示：cataccctctcagcgtacccttgtccccaggaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccg；kras基因的chr12:25380261-25380363(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:11所示：agtcctcatgtactggtccctcattgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaatatccaagagacaggtttctccatcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagggagaaacacagtctggattattacagtgca；kras基因的chr12:25398183-25398310(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:12所示：aaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagatttacctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtcaaggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcaggcctt；met基因的chr7:116340233-116340335(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:13所示：tcgatctgccatgtgtgcattccctatcaaatatgtcaacgacttcttcaacaagatcgtcaacaaaaacaatgtgagatgtctccagcatttttacggacccaatcatgagcactgctttaatagggtaagtcacatcagttccc；met基因的chr7:116411880-116412005(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:14所示：ccatgatagccgtctttaacaagctctttctttctctctgttttaagatctgggcagtgaattagttcgctacgatgcaagagtacacactcctcatttggataggcttgtaagtgcccgaagtgtaagcccaactacagaaatggtttcaaatgaatctgtagactaccgagct；met基因的chr7:116417426-116417546(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:15所示：atgttacgcagtgctaaccaagttctttcttttgcacagggcattttggttgtgtatatcatgggactttgttggacaatgatggcaagaaaattcactgtgctgtgaaatccttgaacagtaagtggcattttatttaaccatggagtatacttttgtggtttgcaac；met基因的chr7:116423399-116423499(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:16所示：cagtcaaggttgctgattttggtcttgccagagacatgtatgataaagaatactatagtgtacacaacaaaacaggtgcaaagctgccagtgaagtggatggctttggaaagtctgcaaactcaaaagtttaccaccaagtcagatgtg；nras基因的chr1:115256507-115256586(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:17所示：ttcgcctgtcctcatgtattggtctctcatggcactgtactcttcttgtccagctgtatccagtatgtccaacaaacaggtttcaccatctataaccacttgttttctgtaagaatcctgggggtg；nras基因的chr1:115258651-115258755(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:18所示：tgagagacaggatcaggtcagcgggctaccactgggcctcacctctatggtgggatcatattcatctacaaagtggttctggattagctggattgtcagtgcgcttttcccaacaccacctgctccaaccaccaccagtttgtactcag；pik3ca基因的chr3:178936056-178936179(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:19所示：ggaaaatgacaaagaacagctcaaagcaatttctacacgagatcctctctctgaaatcactgagcaggagaaagattttctatggagtcacaggtaagtgctaaaatggagattctctgtttctttttctttattacagaaaaaataactgaatttggctgatctcagcatgtt；pik3ca基因的chr3:178952000-178952092(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:20所示：atgccagaactacaatcttttgatgacattgcatacattcgaaagaccctagccttagataaaactgagcaagaggctttggagtatttcatgaaacaaatgaatgatgcacatcatggtggctggacaacaaaaatggattg；tp53基因的chr17:7577027-7577154(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:21所示：cttcttgtcctgcttgcttacctcgcttagtgctccctgggggcagctcgtggtgaggctcccctttcttgcggagattctcttcctctgtgcgccggtctctcccaggacaggcacaaacacgcacctcaaagctgttccgtcccagtagattaccactactcaggataggaaaagag；tp53基因的chr17:7577507-7577613(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:22所示：gcaagtggctcctgacctggagtcttccagtgtgatgatggtgaggatgggcctccggttcatgccgcccatgcaggaactgttacacatgtagttgtagtggatggtggtacagtcagagccaacctaggagataacacaggcccaaga；tp53基因的chr17:7578182-7578298(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:23所示：ccccagttgcaaaccagacctcaggcggctcatagggcaccaccacactatgtcgaaaagtgtttctgtcatccaaatactccacacgcaaatttccttccactcggataagatgctgaggaggggccagacctaagagcaatcagtgaggaatcagagg；tp53基因的chr17:7578389-7578537(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:24所示：accatcgctatctgagcagcgctcatggtgggggcagcgcctcacaacctccgtcatgtgctgtgactgcttgtagatggccatggcgcggacgcgggtgccgggcgggggtgtggaatcaacccacagctgcacagggcaggtcttggccagttggcaaaacatcttgttgagggcaggggagtactg。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)alk基因的chr2:29432588-29432707(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:25所示：actgcctcttgacctgtcc；根據(jù)alk基因的chr2:29432588-29432707(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:26所示：taagggacaagcagccacac。