專利名稱：重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生長因子的生物學(xué)活性測定領(lǐng)域，更具體地說涉及重組人表皮生長因子(EGF)的生物學(xué)活性測定方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人表皮生長因子(EGF)是含53個氨基酸殘基的多肽，分子量是6045道爾頓。在體內(nèi)和體外實驗中EGF通過細(xì)胞膜上的受體(表皮生長因子受體，EGFR)刺激上皮和間葉細(xì)胞殖。目前通用的重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定法采用細(xì)胞增殖法/MTT比色法 (《中國藥典》，2010年版三部，附錄第74頁)，該法依據(jù)重組人表皮生長因子對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Balb/c 3T3細(xì)胞)的生長具有刺激作用，Balb/c 3T3細(xì)胞的生長狀況因重組人表皮生長因子生物學(xué)活性的不同而異，以此檢測重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性。其測定法為Balb/c 3T3細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為每 Iml含1. OX IO5 5. OX IO5個細(xì)胞，傳代后M 36小時用于生物學(xué)活性測定。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成每Iml含5. OX IO4 8. OX IO4個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μ 1。在37°C、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。 24小時后換成維持培養(yǎng)液，置37°C、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)M小時。制備的細(xì)胞培養(yǎng)板棄去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，每孔ΙΟΟμΙ，置37°C、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)64 72小時。每孔加入MTT溶液20 μ 1，于37°C、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)5小時。以上操作在無菌條件下進行。棄去培養(yǎng)板中的液體后，向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)IOOy 1， 混勻后在酶標(biāo)儀上，以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。早在1963年，Slater就發(fā)現(xiàn)了線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶) 可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環(huán)打開，生成藍色的產(chǎn)物甲藤(formazan) 0根據(jù)這個原理，Mosmann (Mosmann T. Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods,1983, 65 55)于1983年創(chuàng)立了 MTT檢測法，此法在測定細(xì)胞的存活和增殖方面非常有效，因為這種顏色的變化僅僅發(fā)生在活的細(xì)胞中，并且甲騰的形成量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)是成比例的。目前MTT測定法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多種生長因子如表皮生長因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-2等的檢測工作中。MTT比色法受較多因素影響，如細(xì)胞數(shù)、MTT濃度及保留時間、溶解液用量，并有時存在敏感性偏低、有機溶劑產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀及產(chǎn)物的溶解度偏低等一些問題。MTT比色法從樣品加入開始，試驗周期至少為4天，試驗中需保持無菌環(huán)境。鑒于生物測定方法繁瑣、實驗周期長、準(zhǔn)確度差、誤差大(劉蘭等，中國生物制品學(xué)雜志，2002;15C3) :175-176)、耗費大量人力、物力，因此在今后藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中生物測定將逐漸被先進的理化方法、或能保證臨床用藥安全有效的其它方法所取代，或只存在于生產(chǎn)研究階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，針對傳統(tǒng)的MTT比色法中存在的上述不足，開發(fā)出競爭性抑制的流式細(xì)胞方法，用來檢測表皮生長因子(EGF)與表皮生長因子受體(EGFR)的結(jié)合活性。除預(yù)先培養(yǎng)細(xì)胞外，從樣品加入開始，試驗周期僅為1天，試驗過程中無需無菌環(huán)境，下面是其試驗原理EGF和抗表皮生長因子受體的單克隆抗體可以競爭性結(jié)合EGFR，通過抗體阻斷 EGF和其受體的結(jié)合來間接測定EGF與EGFR結(jié)合的生物學(xué)活性?？