本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1，并進(jìn)一步公開其克隆與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高等植物生命周期主要包括種子萌發(fā)、營養(yǎng)器官生長、開花、受精、胚胎發(fā)育和種子形成等過程。其中，開花過程涉及由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)換、花器官的發(fā)生，以及在環(huán)境因子作用下內(nèi)部各種信號的產(chǎn)生、傳遞和相互作用等，在植物生命周期中占有中心地位，并與農(nóng)作物產(chǎn)量以及品質(zhì)密切相關(guān)。

開花誘導(dǎo)即植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換的過程，它受內(nèi)源發(fā)育信號和環(huán)境因子的嚴(yán)格控制，開花誘導(dǎo)由一種復(fù)雜的信號途徑“網(wǎng)絡(luò)”形成，是一個非常復(fù)雜的過程。根據(jù)近年來對擬南芥、金魚草、玉米等幾種模式植物的開花調(diào)控信號途徑的研究，尤其是對擬南芥的研究，提出影響植物的生長發(fā)育及開花的4個主要的生物學(xué)途徑調(diào)控，包括自主調(diào)控途徑

(autonomouspathway)、春化途徑(vernalization)、ga調(diào)控途徑(gibberellicacid)和光周期調(diào)控途徑(photoperiod)。其中自主調(diào)控途徑和ga調(diào)控途徑為植物主要內(nèi)在調(diào)控因素，而春化途徑和光周期調(diào)控途徑則是外界主要的調(diào)控因素。

ft(floweringlocust)基因是花期調(diào)控途徑中的關(guān)鍵基因。它位于花發(fā)育途徑中的匯集點，整合來自光周期途徑、春化途徑和自主途徑等不同花發(fā)育途徑的信號，在植物花發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。ft蛋白是成花素的主要組成部分，在不同的開花遺傳途徑中，上游關(guān)鍵基因調(diào)控ft基因，使ft蛋白從韌皮部移動到莖頂端分生組織(sam)，與帶堿性亮氨酸拉鏈蛋白(basicregion-leucinezipper，b-zip)轉(zhuǎn)錄因子fd(floweringlocusd)在莖尖通過蛋白質(zhì)的相互作用來促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變，并通過轉(zhuǎn)錄激活花分生組織特性基因ap1(apetala1)來啟動花發(fā)育過程。

擬南芥的ft基因?qū)儆趂t/tfl1基因家族，又稱為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingprotein，pebp)基因家族，因其蛋白易與磷脂酰乙醇胺結(jié)合而得名。擬南芥ft基因受到光周期調(diào)控，ft突變體長日照環(huán)境下延遲植物開花(kobayashiy,kayah,gotok,etal.1999.apairofrelatedgeneswithantagonisticrolesinmediatingfloweringsignals.science286,1960-1962.)。ft同源基因ptft1轉(zhuǎn)基因楊樹在很短時間即可表現(xiàn)出開花表型，同時還能夠可以抵制短日照條件下誘導(dǎo)的生長停止和芽休眠的現(xiàn)象的發(fā)生(bohleniush,huangt,charbonnel-campaal,etal.2006.co/ftregulatorymodulecontrolstimingoffloweringandseasonalgrowthcessationintrees.science312,1040-43.)。楊樹ft2也被證明具有促進(jìn)開花的作用，同時受到光周期的調(diào)控而調(diào)控楊樹季節(jié)性開花的功能(hsucy,liuy,luthedsetal.2006.poplarft2shortensthejuvenilephaseandpromotesseasonalflowering.theplantcell18,1846-1861.)。西紅柿ft同源基因sft調(diào)控多個不同的發(fā)育過程，比如開花轉(zhuǎn)變、葉片的成熟、莖的伸長等(shalita,rozmana,goldshmidta,etal.2009.thefloweringhormoneflorigenfunctionsasageneralsystemicregulatorofgrowthandtermination.proc.nati.acad.sci.usa.106,8392-8397.)。美洲黑楊(populusdeltoides)中pdft1和pdft2因具有不同表達(dá)模式推測具有不同生物學(xué)功能(igasakit,watanabey,nishiguchim,etal.2008.thefloweringlocust/terminalflower1familyinlombardypoplar.plantandcellphysiology49,291-300.)。在梨樹中，根據(jù)表達(dá)分析推測pcft1具有促進(jìn)開花的功能，而pcft2則可能調(diào)控梨樹的葉片的衰老和芽的休眠。過表達(dá)pcft2基因在煙草中能夠引起煙草早花表型的產(chǎn)生，嫁接研究表明pcft2蛋白具有可移動性。然而轉(zhuǎn)pcft2基因的梨樹卻不能表現(xiàn)早花表型，而是在延遲因短日照和低溫引起的葉片脫落和芽的休眠(freimana,golobovitchs,yablovitzz,etal.2015.expressionoffloweringlocust2transgenefrompyruscommunisl.delaysdormancyandleafsenescenceinmalus×domesticaborkh,andcausesearlyfloweringintobacco.plantscience241,164-176.)。甜菜中bvft1行使開花抑制功能，其表達(dá)受到春化處理的抑制，而bvft2則為開花促進(jìn)者(pinpa,benllochr,bonnetd,etal.2010.anantagonisticpairoffthomologsmediatesthecontroloffloweringtimeinsugarbeet.science330,1397-1400.)?？梢?，ft不僅在成花轉(zhuǎn)變過程中起重要作用，而且還參與調(diào)節(jié)生長發(fā)育的一些過程。