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)alk基因的chr2:29443616-29443730(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:27所示：ccagactcagctcagttaattttgg；根據(jù)alk基因的chr2:29443616-29443730(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:28所示：cggaggaaggacttgaggt。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)braf基因的chr7:140453091-140453197(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:29所示：ctactgttttcctttacttactacacctc；根據(jù)braf基因的chr7:140453091-140453197(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:30所示：cctcaattcttaccatccacaaaatgg。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)egfr基因的chr7:55241604-55241726(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:31所示：tgacccttgtctctgtgttcttg；根據(jù)egfr基因的chr7:55241604-55241726(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:32所示：ccagggaccttaccttatacacc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)egfr基因的chr7:55242398-55242513(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:33所示：acaattgccagttaacgtcttcc；根據(jù)egfr基因的chr7:55242398-55242513(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:34所示：acacagcaaagcagaaactcac。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)egfr基因的chr7:55248970-55249096(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:35所示：gaagccacactgacgtgc；根據(jù)egfr基因的chr7:55248970-55249096(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:36所示：gtgttcccggacatagtccag。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)egfr基因的chr7:55259505-55259621(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:37所示：ccgcagcatgtcaagatcaca；根據(jù)egfr基因的chr7:55259505-55259621(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:38所示：taaacaatacagctagtgggaaggc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)erbb2基因的chr17:37880969-37881082(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:39所示：cataccctctcagcgtaccc；根據(jù)erbb2基因的chr17:37880969-37881082(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:40所示：cggacatggtctaagaggcag。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)kras基因的chr12:25380261-25380363(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:41所示：tgcactgtaataatccagactgtgt；根據(jù)kras基因的chr12:25380261-25380363(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:42所示：agtcctcatgtactggtccctc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)kras基因的chr12:25398183-25398310(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:43所示：aaggcctgctgaaaatgactga；根據(jù)kras基因的chr12:25398183-25398310(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:44所示：aaagaatggtcctgcaccagta。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)met基因的chr7:116340233-116340335(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:45所示：tcgatctgccatgtgtgcatt；根據(jù)met基因的chr7:116340233-116340335(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:46所示：gggaactgatgtgacttaccct。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)met基因的chr7:116411880-116412005(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:47所示：ccatgatagccgtctttaacaagc；根據(jù)met基因的chr7:116411880-116412005(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:48所示：agctcggtagtctacagattcattt。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)met基因的chr7:116417426-116417546(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:49所示：atgttacgcagtgctaaccaag；根據(jù)met基因的chr7:116417426-116417546(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:50所示：gttgcaaaccacaaaagtatactcca。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)met基因的chr7:116423399-116423499(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:51所示：cagtcaaggttgctgattttggtc；根據(jù)met基因的chr7:116423399-116423499(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:52所示：cacatctgacttggtggtaaactt。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)nras基因的chr1:115256507-115256586(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:53所示：cacccccaggattcttacagaaaa；根據(jù)nras基因的chr1:115256507-115256586(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:54所示：ttcgcctgtcctcatgtattgg。