本發(fā)明涉及一種同時(shí)提高胰蛋白酶活和熱穩(wěn)定性的方法，具體涉及一種利用超聲波處理胰蛋白酶，同時(shí)提高胰蛋白酶活和酶熱穩(wěn)定性的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶是一個(gè)絲氨酸家族的蛋白酶，具有底物特異性，只催化水解賴氨酸和精氨酸之間的化學(xué)鍵，在消化過程和許多其它的生物過程中發(fā)揮著重要的作用。胰蛋白酶分子由223個(gè)氨基酸組成，分子量23300da，最適ph值偏堿性（ph7.8~8.5），但它在堿溶液中加熱則變性沉淀。由于它在最適ph條件下熱穩(wěn)定性差，會直接影響胰蛋白酶的最佳催化效果，從而使其在食品加工過程中成本上升。因此在工業(yè)生產(chǎn)中，保持酶活的基礎(chǔ)上提高胰蛋白酶熱穩(wěn)定性是其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。
目前在工業(yè)上廣泛利用固定化酶技術(shù)來提高蛋白酶的熱穩(wěn)定性，但是該技術(shù)工藝復(fù)雜，成本高，制約了其大規(guī)?；a(chǎn)，同時(shí)蛋白酶經(jīng)固定化后酶活會不同程度降低（降低20%~80%），重復(fù)使用后酶活會進(jìn)一步降低，這些問題限制了固定化酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
研究表明超聲能提高蛋白酶的熱穩(wěn)定性，張永軍等（張永軍,黃惠華.超聲波對菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性及二級結(jié)構(gòu)的影響[j].中國食品添加劑,2009,6:110~113.）研究了聚能式超聲波對菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響，但是經(jīng)過超聲波處理，在提升蛋白酶熱穩(wěn)定性的同時(shí)，其酶活降低了30%~40%。酶活的降低直接導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)成本的升高，該方法并沒有真正地克服蛋白酶在食品工業(yè)生產(chǎn)的難題。
采用聚能式超聲處理蛋白酶，能有效提高其熱穩(wěn)定性，但是由于聚能式超聲能量過于集中，酶溶液溫度上升過高，從而導(dǎo)致酶活普遍下降。
逆流式超聲的特點(diǎn)在于物料流動(dòng)方向和超聲脈沖的方向相反，相比普通的聚能式超聲，具有超聲作用效率高，傳質(zhì)效果更好，能耗低，物料作用均勻，溶液溫度上升不明顯等優(yōu)點(diǎn)，更適合工業(yè)化放大生產(chǎn)，目前主要應(yīng)用于生物活性成分強(qiáng)化提取工藝。充分利用逆流式超聲上述特點(diǎn)可以有效克服聚能式超聲的不足。通過超聲處理這種物理加工方法，使得蛋白酶在保持酶活的基礎(chǔ)上提高蛋白酶熱穩(wěn)定性，還未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服已有技術(shù)存在的缺陷，提供一種能提高胰蛋白酶酶活及熱穩(wěn)定性的技術(shù)，具體為利用逆流式超聲設(shè)備處理胰蛋白酶，同時(shí)在超聲過程對酶溶液進(jìn)行控溫處理，提高胰蛋白酶熱穩(wěn)定性和酶活，使之能在較高溫度下正常使用。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，其具體的技術(shù)方案如下：
s1、逆流式超聲設(shè)備的安裝（設(shè)備結(jié)構(gòu)：聚能式超聲波探頭、超聲處理腔、蠕動(dòng)泵、恒溫器），將聚能式超聲波探頭放入超聲處理腔，探頭沒過溶液但不接觸溶液底部，超聲處理腔的進(jìn)出口與恒溫器內(nèi)部相連接，通過蠕動(dòng)泵使酶溶液定向循環(huán)流動(dòng)，酶溶液的溫度由恒溫器控制。
s2、超聲波預(yù)處理胰蛋白酶
配制胰蛋白酶溶液，加入恒溫器內(nèi)部腔體中，開動(dòng)蠕動(dòng)泵使酶液進(jìn)入超聲處理腔，開啟超聲處理酶溶液，超聲過程恒溫器溫度保持恒定（控溫范圍0~37℃），超聲完畢后于4℃冰箱，備用。
其中超聲參數(shù)設(shè)置如下：
超聲功率50~500w，超聲總時(shí)間10~30min。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明在超聲處理中采用物料控溫循環(huán)的方式，優(yōu)點(diǎn)有：
(1)超聲處理中，采用物料通過逆流式超聲處理腔，使得酶溶液受熱均勻，避免局部超聲力度過強(qiáng)，破壞酶空間結(jié)構(gòu)；也避免了聚能式超聲處理大體積物料時(shí)，效果不明顯的缺點(diǎn)；
(2)通過對超聲全過程進(jìn)行控溫處理，避免聚能式超聲使酶溶液升溫過快，導(dǎo)致酶活降低。本發(fā)明中，胰蛋白酶熱穩(wěn)定性和酶活同時(shí)得到提高，酶活最多提高了19%，熱穩(wěn)定性最多提高了42%，與在聚能式超聲處理中物料不控溫不循環(huán)方法，和在聚能式超聲處理中物料控溫不循環(huán)的方法兩種處理方式相比，胰蛋白酶活和熱穩(wěn)定性顯著上升。
附圖說明
圖1為逆流超聲設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖：1為聚能式超聲波探頭，2為超聲處理腔，3為蠕動(dòng)泵，4為恒溫器。
具體實(shí)施方式
下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
對照和實(shí)施例中酶活以及熱穩(wěn)定性測定的方法如下：
（1）酶活測定
參考國標(biāo)gb/t23527—2009附錄b。
（2）胰蛋白酶的配制
稱取0.5g胰蛋白酶，用0.001m鹽酸和0.01m氯化鈣緩沖液（ph5）定容至500ml。該酶溶液于4℃冰箱放置5h備用。
（3）熱穩(wěn)定性測定
將未處理的和超聲波處理后的胰蛋白酶溶液，置于水浴鍋溫度為70℃下保溫30min，測定該酶溶液的剩余酶活性，計(jì)算其酶活殘留率。