天然橡膠一直是我國重要的戰(zhàn)略物資和儲備資源，目前在我國，橡膠樹新品種的選育仍然是以傳統(tǒng)的人工授粉育種為主。由于橡膠樹生長緩慢，從胚后發(fā)育的童期到開花需要5-8年時間，而且有些性狀只有在成年期才能表現(xiàn)出來，這將嚴(yán)重阻礙橡膠樹育種的進(jìn)程。目前，對橡膠樹尤其是巴西橡膠樹的成花機(jī)理與相關(guān)基因克隆和功能研究還未見報道。對橡膠樹開化調(diào)控基因的克隆及其生物學(xué)功能的研究和探索，明確其在橡膠樹開花轉(zhuǎn)變過程中的作用，為利用分子育種技術(shù)加快橡膠樹新品的培育奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1，并進(jìn)一步公開其克隆與應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1，所述基因hbft1的cdna包括如seqidno：1所示的核苷酸序列。

所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1，所述基因hbft1的cdna核苷酸序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明還公開了一種所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1編碼的蛋白，包括如seqidno：2所示的氨基酸序列。

具體的，所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1編碼的蛋白，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明還公開了一種橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1，所述基因hbft1的基因組dna包括如seqidno：3所示的核苷酸序列。

所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1，所述基因hbft1的基因組dna核苷酸序列如seqidno：3所示。

本發(fā)明還公開了一種含有所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1的重組植物表達(dá)載體，所述載體為重組質(zhì)粒pxcs-hbft1。

所述重組植物表達(dá)載體中的載體為pmd19-t載體。

本發(fā)明還公開了一種克隆所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1的方法，包括如下步驟：

(1)以巴西橡膠樹的葉片和花序cdna混合為模板，設(shè)計如下引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得hbtf1基因開放閱讀框；

hbft1of：ggaattcatgcctagtgacagag；

hbft1or：ccccccggggcatcttcttcc；

(2)以hbtf1基因開放閱讀框為基礎(chǔ)，設(shè)計如下引起合成5’utr及3’utr；

hbft1-5uf：gtaaaagctggatacctcaggctcc；

hbft1-5ur：caccaacatgaaccctaggttggtt；

hbft1-gsp3^1st：gtgagcgacatccctggaaca；

hbft1-gsp3^2nd：cgaagacagacaatcaacccacc；

(3)根據(jù)5’utr和3’utr的獲得，設(shè)計如下特異引物，進(jìn)行目標(biāo)基因hbft1全長的擴(kuò)增；

hbft1-f：gtaaaagctggatacctcaggctccaaac；

hbft1-r：atggggtcaaatgtggtagaaaaat。

本發(fā)明還公開了所述的橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1用于制備促進(jìn)橡膠樹提前開花的促進(jìn)劑的應(yīng)用。