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)nras基因的chr1:115258651-115258755(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:55所示：ctgagtacaaactggtggtggt；根據(jù)nras基因的chr1:115258651-115258755(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:56所示：tgagagacaggatcaggtcagc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)pik3ca基因的chr3:178936056-178936179(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:57所示：ggaaaatgacaaagaacagctcaaag；根據(jù)pik3ca基因的chr3:178936056-178936179(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:58所示：aacatgctgagatcagccaaattc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)pik3ca基因的chr3:178952000-178952092(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:59所示：atgccagaactacaatcttttgatgac；根據(jù)pik3ca基因的chr3:178952000-178952092(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:60所示：caatccatttttgttgtccagcc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)tp53基因的chr17:7577027-7577154(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:61所示：ctcttttcctatcctgagtagtggtaatc；根據(jù)tp53基因的chr17:7577027-7577154(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:62所示：cttcttgtcctgcttgcttacc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)tp53基因的chr17:7577507-7577613(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:63所示：tcttgggcctgtgttatctcctag；根據(jù)tp53基因的chr17:7577507-7577613(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:64所示：gcaagtggctcctgacctg。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)tp53基因的chr17:7578182-7578298(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:65所示：cctctgattcctcactgattgctc；根據(jù)tp53基因的chr17:7578182-7578298(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:66所示：ccccagttgcaaaccagac。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)tp53基因的chr17:7578389-7578537(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如seqid:67所示：cagtactcccctgccctcaa；根據(jù)tp53基因的chr17:7578389-7578537(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如seqid:68所示：accatcgctatctgagcagc。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述目標(biāo)擴(kuò)增子為以下22種：alk基因的chr2:29432588-29432707(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:3所示；alk基因的chr2:29443616-29443730(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:4所示；braf基因的chr7:140453091-140453197(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:5所示；egfr基因的chr7:55241604-55241726(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:6所示；egfr基因的chr7:55242398-55242513(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:7所示；egfr基因的chr7:55248970-55249096(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:8所示；egfr基因的chr7:55259505-55259621(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:9所示；erbb2基因的chr17:37880969-37881082(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:10所示；kras基因的chr12:25380261-25380363(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:11所示；kras基因的chr12:25398183-25398310(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:12所示；met基因的chr7:116340233-116340335(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:13所示；met基因的chr7:116411880-116412005(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:14所示；met基因的chr7:116417426-116417546(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:15所示；met基因的chr7:116423399-116423499(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:16所示；nras基因的chr1:115256507-115256586(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:17所示；nras基因的chr1:115258651-115258755(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:18所示；pik3ca基因的chr3:178936056-178936179(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:19所示；pik3ca基因的chr3:178952000-178952092(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:20所示；tp53基因的chr17:7577027-7577154(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:21所示；tp53基因的chr17:7577507-7577613(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:22所示；tp53基因的chr17:7578182-7578298(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:23所示；和tp53基因的chr17:7578389-7578537(hg19)擴(kuò)增子，其序列如seqid:24所示。