本發(fā)明是申請?zhí)枮?01610268387.8、申請日為2016年4月27日、發(fā)明名稱為“一種用于檢測麥角菌的試劑盒及檢測方法”的專利的分案申請。

本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種用于檢測麥角菌的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

麥角菌(clavicepspurpurea)屬麥角菌科、麥角菌屬，是一類主要以禾本科雜草和糧谷類植物為寄生宿主的真菌。其寄生于宿主的子房內(nèi)，受侵染的子房不形成種子而是形成堅硬的菌核。菌核結(jié)構(gòu)比較致密，并且外面包有一層角狀外殼，由此得名“麥角”(ergots)(alderman,1999)。麥角菌在高濕度、高水分條件下生長旺盛，容易感染植株。大部分麥角病菌的麥角是其宿主植物種子的1-4倍。由麥角病菌及其菌核所導(dǎo)致宿主植物所發(fā)生的病一般稱為“麥角病”(ergotdiseases)。麥角病是麥類和禾本科植物牧草的重要病害，不但使麥類大幅度減產(chǎn)，而且麥角中的生物堿對人、畜有毒，歷史上因誤食含麥角的谷物而引起中毒事件時有發(fā)生，如牲畜誤食帶麥角的飼草中毒死亡，人攝入過多含麥角的谷物食品也會發(fā)生流產(chǎn)甚至死亡現(xiàn)象。因此，需要開發(fā)適于田間或?qū)嶒?yàn)室對麥角菌進(jìn)行快速檢測的試劑盒或方法。

目前分子生物學(xué)檢測以其快速、靈敏的特點(diǎn)，在微生物檢測領(lǐng)域逐漸取代傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，成為熱門研究方向。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplificationofdna,lamp)是日本學(xué)者notomi于2000年建立的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)針對靶基因6個區(qū)域設(shè)計4條引物，利用具有鏈置換活性的dna聚合酶在恒溫條件下快速、高特異性地擴(kuò)增靶基因，產(chǎn)物是兩端帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的啞鈴狀dna分子。與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測的pcr方法相比，lamp技術(shù)具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，在食品、動植物檢驗(yàn)檢疫中被廣泛應(yīng)用于各種病原檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測麥角菌的lamp試劑盒及l(fā)amp方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個方面中，本發(fā)明提供一種用于檢測麥角菌的lamp試劑盒，其包括引物、反應(yīng)緩沖液、bstdna聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示:

外引物f3：cggacactcaagatcgacc(seqidno:1)

外引物b3：cgatatcgggccttgtgaat(seqidno:2)

內(nèi)引物fip：tggggttcgtttcggcttgaa-gacaagcgtgcttgaccaat(seqidno:3)

內(nèi)引物bip：gagaatctgaggccggctactg-tccttcctatgccctgct(seqidno:4)。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液由2mmdntp、10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.6mm甜菜堿和6mmmg²⁺組成。

優(yōu)選地，所述核酸染料為1000×sybrgreeni。

優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包括dna提取試劑以及陽性對照和陰性對照。

優(yōu)選地，所述dna提取試劑例如ctab抽提緩沖液。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了引物在制備用于檢測麥角菌的lamp試劑盒中的應(yīng)用。所述引物如序列seqidnos:1-4所示。

在又一個方面中，本發(fā)明還提供了一種檢測麥角菌的lamp方法，其中使用本發(fā)明的試劑盒，所述方法包括以下步驟：

(1)向待測樣品中加入ctab抽提緩沖液，按照常規(guī)ctab法提取dna；

(2)在pcr管中制備lamp反應(yīng)體系，包括0.2μmol/μl的外引物f31μl、0.2μmol/μl的外引物b31μl、1.2μmol/μl的內(nèi)引物fip1μl、1.2μmol/μl的內(nèi)引物bip1μl、反應(yīng)緩沖液2.5μl、8u/μl的bstdna聚合酶1μl、模板dna2μl，加水補(bǔ)充至25μl，并以麥角菌基因組dna作為陽性對照，以100mmtris-hclph8.0和50mmedta作為陰性對照；

(3)將步驟(2)中的pcr管于63℃恒溫反應(yīng)60min；

(4)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果：在(3)中所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μl核酸染料sybrgreeni，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，食品中不含麥角菌，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性。

本發(fā)明的發(fā)明人針對麥角菌序列的6個區(qū)域設(shè)計出4條引物，靈敏度高、特異性好。本發(fā)明用于檢測麥角菌的lamp試劑盒及方法能夠準(zhǔn)確鑒定食品、谷物、田間的麥角菌，假陽性率低、快速、高效，且通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，無需電泳和紫外觀察等步驟，成本低、操作簡單、鑒定簡便，適于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測，值得推廣應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的是，可以在不偏離本發(fā)明精神的情況下進(jìn)行多種修改，這些修改將包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1本發(fā)明的試劑盒的制備