對照例1：
配制的胰蛋白酶于4℃冰箱放置24h，酶活為1.26×106u/g，熱穩(wěn)定性為59%。
對照例2：
將聚能式超聲探頭放入裝有胰蛋白酶溶液的燒杯中，超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，酶溶液體積50ml，不控溫，初始溫度為室溫25℃，開啟超聲設(shè)備。超聲參數(shù)設(shè)為：間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間30min，超聲功率為50w。超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為2.1×105u/g和82%。
對照例3：
將聚能式超聲探頭放入裝有胰蛋白酶溶液的燒杯中，超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，酶溶液體積300ml，不控溫，初始溫度為室溫25℃，開啟超聲設(shè)備。超聲參數(shù)設(shè)為：間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間30min，超聲功率為50w。超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為1.28×106u/g和62%。
對照例4：
將聚能式超聲探頭放入裝有胰蛋白酶溶液的燒杯中，燒杯置于恒溫器中（溫度設(shè)為0℃），超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，酶溶液體積300ml，開啟超聲設(shè)備。超聲參數(shù)設(shè)為：間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間30min，超聲功率為50w。超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為1.31×106u/g和53%。
實(shí)施例1：
s1.逆流式超聲設(shè)備的安裝
如附圖1，將聚能式超聲探頭放入超聲處理腔（50ml），探頭沒過溶液但不接觸溶液底部，超聲處理腔的進(jìn)出口與恒溫器內(nèi)部相連接，通過蠕動(dòng)泵使酶溶液定向循環(huán)流動(dòng)，酶溶液的溫度由恒溫器控制。
s2.超聲波預(yù)處理胰蛋白酶
將300ml胰蛋白酶溶液，加入恒溫器內(nèi)部腔體中，開動(dòng)蠕動(dòng)泵使酶液進(jìn)入超聲處理腔，調(diào)整高度，使聚能式超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，開啟超聲處理酶溶液（間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間30min，超聲功率為50w），超聲過程恒溫器溫度保持0℃，超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為1.48×106u/g和79%。
實(shí)施例2：
s1.逆流式超聲設(shè)備的安裝
同實(shí)施例1步驟1。
s2.超聲波預(yù)處理胰蛋白酶
將300ml胰蛋白酶溶液，加入恒溫器內(nèi)部腔體中，開動(dòng)蠕動(dòng)泵使酶液進(jìn)入超聲處理腔，調(diào)整高度，使聚能式超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，開啟超聲處理酶溶液（間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間30min，超聲功率為50w），超聲過程恒溫器溫度保持25℃，超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為1.53×106u/g和71%。
實(shí)施例3：
s1.逆流式超聲設(shè)備的安裝
同實(shí)施例1步驟1。
s2.超聲波預(yù)處理胰蛋白酶
將300ml胰蛋白酶溶液，加入恒溫器內(nèi)部腔體中，開動(dòng)蠕動(dòng)泵使酶液進(jìn)入超聲處理腔，調(diào)整高度，使聚能式超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，開啟超聲處理酶溶液（間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間15min，超聲功率為250w），超聲過程恒溫器溫度保持25℃，超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為1.62×106u/g和84%。
實(shí)施例4：
s1.逆流式超聲設(shè)備的安裝
同實(shí)施例1步驟1。
s2.超聲波預(yù)處理胰蛋白酶
將300ml胰蛋白酶溶液，加入恒溫器內(nèi)部腔體中，開動(dòng)蠕動(dòng)泵使酶液進(jìn)入超聲處理腔，調(diào)整高度，使聚能式超聲探頭沒過配制好的酶溶液2.0cm左右，開啟超聲處理酶溶液（間歇比3s﹕3s，超聲總時(shí)間10min，超聲功率為500w），超聲過程恒溫器溫度保持37℃，超聲完畢后于4℃冰箱放置24h，測定其酶活與熱穩(wěn)定性分別為1.46×106u/g和68%。
由以上對照例和實(shí)施例結(jié)果可見，對照例1是常規(guī)處理，對照例2是超聲處理，但不進(jìn)控溫處理，考察對小體積酶溶液的影響，對照例3是超聲不控溫考察對大體積酶溶液的影響，對照例4是超聲控溫0℃的影響，4個(gè)對照例均采用的是常規(guī)的聚能式超聲處理，酶活和熱穩(wěn)定性沒有同時(shí)提高，酶活和熱穩(wěn)定性只能提高一個(gè)的同時(shí)另一個(gè)降低，或均未提高；4個(gè)實(shí)施例中，均采用的是逆流式超聲設(shè)備，超聲控溫考察了對酶溶液的影響，結(jié)果可見，本發(fā)明的技術(shù)方案能同時(shí)提高酶活和熱穩(wěn)定性，效果比對照例明顯優(yōu)越。