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)alk基因的chr2:29432588-29432707(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)alk基因的chr2:29443616-29443730(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)braf基因的chr7:140453091-140453197(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)egfr基因的chr7:55241604-55241726(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)egfr基因的chr7:55242398-55242513(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)egfr基因的chr7:55248970-55249096(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)egfr基因的chr7:55259505-55259621(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)erbb2基因的chr17:37880969-37881082(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物；kras基因的chr12:25380261-25380363(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)kras基因的chr12:25398183-25398310(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物；根據(jù)met基因的chr7:116340233-116340335(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)met基因的chr7:116411880-116412005(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)met基因的chr7:116417426-116417546(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)met基因的chr7:116423399-116423499(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)nras基因的chr1:115256507-115256586(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)nras基因的chr1:115258651-115258755(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)pik3ca基因的chr3:178936056-178936179(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)pik3ca基因的chr3:178952000-178952092(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)tp53基因的chr17:7577027-7577154(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)tp53基因的chr17:7577507-7577613(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)tp53基因的chr17:7578182-7578298(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、和根據(jù)tp53基因的chr17:7578389-7578537(hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物的摩爾比為2:1:1:4:1:1:2:4:2:1:2:2:1:4:4:2:2:4:2:2:4:2。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，pcr反應(yīng)體系包括以下組分：pcr預(yù)混液10μl；dna樣品1-8μl共20ng；用于構(gòu)建同一個(gè)dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的引物組合2μl；dnaase-freeh2o補(bǔ)足至20μl。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，所述pcr預(yù)混液為kapahifipcrkits。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，進(jìn)行pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋荷鲜鲇糜跇?gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，pcr反應(yīng)結(jié)束后，還包括對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。上述用于構(gòu)建dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的方法在另一種實(shí)施方式中，當(dāng)所述dna樣品的數(shù)量＞1時(shí)，用于構(gòu)建不同dna樣品的擴(kuò)增子文庫(kù)的引物組合中，上游通用引物中的barcode序列不同。barcode序列是與樣品相對(duì)應(yīng)的，不同樣品之間的barcode序列不同，只要能區(qū)分不同樣品就可以，因此barcode序列不是特異性的，其序列可以變動(dòng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1、操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間。本發(fā)明是基于pgm平臺(tái)的設(shè)計(jì)的用于快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)的，現(xiàn)有商業(yè)化試劑盒對(duì)擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行準(zhǔn)備過(guò)程中步驟繁瑣，本發(fā)明只涉及一輪pcr反應(yīng)及對(duì)應(yīng)產(chǎn)物純化步驟，將擴(kuò)增子建庫(kù)的操作大大簡(jiǎn)化，節(jié)省建庫(kù)時(shí)間，從文庫(kù)構(gòu)建到上機(jī)結(jié)束及生物信息學(xué)分析完成的整個(gè)流程可在32小時(shí)內(nèi)完成。2、有效杜絕樣本及文庫(kù)污染。操作流程的大大簡(jiǎn)化使我們建庫(kù)過(guò)程更加的安全可靠，在pcr前就引入了barcode，使得后續(xù)操作時(shí)不同樣本間的交叉污染的可能性極大降低，另外操作過(guò)程及步驟的減少有效的杜絕了建庫(kù)過(guò)程中有可能造成的文庫(kù)污染。3、簡(jiǎn)化的生物信息學(xué)分析流程。該方法所得到的擴(kuò)增子文庫(kù)結(jié)構(gòu)單一，數(shù)據(jù)可靠，所得文庫(kù)的dna鏈組成簡(jiǎn)單明了，后續(xù)的生物信息學(xué)分析更加的簡(jiǎn)化。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建完成后檢測(cè)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分布圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中所得文庫(kù)里22個(gè)擴(kuò)增子的相關(guān)參數(shù)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。