谷吮砥どL因子受體單克隆抗體流式細(xì)胞法生物學(xué)活性測定原理在檢測體系中加入熒光素標(biāo)記的異硫氰酸的第二單抗，通過間接免疫熒光法來測定第二單抗-原單克隆抗體-EGFR結(jié)合物的熒光強度。熒光強度的高低反應(yīng)了抗體濃度的變化，結(jié)果的計算可以通過四參數(shù)曲線分析(S形曲線)，求出半數(shù)有效結(jié)合濃度(EC5tl),與參考品比較計算抗體濃度相對生物學(xué)活性的百分比(根據(jù)《中國藥典》，2010年版，二部附錄生物檢定法中量反應(yīng)平行線原理推定樣品和參考品的S形曲線具有相同的最大值、最小值和斜率)?；緱l件Guava Easycyte Mini Flow Cytometer 流式細(xì)胞儀。采用 CytoSoft 4. 1軟件中的Guava ExpressPlus程序。選定特定細(xì)胞群(EGFR表達較好的細(xì)胞群)作為計數(shù)對象。試驗過程并不發(fā)生活體細(xì)胞的凋亡或增殖抑制，測定過程不需要無菌環(huán)境，與免疫熒光相比，可以進行定量測定(EC5tl)。根據(jù)上述單抗生物學(xué)活性測定原理，可以設(shè)計采用飽和濃度的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體與不同濃度的重組人表皮生長因子一起競爭性結(jié)合腫瘤細(xì)胞膜表面的 EGFR，然后加入一個熒光素標(biāo)記的第二單抗與細(xì)胞膜表面上的上述單抗結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上采用特定的程序和選擇特定的細(xì)胞區(qū)域獲得各個樣品的平均熒光強度值，試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序GraphPad Prism軟件(四參數(shù)回歸)進行處理，分別獲得EGF標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)有效抑制濃度(EC5tl),從而獲得EGF樣品相對于EGF標(biāo)準(zhǔn)品的相對生物學(xué)活性。根據(jù)EGF標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性(IU/mL)，可計算出EGF樣品的生物學(xué)活性。本發(fā)明與《中國藥典》中的重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定法相比，本發(fā)明的測定方法實施更方便(除預(yù)先培養(yǎng)細(xì)胞外，一天即可完成試驗，試驗過程中無需無菌環(huán)境； 藥典方法至少需要四天，且試驗過程需無菌環(huán)境)，質(zhì)量更可控。本發(fā)明的目的是提供一種重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法，采用抗人表皮生長因子受體單克隆抗體與不同濃度的重組人表皮生長因子的混合物競爭性結(jié)合特定腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞膜表面的表皮生長因子受體，在流式細(xì)胞儀上采用特定的程序和選擇特定的細(xì)胞區(qū)域獲得各個樣品的平均熒光強度值。本發(fā)明是通過下面的技術(shù)方案實現(xiàn)的一種重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法，其步驟包括1)、在適合的條件下培養(yǎng)特定腫瘤細(xì)胞(檢測細(xì)胞)；2)、將EGF樣品和EGF標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到飽和濃度的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體中，與1)中的特定腫瘤細(xì)胞反應(yīng)；3)、離心倒掉上清液，重新懸浮細(xì)胞，加入一個熒光素標(biāo)記的第二單抗，反應(yīng)15-60 分鐘；4)、檢測細(xì)胞平均熒光強度，通過數(shù)據(jù)處理計算EGF樣品生物學(xué)活性。所述步驟1)中的特定腫瘤細(xì)胞為中度或高度表達表皮生長因子受體的人細(xì)胞， 所述特定腫瘤細(xì)胞用PBS調(diào)整后的懸濁液的濃度為7X106個/mL。所述的特定腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人肺腺癌細(xì)胞H-125細(xì)胞系、A431、DiFi的任意一種； 更優(yōu)選為人肺腺癌細(xì)胞H-125細(xì)胞系。所述步驟幻中的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體可以是尼妥珠單抗或西妥昔單抗；所采用的抗體濃度為50ug/mL，不同濃度的EGF稀釋液為25ug/mL向下倍比稀釋10 個稀釋度。所述步驟3)中的反應(yīng)時間優(yōu)選為30分鐘。所述步驟4)為離心倒掉上清液，重新懸浮細(xì)胞，加入一定量的1 %多聚甲醛PBS， 在流式細(xì)胞儀上采用特定的程序和選擇特定的細(xì)胞區(qū)域獲得各個樣品的平均熒光強度值， 試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序GraphPad Prism軟件(四參數(shù)回歸)進行處理，分別獲得EGF標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)有效抑制濃度(EC5tl)，從而獲得EGF樣品相對于EGF標(biāo)準(zhǔn)品的相對生物學(xué)活性。根據(jù)EGF標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性(IU/mL)，可獲得EGF樣品的生物學(xué)活性(IU/mL)。