本發(fā)明首次在巴西橡膠樹中獲得橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1的全長cdna，并通過橡膠樹hbft1基因組織特異性表達(dá)分析，hbft1基因在穩(wěn)定葉、開花的雄花和雌花中表達(dá)，但表達(dá)量都比較低，且在不同齡樹的穩(wěn)定葉中其表達(dá)量隨年齡的增加而升高，在主花期3-5月表達(dá)量極低，但到9-10月份表達(dá)達(dá)到高峰期。

本發(fā)明通過對擬南芥野生型遺傳轉(zhuǎn)化表明，hbft1基因的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出過度早花表型，并伴有終端花序的形成。同時，該基因在ft-10突變體擬南芥中過表達(dá)，ft-10突變表型皆能被有效地恢復(fù)為野生型表型，甚至一些開花比野生型植株還要早。這些結(jié)果均表明hbft1同源基因有很大的潛力行使ft同源基因的功能。因此該基因可作為巴西橡膠樹非常有用的開花調(diào)控候選基因，可通過功能獲得突變或者功能缺失突變研究實現(xiàn)對橡膠樹開花的有效調(diào)控。

附圖說明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中，

圖1為hbft1基因的組織特異性表達(dá)分析(10齡樹根，莖，古銅葉，變色葉，淡綠葉，穩(wěn)定葉，芽，第一發(fā)育階段的花序，開花的雄花，開花的雌花，果皮及種子)；

圖2為hbft1基因在兩個不同樹齡橡膠樹不同季節(jié)的表達(dá)模式；

圖3為不同光周期對hbft1基因表達(dá)的影響；

圖4為不同溫度對hbft1基因表達(dá)的影響；

圖5為橡膠樹hbft1基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥的功能驗證；

圖6為hbft1基因?qū)t-10突變體表型恢復(fù)驗證實驗。

具體實施方式

下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實施例1巴西橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1的獲得

分析已在ncbi登陸的擬南芥、蓖麻的ft基因的cdna序列，通過搜索建立的橡膠樹葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過同源比對的方式獲得的片段信息，然后進(jìn)行拼接，再預(yù)測開放閱讀并設(shè)計特異引物獲得包含有完整開放閱讀框的dna序列和cdna序列。具體方法如下：

(1)hbtf1基因開放閱讀框的獲得

基因特異性引物設(shè)計如下：

hbft1of：ggaattcatgcctagtgacagag；

hbft1or：ccccccggggcatcttcttcc。

以巴西橡膠樹熱研7-33-97(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育)葉片和花序cdna混合為模板(以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得)，以hbft1of和hbft1or為引物，其終濃度為0.4μmol/l，在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃終延伸10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pmd19-t載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌eha105中并測序。最后，獲得hbft1的完整開放閱讀框。

(2)5’及3’端utr

按照smarttmcdnalibraryconstructionkit說明書進(jìn)行構(gòu)建racecdna文庫(試劑盒購自clontech公司)，5’utr通過5’race獲得，所用的接頭引物共有3條，分別為：

qt：

ccagtgagcagagtgacgaggactcgagctcaagcttttttttttttttt；

q1：gaggactcgagctcaagc；和

q0：ccagtgagcagagtgacg。

5’race操作流程參照文獻(xiàn)(迪芬巴赫cw，德維克斯勒gr.pcr技術(shù)實驗指南.黃培堂譯.北京:科學(xué)出版社,1998:268-277)。根據(jù)hbft1的cdna序列設(shè)計2條引物分別為：

hbft1-5uf：gtaaaagctggatacctcaggctcc；

hbft1-5ur：caccaacatgaaccctaggttggtt。

具體擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃終延伸10min。

hbft1的3’utr通過3’race獲得：所用的接頭引物與5’race用到的3個接頭引物一樣，同時3’race操作流程也是參照文獻(xiàn)(迪芬巴赫cw，德維克斯勒gr.pcr技術(shù)實驗指南.黃培堂譯.北京:科學(xué)出版社,1998:268-277)。先用qt引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄程序按反轉(zhuǎn)錄照說明書進(jìn)行。之后分別以如下hbft1基因的gsp3^1st和q0為引物分別進(jìn)行3組第一輪pcr，之后分別以50倍稀釋pcr產(chǎn)物作為第二輪pcr的模版。進(jìn)行第二輪pcr時，再分別以這2個基因的如下gsp3^2nd和q1組合為引物對進(jìn)行第二輪pcr，產(chǎn)物通過電泳挖膠獲得；

hbft1-gsp3^1st：gtgagcgacatccctggaaca；

hbft1-gsp3^2nd：cgaagacagacaatcaacccacc；

擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃終延伸10min。5’及3’端race產(chǎn)物分別為122bp和113bp，產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，并進(jìn)行克隆測序。