實(shí)施例1待測(cè)樣本為5份ffpe樣本(即：福爾馬林固定石蠟包埋樣本，ffpe代表formalin-fixedandparrffin-embedded)，其中3份為非小細(xì)胞肺癌患者的ffpe樣本，另外2份為非腫瘤患者的ffpe樣本。利用特異性設(shè)計(jì)的融合引物采用一步法對(duì)5份ffpe樣本構(gòu)建擴(kuò)增子dna文庫(kù)，具體過(guò)程如下：1、基因組dna的提取：使用qiagenffpednakit(離心柱型)試劑盒提取ffpe樣本中的基因組dna，具體步驟參照試劑盒操作說(shuō)明，將所得基因組dna溶解于tris-hcl緩沖液，nanodrop檢測(cè)dna提取質(zhì)量，用qubit3.0檢測(cè)樣本dna濃度后，將每份基因組dna樣本稀釋到濃度為20ng/μl。2、構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)所用融合引物序列信息如下：以下表格中引物名稱中以fb開(kāi)頭的引物表示上游融合引物，以r開(kāi)頭的引物表示下游融合引物，其中下游融合引物序列是幾組樣品通用的。上游融合引物中，核苷酸序列ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag表示第一接頭序列，gat三個(gè)核苷酸表示第二接頭序列，第一接頭序列和第二接頭序列之間的序列為barcode序列，第二接頭序列之后的序列為特異性上游引物序列。下游融合引物中，cctctctatgggcagtcggtgat序列表示第三接頭序列，其余為特異性下游引物序列。按照下表合成各融合引物。3、形成pcr反應(yīng)體系，具體pcr反應(yīng)體系如下：pcr反應(yīng)體系組分含量kapahifipcrkits10μl基因組dna(本身濃度10ng/μl))2μl融合引物組合2μldnaasefreeh2o補(bǔ)足余量總計(jì)20μl融合引物組合通過(guò)以下方式獲得：將步驟2中合成的各融合引物加水溶解至濃度100μm，將針對(duì)22種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的、帶有相同barcode序列標(biāo)簽的各上游融合引物混合得到上游融合引物組合，將針對(duì)22種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的各下游融合引物按照與對(duì)應(yīng)上游融合引物等體積的比例混合得到下游融合引物組合，再將上游融合引物組合及下游融合引物組合等體積混合，5個(gè)barcode序列標(biāo)簽分別對(duì)應(yīng)5組不同的待檢樣本。4、進(jìn)行pcr程序，pcr儀使用appliedbio-system的2720thermalcycler，pcr反應(yīng)程序如下：5、pcr反應(yīng)結(jié)束后，用beckmancoulter公司的agencourtampurexpkit(貨號(hào)a63880/a63881/a63882)進(jìn)行純化。操作步驟如下：1)提前30分鐘取出agencourtampurexpkit，充分渦旋后，室溫靜置。2)pcr反應(yīng)結(jié)束后，將磁珠再次充分渦旋，向體系中加入20ul磁珠，反復(fù)吹打5次以上或充分渦旋，室溫靜置5分鐘。3)將ep管轉(zhuǎn)移至置于磁力架上，靜置5分鐘至溶液澄清后，用移液槍小心除去上清，注意不要觸碰磁珠。4)每管加入100ul新鮮配置的80％乙醇溶液，ep管置于磁力架上緩慢旋轉(zhuǎn)2圈，靜置5m，棄去上清。5)重復(fù)4步一次。6)將ep管打開(kāi)，室溫靜置，使液體揮發(fā)干凈，以磁珠表面無(wú)光澤為準(zhǔn)，注意不要過(guò)分干燥磁珠。7)從磁力架上取下ep管，加入30ulpcr級(jí)純化水，渦旋混勻后，室溫靜置10分鐘。8)將上步的ep管置于磁力架上2分鐘或直至溶液澄清后，用移液槍在遠(yuǎn)離磁石的一面小心吸取上清液，注意不要觸碰磁珠。至此，擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建完成，圖1為文庫(kù)構(gòu)建完成后agilent2200tapestationsystems檢測(cè)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分布圖，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度(fu)，lower峰為25bp位置marker，upper峰為1500bp位置marker，如圖1所示經(jīng)pcr擴(kuò)增后所得pcr產(chǎn)物集中在200-260bp范圍內(nèi)，圖1說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符合，可以判斷所構(gòu)建文庫(kù)的大小及文庫(kù)濃度。6、上機(jī)測(cè)序及結(jié)果分析上述通過(guò)融合引物一步法獲得的擴(kuò)增子文庫(kù)，使用ionpgm平臺(tái)的318芯片，進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，每個(gè)文庫(kù)的數(shù)據(jù)量為250～500mbps。所得測(cè)序結(jié)果如圖2所示，可以進(jìn)一步對(duì)22擴(kuò)增子的各擴(kuò)增子是否進(jìn)行了擴(kuò)增以及各擴(kuò)增子的擴(kuò)增均一性進(jìn)行分析。測(cè)序的結(jié)果經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理、生物信息學(xué)分析之后得到檢測(cè)基因的突變情況。數(shù)據(jù)處理過(guò)程包括測(cè)序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、質(zhì)控、序列比對(duì)(參考基因組為ncbigrch37/hg19)、突變位點(diǎn)分析等過(guò)程，通過(guò)數(shù)據(jù)處理分析后得到檢測(cè)樣本的突變信息。實(shí)際收集的樣本檢測(cè)情況如下：5份受檢者的ffpe樣本中，2份正常人樣本未檢測(cè)到腫瘤相關(guān)突變，3份腫瘤患者的ffpe樣本檢測(cè)結(jié)果中，sample1檢測(cè)到p.v157f突變，sample2檢測(cè)到c.181c>a和p.q61k突變，sample3檢測(cè)到p.l858r突變。該結(jié)果和sanger檢測(cè)的結(jié)果一致。充分說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用性和良好特異性。前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。sequencelisting<110>北京泛生子醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司<120>一種快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)的方法<130>p170062dd1f<160>68<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<400>1ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag30<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2cctctctatgggcagtcggtgat23<210>3<211>159<212>dna<213>人alk基因的chr2:29432588-29432707擴(kuò)增子<400>3taagggacaagcagccacaccccattcttgaggggctgaggtggaagagacaggcccgga60ggggtgaggcagtctttactcacctgtagatgtctcgggccatcccgaagtctccaatct120tggccactcttccagggcctggacaggtcaagaggcagt159<210>4<211>159<212>dna<213>人alk基因的chr2:29443616-29443730擴(kuò)增子<400>4cggaggaaggacttgaggtctccccccgccatgagctccagcaggatgaaccggggcagg60gattgcaggctcaccccaatgcagcgaacaatgttctggtggttgaatttgctgcagagc120agagagggatgtaaccaaaattaactgagctgagtctgg159<210>5<211>163<212>dna<213>人braf基