本發(fā)明屬于基因甲基化檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于數(shù)字pcr芯片的基因甲基化程度定量方法。

背景技術(shù)：

dna甲基化主要是指胞嘧啶(c)5位碳的甲基化，形成^m5c。哺乳動物dna中，呈甲基化狀態(tài)的堿基對^m5cg會對基因的表達(dá)起到限制作用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，dna甲基化與惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。dna甲基化水平在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的改變主要表現(xiàn)為局部高甲基化和基因組的低甲基化。首先是抑癌基因的啟動子區(qū)，在正常細(xì)胞中該區(qū)域處于低甲基化或者未甲基化狀態(tài)，基因可以正常表達(dá)，從而不斷的抑制腫瘤發(fā)生。而在癌細(xì)胞中，基因的啟動子區(qū)域會呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài)，抑制了基因的表達(dá)，并最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。其次是對于在正常細(xì)胞中處于高度甲基化的一些基因和重復(fù)序列，其甲基化水平降低將造成這些基因的激活，細(xì)胞過度增殖，并最終導(dǎo)致癌癥。

傳統(tǒng)甲基化檢測方法中，基于測序的方法雖然檢測結(jié)果往往被視為金標(biāo)準(zhǔn)，但其過分依賴于昂貴的儀器和復(fù)雜的操作過程，且無法檢測出微量甲基化拷貝。而另一些方法，例如甲基化特異性高分辨率溶解曲線法，熒光定量pcr法等，雖然簡便快捷，但檢測結(jié)果不夠精確，靈敏度不夠高。以上這些缺點(diǎn)都限制了上述檢測手段在實際臨床檢測中的應(yīng)用價值。

數(shù)字pcr芯片技術(shù)，作為一種能夠精確檢測到單個dna分子的技術(shù)，具有很多優(yōu)點(diǎn)。例如：

一、能夠?qū)ζ鹗紭悠愤M(jìn)行絕對定量，而不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)品，不需要預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、靈敏度高，檢測限能夠達(dá)到10¹數(shù)量級個拷貝。

三、可以精確定量小拷貝數(shù)變化，準(zhǔn)確識別dna分子的微小濃度差異。

這些優(yōu)點(diǎn)都使得數(shù)字pcr芯片具有比傳統(tǒng)定量方法更優(yōu)越的性能，從而更加適用于生化檢測。

甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶，是一類能夠特異性識別其切割位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的限制性內(nèi)切酶，當(dāng)其切割位點(diǎn)狀態(tài)為甲基化時，切割不發(fā)生。當(dāng)其切割位點(diǎn)狀態(tài)為非甲基化時，切割發(fā)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于數(shù)字pcr芯片的基因甲基化程度定量方法，該方法實現(xiàn)了對基因甲基化程度絕對定量的方法，該方法能夠準(zhǔn)確的定量出待檢測基因的甲基化拷貝數(shù)所占的百分比；檢測靈敏度高；檢測過程簡單；且檢測時間短。

本發(fā)明的一種基于數(shù)字pcr芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：

(1)針對待檢測的目的基因，確定富含甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的區(qū)域，并對該區(qū)域設(shè)計引物與taqman探針；

(2)將待檢測樣本分成兩份，其中一份經(jīng)甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理，另一份不處理；

(3)利用數(shù)字pcr芯片分別對兩份樣本進(jìn)行定量檢測，最終計算出樣本中目的基因的甲基化程度。

所述步驟(1)中的taqman探針兩端分別修飾fam熒光分子和bhq熒光淬滅劑分子。

所述步驟(3)中的數(shù)字pcr芯片為采用pdms制作的陣列式數(shù)字pcr微流體芯片。

采用pdms制作的陣列式數(shù)字pcr微流體芯片不依賴專用的數(shù)字pcr設(shè)備，分液和讀取均在芯片上完成，大大降低了甲基化的數(shù)字pcr檢測成本。

所述步驟(3)中的pcr芯片反應(yīng)體系為：10μl羅氏480probsmastermix，0.5μl濃度為10μm前引物與后引物，0.5ul濃度為10μm的taqman探針，并加水至總體積為20μl。

所述步驟(3)中的計算方法為：統(tǒng)計兩份樣本中的拷貝數(shù)，從未經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果得到甲基化與非甲基化等位基因總數(shù)，從經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果得到樣本中的甲基化拷貝數(shù)，兩者相除，最終得到樣本中甲基化等位基因的百分比，即樣本的甲基化程度。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體為：

第一步：欲檢測的目的基因?qū)ふ业礁缓谆舾行韵拗菩詢?nèi)切酶切割位點(diǎn)的區(qū)域設(shè)計特異性引物與taqman探針。首先，確定要研究的目的基因相應(yīng)的區(qū)域，在該區(qū)域中找到富含甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的序列，以該序列為模板進(jìn)行引物設(shè)計，并同時設(shè)計出相應(yīng)的taqman探針。