(3)hbft1基因全長的克隆

根據(jù)5’和3’utr的獲得，再次設(shè)計能夠擴(kuò)增全長的特異引物：

hbft1-f：gtaaaagctggatacctcaggctccaaac；

hbft1-r：atggggtcaaatgtggtagaaaaat。

以橡膠樹葉片和花序cdna混合為模版，進(jìn)行目標(biāo)基因hbft1全長的擴(kuò)增。

擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃終延伸10min。獲得的pcr產(chǎn)物與pmd19-t連接并進(jìn)行測序，測序表明上述獲得的片段即為本發(fā)明所需的橡膠樹開花調(diào)控基因，記為hbft1，該片段具有序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列，其全長為763個核苷酸，包含一個長度為528個核苷酸的開放閱讀框(orf，自序列1的5＇端第123-650位核苷酸序列)、122個核苷酸的5’-utr(自序列1的5’端第1-122位核苷酸序列)和113個核苷酸的3’-utr(自序列1的5’端第651-763位核苷酸序列)，該基因編碼一個長度為118個氨基酸(見序列表中seqidno：2)。

同時以巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增(程序同上所述)，測序結(jié)果表明獲得橡膠樹開花基因的基因組dna序列，該序列具有序列表中seqidno：3的核苷酸序列，共2692個核苷酸，包含了三個長度分別為144、1181和604個核苷酸的內(nèi)含子(自序列3的5’端第323-466、529-1709和1751-2354位核苷酸序列)。

實施例2橡膠樹hbft1基因組織特異性表達(dá)分析

本研究選取3月份采集的橡膠樹7-33-97的10齡樹的各個營養(yǎng)組織和繁殖器官(包括根、莖、古銅葉、變色葉、淡綠葉、變色葉、穩(wěn)定葉、芽、第一發(fā)育階段的花序、開花的雄花、開花的雌花)和8月份采集的果皮和種子，分別提取它們的rna備用。

對上述所獲得的rna進(jìn)過dnasei消化后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。通過熒光定量技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)基因組織特異性表達(dá)分析。

定量引物為：

hbft1-qf：tacacatcaacggtacacaccagtc；

hbft1-qr：ccaaaacatcccctatcacacg。

如圖1所示的結(jié)果顯示，hbft1基因只在穩(wěn)定葉、開花的雄花和雌花中有低量表達(dá)。

實施例3hbft1基因在兩個不同樹齡橡膠樹不同季節(jié)的表達(dá)模式

以2齡樹和10齡樹的穩(wěn)定葉為研究對象，從3月份開始采集材料，每個月采集一次，直至11月份為止。之后對hbft1基因進(jìn)行熒光定量分析，定量引物同前述組織特異性表達(dá)分析引物。

如圖2所示結(jié)果顯示，hbft1基因在兩個不同樹齡橡膠樹中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，在3到6月份之間，hbft1基因表達(dá)量一直都很低，從7月份開始，兩個樹齡穩(wěn)定葉中的hbft1表達(dá)量開始逐漸升高，其中10齡樹穩(wěn)定葉中的hbft1表達(dá)量在9月份最高，而2齡樹穩(wěn)定葉中的hbft1表達(dá)量則在10月份表現(xiàn)出最高。然后，兩樹齡樹中hbft1表達(dá)量逐漸降低直至11月份，此時，hbft1基因表達(dá)量再次回到最低。更為重要的是，hbft1基因在10齡樹中的表達(dá)量幾乎都比2齡樹中的要高。

實施例4不同光周期對hbft1基因表達(dá)的影響

將長勢一樣的40株3個月大的小苗平均分成兩組，每組20株。其中一組培養(yǎng)在28℃長日照環(huán)境(16h光照/8h黑暗)；另外一組則培養(yǎng)在28℃短日照環(huán)境(8h光照/16h黑暗)。在兩種環(huán)境下培養(yǎng)30天后，兩組植株的葉片分別在一天之內(nèi)(24h)每兩個小時采集一次，一共采集12次。熒光定量分析同上。