因的chr7:140453091-140453197擴(kuò)增子<400>5cctcaattcttaccatccacaaaatggatccagacaactgttcaaactgatgggacccac60tccatcgagatttcactgtagctagaccaaaatcacctatttttactgtgaggtcttcat120gaagaaatatatctgaggtgtagtaagtaaaggaaaacagtag163<210>6<211>169<212>dna<213>人egfr基因的chr7:55241604-55241726擴(kuò)增子<400>6tgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagcttgtggagcctcttacacccagtgga60gaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaa120gtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataaggtaaggtccctgg169<210>7<211>161<212>dna<213>人egfr基因的chr7:55242398-55242513擴(kuò)增子<400>7acaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaagg60tgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagc120caacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtgt161<210>8<211>166<212>dna<213>人egfr基因的chr7:55248970-55249096擴(kuò)增子<400>8gaagccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggccagcgtgga60caacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcac120gcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacac166<210>9<211>163<212>dna<213>人egfr基因的chr7:55259505-55259621擴(kuò)增子<400>9ccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaa60gaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcct120gacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgttta163<210>10<211>155<212>dna<213>人erbb2基因的chr17:37880969-37881082擴(kuò)增子<400>10cataccctctcagcgtacccttgtccccaggaagcatacgtgatggctggtgtgggctcc60ccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacag120cttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccg155<210>11<211>150<212>dna<213>人kras基因的chr12:25380261-25380363擴(kuò)增子<400>11agtcctcatgtactggtccctcattgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaat60atccaagagacaggtttctccatcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagg120gagaaacacagtctggattattacagtgca150<210>12<211>172<212>dna<213>人kras基因的chr12:25398183-25398310擴(kuò)增子<400>12aaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagatttacctctattgttgga60tcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtcaaggcactcttgcctacg120ccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcaggcctt172<210>13<211>146<212>dna<213>人met基因的chr7:116340233-116340335擴(kuò)增子<400>13tcgatctgccatgtgtgcattccctatcaaatatgtcaacgacttcttcaacaagatcgt60caacaaaaacaatgtgagatgtctccagcatttttacggacccaatcatgagcactgctt120taatagggtaagtcacatcagttccc146<210>14<211>175<212>dna<213>人met基因的chr7:116411880-116412005擴(kuò)增子<400>14ccatgatagccgtctttaacaagctctttctttctctctgttttaagatctgggcagtga60attagttcgctacgatgcaagagtacacactcctcatttggataggcttgtaagtgcccg120aagtgtaagcccaactacagaaatggtttcaaatgaatctgtagactaccgagct175<210>15<211>169<212>dna<213>人met基因的chr7:116417426-116417546擴(kuò)增子<400>15atgttacgcagtgctaaccaagttctttcttttgcacagggcattttggttgtgtatatc60atgggactttgttggacaatgatggcaagaaaattcactgtgctgtgaaatccttgaaca120gtaagtggcattttatttaaccatggagtatacttttgtggtttgcaac169<210>16<211>149<212>dna<213>met基因的chr7:116423399-116423499擴(kuò)增子<400>16cagtcaaggttgctgattttggtcttgccagagacatgtatgataaagaatactatagtg60tacacaacaaaacaggtgcaaagctgccagtgaagtggatggctttggaaagtctgcaaa120ctcaaaagtttaccaccaagtcagatgtg149<210>17<211>126<212>dna<213>人nras基因的chr1:115256507-115256586擴(kuò)增子<400>17ttcgcctgtcctcatgtattggtctctcatggcactgtactcttcttgtccagctgtatc60cagtatgtccaacaaacaggtttcaccatctataaccacttgttttctgtaagaatcctg120ggggtg126<210>18<211>149<212>dna<213>人nras基因的chr1:115258651-115258755擴(kuò)增子<400>18tgagagacaggatcaggtcagcgggctaccactgggcctcacctctatggtgggatcata60ttcatctacaaagtggttctggattagctggattgtcagtgcgcttttcccaacaccacc120tgctccaaccaccaccagtttgtactcag149<210>19<211>174<212>dna<213>人pik3ca基因的chr3:178936056-178936179擴(kuò)增子<400>19ggaaaatgacaaagaacagctcaaagcaatttctacacgagatcctctctctgaaatcac60tgagcaggagaaagattttctatggagtcacaggtaagtgctaaaatggagattctctgt120ttctttttctttattacagaaaaaataactgaatttggctgatctcagcatgtt174<210>20<211>143<212>dna<213>人pik3ca基因的chr3:178952000-178952092擴(kuò)增子<400>20atgccagaactacaatcttttgatgacattgcatacattcgaaagaccc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