1.1試劑

引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；bstdna聚合酶和10×thermopol反應(yīng)緩沖液購自takara；sybrgreeni購自invitrogen；其余pcr試劑和配制ctab抽提緩沖液所需的試劑購自sigma。

1.2試劑盒的制備：

獲得以下試劑，以制備本發(fā)明的試劑盒：

ctab抽提緩沖液：按照以下配方配制：100mmtris-hclph8.0、50mmedta、1mnacl、1％(v/v)β-巰基乙醇、2％ctab，調(diào)整ph值至7.2；

反應(yīng)緩沖液：按照以下配方配制：2mmdntp、10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.6mm甜菜堿、6mmmgso4；

引物：外引物f3，其核苷酸序列如seqidno:l所示；外引物b3，其核苷酸序列如seqidno:2所示；內(nèi)引物fip，其核苷酸序列如seqidno:3所示，內(nèi)引物bip，其核苷酸序列如seqidno:4所示。其中外引物f3和b3的濃度為0.2μmol/μl，內(nèi)引物fip和bip的濃度為1.2μmol/μl。

濃度為8u/μl的bstdna聚合酶；

核酸染料：1000×sybrgreeni；

陽性對照：麥角菌基因組dna；

陰性對照：100mmtris-hcl(ph8.0)和50mmedta。

實(shí)施例2麥角菌特異性檢測

2.1lamp特異性檢測

2.1.1待測植株

待測植株包括來自河北省農(nóng)林科學(xué)院的麥角病植株8株(包括黑麥3株、大麥5株)、炭疽病黃瓜2株、白粉病豌豆2株以及健康的大麥2株。麥角病植株穗上均可見麥角形成。

2.1.2樣品預(yù)處理：

將麥角病植株從莖基部剪斷，將上部用無菌水沖洗后，用消毒剪刀將其剪成小段，置于pda培養(yǎng)基上，25度恒溫培養(yǎng)，直至形成菌落。

用接種環(huán)刮取白粉病豌豆植株葉片上的白色霉層，接種于pda平板上，劃線培養(yǎng)。用消毒剪刀剪下炭疽病黃瓜葉片適量，在pda培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)炭疽病菌。

挑取上述病菌菌落的菌絲少量，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征。觀察顯示，培養(yǎng)所得菌落均符合相應(yīng)病菌的菌落特征。

2.1.3lamp檢測

使用實(shí)施例1制備的試劑盒按照以下步驟進(jìn)行檢測：

(1)收集pda平板上的菌落并離心，加入ctab抽提緩沖液，按照常規(guī)ctab法提取dna；

(2)在pcr管中制備lamp反應(yīng)體系，其中四種引物各1μl、反應(yīng)緩沖液2.5μl、8u/μl的bstdna聚合酶1μl、步驟(1)所得模板dna2μl，加水補(bǔ)充至25μl，并以麥角菌基因組dna作為陽性對照，以100mmtris-hclph8.0和50mmedta作為陰性對照；

(3)將步驟(2)中pcr管置于63℃恒溫反應(yīng)60min；

(4)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果：在(3)中所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μl1000×sybrgreeni，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性。

2.2檢測結(jié)果

8株麥角病植株以及陽性對照的pcr管中均呈現(xiàn)綠色，而豌豆、黃瓜、健康大麥以及陰性對照的顯色結(jié)果均為橙色，表明引物能夠準(zhǔn)確地鑒定出攜帶麥角菌的病害植株，具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例3麥角菌靈敏度檢測

3.1lamp靈敏度檢測

按照實(shí)施例2的步驟(1)提取麥角菌dna，紫外分光光度計測量其od值，并以10倍濃度系列稀釋法稀釋成10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共6個梯度。

lamp反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以及結(jié)果分析同實(shí)施例2第2.1.3節(jié)的步驟(2)-(4)。

3.2檢測結(jié)果

麥角菌dna濃度為10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的pcr管中均呈現(xiàn)綠色，表明本發(fā)明的檢測方法的最低檢測極限達(dá)到1pgdna，靈敏度很高。

序列表

<110>蘇茂順

<120>一種用于檢測麥角菌的試劑盒及檢測方法

<130>hzs-2012-005

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>人工序列

<400>1

cggacactcaagatcgacc19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>人工序列

<400>2

cgatatcgggccttgtgaat20

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>人工序列

<400>3

tggggttcgtttcggcttgaagacaagcgtgcttgaccaat41

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>人工序列

<400>4

gagaatctgaggccggctactgtccttcctatgccctgct40