如圖3所示結(jié)果顯示，hbft1基因在短日照環(huán)境下的表達(dá)量明顯高于長日照環(huán)境下的表達(dá)量。在短日照環(huán)境下，hbft1基因從早上8點到晚上凌晨12點都表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的表達(dá)水平(除了中午12點時出現(xiàn)一個表達(dá)峰以外)，凌晨12點以后，其表達(dá)水平逐漸升高，在早上6點鐘表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平，然后又開始降低直至早上8點。在長日照環(huán)境下，hbft1基因雖然表達(dá)很低但亦表現(xiàn)出一些小的表達(dá)波動現(xiàn)象。

實施例5不同溫度對hbft1基因表達(dá)的影響

將40株3個月大的小苗平均分成兩組，每組20株。第一組植株種植在一個培養(yǎng)箱，里面設(shè)定28℃、32℃和36℃三個溫度時段；另外一組則培養(yǎng)在另外一個培養(yǎng)箱里，里面分別設(shè)定28℃、24℃、20℃、16℃和8℃五個溫度時段。每個溫度持續(xù)3天，然后依次調(diào)到下一個溫度。為了避免光周期和生物鐘可能對hbft1表達(dá)的影響，統(tǒng)一在每天早上10點準(zhǔn)時采樣。

如圖4所示的結(jié)果顯示，在28℃時，hbft1基因表達(dá)量達(dá)到最高，當(dāng)溫度高于或者低于28℃時，其表達(dá)量會受到抑制，由此說明，28℃是橡膠樹hbft1基因表達(dá)的最適合的誘導(dǎo)溫度。

實施例6橡膠樹hbft1基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥的功能驗證

利用pxcs植物表達(dá)載體(由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所保存)與hbft1基因連接構(gòu)建轉(zhuǎn)化擬南芥野生型轉(zhuǎn)化載體。具體實施方案如下：

分別設(shè)計構(gòu)建植物表達(dá)載體的目標(biāo)基因的引物：所用到的用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的引物即為實施例1中所述基因的特異引物，其中基因的正引物5’端分別加有ecori酶切位點，反引物5’端分別加有xmai酶切位點。獲得的pcr產(chǎn)物與pmd19-t載體連接并進(jìn)行測序。最后，提取測序正確的質(zhì)粒，用ecori和xmai分別雙酶切pxcs和測序正確的質(zhì)粒，通過t4dna連接酶構(gòu)建hbft1目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體，并命名為pxcs-hbft1。

對于野生型擬南芥的侵染，參照文獻(xiàn)(cloughsjandbentaf.1998.floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj16,735-743.)獲得的t0代種子，先將其用自來水浸泡，并放置于4℃環(huán)境暗室里春化3天。之后播撒在經(jīng)1/2m培養(yǎng)基浸泡過的蛭石上面于22℃長日照環(huán)境生長(16h/8h)，待小苗發(fā)芽時，用濃度為10mg/l的除草劑進(jìn)行噴灑，以便篩選抗性植株。10天后，將生長正常的小苗移栽到營養(yǎng)土(營養(yǎng)土：蛭石＝2：1)中生長并等待收種。陽性植株的檢測通過southern方法，此方法參照文獻(xiàn)(blancg,baptistec,oliverg,martinf,montorop.2006.efficientagrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofembryogeniccalliandregenerationofheveabrasiliensismüllarg.plants.plantcellrep2006,24,724-733)。

將基因t3代轉(zhuǎn)基因植株分別和野生型在相同環(huán)境中培養(yǎng)，并比較對它們進(jìn)行開花表型比較，結(jié)果見圖5及表1。

表135s::hbft1的野生型轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對照開花比較

*表示0.01<p<0.05；**表示p<0.01.