本發(fā)明同時提供了重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法在重組人表皮生長因子或其衍生物質(zhì)控中的應(yīng)用。重組產(chǎn)品生物學(xué)活性是質(zhì)控中重要的檢測指標(biāo)，以確保產(chǎn)品具有穩(wěn)定的生物活性。本發(fā)明是根據(jù)重組人表皮生長因子(EGF)可與抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體競爭性結(jié)合EGFR，在具有飽和濃度的單抗的前提下，EGF競爭性抑制單抗與EGFR結(jié)合， 呈劑量依賴性(四參數(shù)回歸，反S形曲線)，根據(jù)半數(shù)有效抑制濃度(EC5tl)的比較，可以計算出EGF樣品相對于EGF標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性。本發(fā)明采用競爭抑制的流式細(xì)胞法測定重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性具有步驟簡便、準(zhǔn)確度高、質(zhì)量更可控等優(yōu)點。


圖1、EGF樣品與EGF標(biāo)準(zhǔn)品的量效曲線圖2、70% R-100% R-150% R流式細(xì)胞法驗證第一次試驗四參數(shù)曲線(尼妥珠單抗)圖3、EGF組分1與EGF組分2的量效曲線
具體實施例方式以下是本發(fā)明的非限定實施例，將有利于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明。實施例1重組人表皮生長因子活性測定方法采用人肺腺癌細(xì)胞H-125細(xì)胞系(來自古巴分子免疫學(xué)中心)測定EGF活性的方法包括如下步驟(1)細(xì)胞培養(yǎng)實驗室培養(yǎng)一定量的H-125細(xì)胞，細(xì)胞活力一般應(yīng)不小于70 %。4°C、 IlOOrpm下離心5分鐘。小心倒掉上清液，利用剩余的少量液體將細(xì)胞沉淀溶解，然后緩慢加入IOmL左右PBS，混勻。再次在4°C、1 IOOrpm下離心5分鐘，小心倒掉上清液，利用剩余的少量液體將細(xì)胞沉淀溶解，緩慢加入IOmL左右PBS，混勻。4°C、1 IOOrpm下離心5分鐘后， 小心倒掉上清液，利用剩余的少量液體將細(xì)胞沉淀溶解，用PBS調(diào)整H-125細(xì)胞系的細(xì)胞懸濁液至濃度為5X106 IOXlO6個/mL。(2)制備50 μ g/mL和100 μ g/mL的尼妥珠單抗溶液，用100 μ g/mL的尼妥珠單抗溶液將50 μ g/mL的EGF樣品或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至25 μ g/mL EGF (含50ug/mL尼妥珠單抗)，然后用50ug/mL尼妥珠單抗溶液向下倍比稀釋10個稀釋度。(3)各離心管加入20 μ L相對應(yīng)的樣品溶液50ug/mL尼妥珠單抗溶液、25 μ g/mL EGF(含50ug/mL尼妥珠單抗)以及其向下的10個倍比稀釋液。4°C、IlOOrpm下離心1分鐘，4°C下待用(待用時間小于4小時)。(4)向已有20μ L樣品溶液的離心管中加入25μ L細(xì)胞懸濁液，用槍頭重復(fù)吸取混勻。4 °C下保溫30分鐘。(5)向每個離心管中加入700 μ LPBS，4°C、IlOOrpm下離心4分鐘。(6)小心去除上清液，在旋渦振蕩器上輕輕振蕩。向每個離心管中加入20μ L抗人FITC(DAK0 F0056)稀釋溶液(稀釋比1 30)，用槍頭重復(fù)吸取混勻。4°C下保溫30分鐘。(7)向每個離心管中加入700 μ LPBS，4°C、IlOOrpm下離心4分鐘。(8)小心去除上清液，在旋渦振蕩器上輕輕振蕩。然后向每個管中加入500yL 多聚甲醛PBS。用H-125細(xì)胞系的特定程序(Guava Express Plus)讀取流式細(xì)胞儀中
樣品的數(shù)據(jù)(所選定區(qū)域的平均熒光強度)。(9)數(shù)據(jù)處理采用計算機程序(四參數(shù)回歸)進行處理，然后分別獲得EGF標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)有效抑制濃度(EC5tl)，從而獲得EGF樣品相對于EGF標(biāo)準(zhǔn)品的相對生物學(xué)活性。其量效曲線見圖1。優(yōu)選的是步驟(1)中細(xì)胞懸濁液的濃度為7xl06個/mL。進一步優(yōu)選的是步驟(3)與EGF競爭抑制EGFR的初始飽和尼妥珠單抗?jié)舛葹?50 μ g/mL。進一步優(yōu)選的是，步驟(9)中包括利用GraphPad Prism軟件(四參數(shù)回歸)進行處理，根據(jù)2010年版中國藥典二部附錄生物檢定法中量反應(yīng)平行線原理推定EGF樣品與 EGF標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的最大值、最小值和斜率，然后分別獲得EGF標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)有效抑制濃度(EC5tl) (EC50與生物學(xué)活性成反比)，從而獲得EGF樣品相對于EGF標(biāo)準(zhǔn)品的相對生物學(xué)活性，根據(jù)EGF標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性(IU/mL)，可計算出EGF樣品的生物學(xué)活性(IU/ mL) ο實施例2流式細(xì)胞法測定表皮生長因子生物學(xué)活性的可重復(fù)性使用相同流式細(xì)胞法測定尼妥珠單抗相對生物學(xué)結(jié)合活性的方法學(xué)驗證中采用人肺腺癌細(xì)胞H-125細(xì)胞系(來自古巴分子免疫中心)測定尼妥珠單抗相對生物學(xué)活性的方法包括如下步驟
(1)制備50 μ g/mL尼妥珠單抗參考品稀釋液和樣品稀釋液，然后用單抗稀釋液向下稀釋8個稀釋度至0. 050 μ g/mL ；(2)各離心管加入20 μ L不同濃度的的參考品稀釋液和樣品稀釋液，后續(xù)步驟同實施例1 ；(3)數(shù)據(jù)處理采用計算機程序(四參數(shù)回歸)進行處理，然后分別獲得尼妥珠單抗參考品和樣品的半數(shù)有效結(jié)合濃度(EC5tl)，從而獲得尼妥珠單抗樣品相對于尼妥珠單抗參考品的相對生物學(xué)活性。在該流式細(xì)胞儀法測定生物學(xué)活性的方法學(xué)驗證中(1)準(zhǔn)確性使用參考品自身為對照，測定70% RU50% R和100% R時相對于參考品R的生物學(xué)活性，相對誤差絕對值應(yīng)不大于10%。
權(quán)利要求
1.一種重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定方法，采用抗人表皮生長因子受體單克隆抗體與重組人表皮生長因子一起競爭性結(jié)合特定細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的表皮生長因子受體， 在流式細(xì)胞儀上采用特定的程序和選擇特定的細(xì)胞區(qū)域獲得各個樣品的平均熒光強度值， 其特征在于，該方法包含如下步驟1)、在適合的條件下培養(yǎng)特定腫瘤細(xì)胞；2)、將EGF樣品和EGF標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到飽和濃度的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體中，與1)中的細(xì)胞反應(yīng)；3)、離心倒掉上清液，重新懸浮細(xì)胞，加入一個熒光素標(biāo)記的第二單抗，反應(yīng)15-60分鐘；4)、檢測細(xì)胞平均熒光強度，通過數(shù)據(jù)處理計算EGF樣品生物學(xué)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟1)中的特定腫瘤細(xì)胞為中度或高度表達表皮生長因子受體的人細(xì)胞；所述特定腫瘤細(xì)胞用PBS調(diào)整后的懸濁液的濃度為7X106個/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于， 所述的特定腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人肺腺癌細(xì)胞H-125細(xì)胞系、A431、DiFi的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于， 所述的特定腫瘤細(xì)胞更優(yōu)選為人肺腺癌細(xì)胞H-125細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于， 所述步驟幻中的抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體可以是尼妥珠單抗或西妥昔單抗； 所采用的尼妥珠單抗抗體濃度優(yōu)選為50ug/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于， 所述步驟3)中的反應(yīng)時間優(yōu)選為30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定方法，其特征在于所述步驟4)為離心倒掉上清液，重新懸浮細(xì)胞，加入一定量的多聚甲醛PBS，在流式細(xì)胞儀上采用特定的程序和選擇特定的細(xì)胞區(qū)域獲得各個樣品的平均熒光強度值，試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序GraphPad Prism軟件(四參數(shù)回歸)進行處理，分別獲得EGF標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)有效濃度(EC5tl)，從而獲得EGF樣品相對于EGF標(biāo)準(zhǔn)品的相對生物學(xué)活性，根據(jù)EGF 標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性(IU/mL)，可獲得EGF樣品的生物學(xué)活性(IU/mL)。
8.權(quán)利要求1-7任一所述的重組人表皮生長因子的生物學(xué)活性測定方法在重組人表皮生長因子或其衍生物質(zhì)控中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組人表皮生長因子(rhEGF)的生物學(xué)活性測定方法及其應(yīng)用。該方法采用競爭性抑制的流式細(xì)胞法，通過抗體阻斷EGF和其受體的結(jié)合來間接測定EGF與EGFR結(jié)合的生物學(xué)活性，采用計算機程序(四參數(shù)回歸)處理試驗數(shù)據(jù)，分別獲得EGF標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)有效抑制濃度(EC50)，從而獲得EGF樣品的相對生物學(xué)活性，根據(jù)EGF標(biāo)準(zhǔn)品的生物學(xué)活性(IU/mL)，可計算出EGF樣品的生物學(xué)活性。本發(fā)明除預(yù)先培養(yǎng)細(xì)胞外，從樣品加入開始，試驗周期僅為1天，試驗過程中無需無菌環(huán)境，與《中國藥典》中的重組人表皮生長因子生物學(xué)活性測定方法相比，實施更方便，質(zhì)量更可控。
文檔編號G01N33/577GK102262155SQ20111009060
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者何偉, 喻志愛, 李先鐘, 林峰, 白先宏 申請人:百泰生物藥業(yè)有限公司