結(jié)果顯示，所有35s::hbft1/wt的野生型轉(zhuǎn)基因株系都能表現(xiàn)出不同程度的早花表型，野生型植株25天左右開花，而轉(zhuǎn)基因株系在17-19天開花，開花時間和輪座葉數(shù)目確實比野生型的要少。除了葉片比較小和植株比較矮以外，與野生型擬南芥表型相似，都表現(xiàn)出正常的花序表型。

實施例7hbft1基因?qū)t-10突變體表型恢復(fù)驗證實驗

將構(gòu)建好的hbft1目標(biāo)基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥ft-10突變體中，參照文獻(xiàn)(clough，s.j.andbent，a.f.(1998)floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.16:735-743.)。獲得的t0代種子，先將其用自來水浸泡，并放置于4℃環(huán)境暗室里春化3天。之后播撒在經(jīng)1/2m培養(yǎng)基浸泡過的蛭石上面于22℃長日照環(huán)境生長(16h/8h)，待小苗發(fā)芽時，用濃度為10mg/l的除草劑進(jìn)行噴灑，以便篩選抗性植株。10天后，將生長正常的小苗移栽到營養(yǎng)土(營養(yǎng)土：蛭石＝2：1)中生長并等待收種。

ft-10突變體轉(zhuǎn)基因植株分別和野生型、ft-10突變體植株在相同環(huán)境中培養(yǎng)，并分別比較它們和野生型，ft-10突變體植株的開花表型，結(jié)果見圖6和下表2。

表235s::hbft1的ft-10突變體轉(zhuǎn)基因擬南芥和ft-10突變體以及野生型開花比較

*表示0.01<p<0.05；**表示p<0.01.

結(jié)果顯示，ft-10突變體植株開花時間為42天左右，而ft-10突變體轉(zhuǎn)基因植株都不同程度的出現(xiàn)了比ft-10突變體更早的早花表型，且選取的6株35s::hbft1/ft-10轉(zhuǎn)基因株系甚至表現(xiàn)出比野生型擬南芥還要早的開花表型并長出更少的輪座葉和莖上葉。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。

序列表

<110>中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所

<120>一種橡膠樹開花調(diào)控基因hbft1及其克隆與應(yīng)用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>763

<212>cdna

<213>橡膠樹屬橡膠

<400>1

gtaaaagctggatacctcaggctccaaacaatatatatatacatgcctgtatgtcattga60

attctacacatcaacggtacacaccagtccactactagctagtgcttctcatagttagaa120

aaatgcctagtgacagagatcctcttgctattgggcgtgtgataggggatgttttggacc180

ctttcgcaaggtctatctccctccaggtcacctacaatagcagagatcatgtcaccaatg240

gttgtgagctcaaaccctctcaaattgtcaaccaacctagggttcatgttggtggtgatg300

atttaaggaccttctatactttggttatggtggaccctgacgcacctagccccagtgacc360

caaatctcagagaatacttgcattggctggtgactgatattccagccactacagggacaa420

gctttgggcaagaggttgtgtgctatgagagcccagcaccatcggtggggattcatcggt480

ttgttttcatattgtttcggcaactggggaggcagaccgtgtatgcgcctggttggcgtc540

agaatttcaacactagagactttgctgagctttacaatcttggatcgccggtggccgctg600

tttactttaactgccagaggcagagtggcaccgggggaagaagatgctaactcatcaagt660

aataataatggggtccctttctccaaggttaatgagtactgaactgtatttccaaactat720

ctcaataatatttttctaccacatttgacctcataaaagaaat763

<210>2

<211>175

<212>prt

<213>橡膠樹屬橡膠

<400>2

metproseraspargaspproleualaileglyargvalileglyasp

151015

valleuaspprophealaargserileserleuglnvalthrtyrasn

202530

serargasphisvalthrasnglycysgluleulysproserglnile

354045

valasnglnproargvalhisvalglyglyaspaspleuargthrphe

505560

tyrtyrleuvalmetvalaspproaspalaproserproserasppro

65707580

asnleuargglutyrleuhistrpleuvalthraspileproalathr

859095

thrglythrserpheglyglngluvalvalcystyrgluserproala

100105110

proservalglyilehisargphevalpheileleupheargglnleu

115120125

glyargglnthrvaltyralaproglytrpargglnasnpheasnthr

130135140

argaspphealagluleutyrasnleuglyserprovalalaalaval

145150155160

tyrpheasncysglnargglnserglythrglyglyargargcys

165170175

<210>3

<211>2692

<212>dna

<213>橡膠樹屬橡膠

<400>3

gtaaaagctggatacctcaggctccaaacaatatatatatacatgcctgtatgtcattga60

attctacacatcaacggtacacaccagtccactactagctagtgcttctcatagttagaa120

attctacacatcaacggtacacaccagtccactactagctagtgcttctcatagttagaa180

ctttcgcaaggtctatctccctccaggtcacctacaatagcagagatcatgtcaccaatg240

gttgtgagctcaaaccctctcaaattgtcaaccaacctagggttcatgttggtggtgatg300

atttaaggaccttctatactttggtaacttcttcttcttcttcttcttcttcttcttctt360

ctttcataatagaatcttattatgcacatttggtttctgtatatatcctatggtttttta420

cgtgtgagagatagatatatggttgagattctattcgctcgacgcaggttatggtggacc480

ctgacgcacctagccccagtgacccaaatctcagagaatacttgcattggtaccttcttg540

attctctctccttctctctggcctccactattcacacacaactacacgtatatgcacgtt600

tgagttttggtgctctaggcttaattaatatatgatatctaatatatatgtattcattca660

ttttcatctttctgaaacaaacttcaacaatataatccatgcacaaagcctccctcttca720

actaaccgggcatgggtgaattgtcaatagcttggagagttaatggtagttggcgactta780

cactcgtggaaatcatcaagccccatatgaaagcttacaaagctatctatagaaagcgag840

atgtggtagtgccaccatataatataacatcaaaaatttattttatatgtgaattttata900

ttttatcttgaattcattgtgaattgaatctaaataagaattttcctgcttatcctcatt960

ccatacttgcttctagaaatagatacacacctgtctttcttctactcctctgtgcaactt1020

tttttttttcagtaattaattgattggccccgaatttttcaagactgacttaaaagaata1080

aggttttatttaatatctctagagcctatgctcttttatatgcatggaataattataaac1140

atatgagtgcatggtatactaaattttagtacacaagaaatatcttataaatttctaaag1200

aatgaatatatgcatatggaattaggacgataaagaacttaaaaaattaaatattgagat1260

tttaaaaacaaaaaatactttttagattaaaaatattttattattttaatatttttttta1320

ttattcaatcatgaaagtttactaccatgtggaatcaatgaaatgaataggacttgcttg1380

tcttaacctcaagtgacaattatgtatcacttatagaatgatcatgtctaattaaattaa1440

taattcaacaatcgagtgcttcattacttcacaatgtaaatgacgcaaaaaaatgccttc1500

tcgccatcctagtctatgggctgcctgcataagacatcacatcaaaaggaatcgatgatc1560

gaggtccatcatcttttcgatgaagtaggggcttaaatacaaattcattgttattgaata1620

ttgtgtgcgataattaagaggaattaatacaactcaaggctagctgattatgtgaactaa1680

cagactgtttcttttatgaaatttttgtaggctggtgactgatattccagccactacagg1740

gacaagctttggtgagtagatttaattaccttaaaattttttatatatccttcattttga1800

tgatcatatgtatgtttcaaaagtttgtcattaattttacatcattattttctccaactt1860

aattcagcaaattaataatataagtattagcaacacttatttgaagaaggtcgagaggaa1920

ctatataattaatacagatataataaaggttactccacctatatatatgcacggaaagag1980

agattcatttatcttttttttttttttttttttctctctcgaatctcttaattttcttgt2040

ggtagatatcgtgcgaggccatcagtatcaatcttattccacctgatgcatctacacaga2100

atatatagtgtgtggggttgggagacaacaatatgatgataaaagcataagaaatcttat2160

caacatatgtgaaattgagaagattctctctttccttgatctagaagaagatacttaaaa2220

ataaaaaagcaaaaccatatacttgaatcttgtatatataatttatgtactcggttggtg2260

acttggtgtataagtgcaatgataatgatggtgttatacattttgtaatgatgatggtgg2340

tgttatacattgtagggcaagaggttgtgtgctatgagagcccagcaccatcggtgggga2400

ttcatcggtttgttttcatattgtttcggcaactggggaggcagaccgtgtatgcgcctg2460

gttggcgtcagaatttcaacactagagactttgctgagctttacaatcttggatcgccgg2520

tggccgctgtttactttaactgccagaggcagagtggcaccgggggaagaagatgctaac2580

tcatcaagtaataataatggggtccctttctccaaggttaatgagtactgaactgtattt2640

ccaaactatctcaataatatttttctaccacatttgaccccataaaagaaat2692