第二步：對樣本進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。待檢測樣本為從細(xì)胞，組織，血液等中提取的dna，將待檢測樣本均分為相等的兩份：a部分與b部分。b部分中按照相應(yīng)的甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶的使用說明，將b部分樣本進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，b部分樣本中的非甲基化拷貝將被限制性內(nèi)切酶切割消化，只剩下甲基化拷貝。a部分不使用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理。兩部分樣本在進(jìn)行完上述步驟后保存待用。

第三步：利用pdms材料制作的陣列式數(shù)字pcr微流體芯片對待檢測基因的甲基化程度進(jìn)行絕對定量檢測。將第二步中處理過的a部分與b部分樣本，分別加入10ul羅氏480probsmastermix，0.5ul濃度為10um前引物與后引物，0.5ul濃度為10um的taqman探針，并加水至總體積為20ul。這樣就為a，b兩部分樣本分別配制好了pcr反應(yīng)體系。使用本發(fā)明的數(shù)字pcr芯片陣列式數(shù)字pcr微流體芯片分別對a與b兩部分樣本進(jìn)行絕對定量檢測。經(jīng)過pcr過程之后，統(tǒng)計出a部分與b部分樣本中的拷貝數(shù)，具體計算方法為：

設(shè)芯片亮點(diǎn)數(shù)目設(shè)為n，設(shè)芯片總點(diǎn)數(shù)設(shè)為n。由于dna分子在反應(yīng)倉中的個數(shù)x的分布滿足泊松分布，則根據(jù)泊松分布的分布函數(shù)：

每個無熒光信號的反應(yīng)倉含有0個目標(biāo)分子，則：

可以推出泊松分布的期望值λ的計算公式：

當(dāng)反應(yīng)倉中里分子數(shù)x>＝1個時，該反應(yīng)倉都會變成是亮點(diǎn)，所以有下面式子：

得出：

λ是泊松分布中期望，指的就是所有的反應(yīng)倉里面出現(xiàn)分子數(shù)目的期望值，所以最后一步只需要用λ乘以總反應(yīng)倉的數(shù)目n即可得出檢測到目的序列的總拷貝數(shù)copy_number：

copy_number＝λ×n

若欲得出被檢測物的初始濃度，只需將總拷貝數(shù)copy_number除以初始樣本的體積v：

至此，精確地得到了待檢測樣本中目的序列的拷貝數(shù)與濃度。

從a部分的結(jié)果中得到了甲基化與非甲基化等位基因拷貝總數(shù)，從b部分的定量結(jié)果中，得到樣本中甲基化等位基因拷貝數(shù)。兩者相除，便最終得到待測樣本中甲基化等位基因的百分比，即樣本的甲基化程度。

本發(fā)明利用pdms陣列式數(shù)字pcr芯片與甲基化特異性限制性內(nèi)切酶相結(jié)合，設(shè)計出一種基于數(shù)字pcr芯片的基因甲基化程度定量方法。對dna甲基化拷貝檢測靈敏度能夠達(dá)到10個拷貝。不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)品，不需要預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠?qū)δ康幕虻募谆潭冗M(jìn)行絕對定量。本發(fā)明可以精確定量小拷貝數(shù)變化，準(zhǔn)確識別dna分子的微小濃度差異。從而準(zhǔn)確的區(qū)分出甲基化程度的微小差異。

有益效果

本發(fā)明對dna甲基化拷貝檢測靈敏度能夠達(dá)到10個拷貝，靈敏度高；整個分液，擴(kuò)增，讀取過程完全在同一張陣列式數(shù)字pcr芯片上完成，不需要額外的數(shù)字pcr專用設(shè)備；不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)品，不需要預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠?qū)δ康幕虻募谆潭冗M(jìn)行絕對定量；檢測靈敏度高；檢測過程簡單；且檢測時間短；該方法能夠滿足臨床需求，在醫(yī)學(xué)方面具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的檢測流程示意圖；

圖2為實施例1中數(shù)字pcr芯片中發(fā)生的實際反應(yīng)；

圖3為實施例1中樣本1的數(shù)字pcr結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

(1)引物與探針的設(shè)計與準(zhǔn)備

首先，本實施例選擇與癌癥早期相關(guān)程度較高的pcdhgb6基因，該基因啟動子區(qū)域的甲基化程度高與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。本實施例中使用的甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶為hpaii，其切割位點(diǎn)為ccgg序列。所以在pcdhgb6基因的啟動子區(qū)域搜索到富含ccgg的區(qū)域，針對該區(qū)域設(shè)計引物與taqman探針。

本實施例中，為了便于觀測反應(yīng)的結(jié)果，taqman探針兩端分別修飾了fam熒光分子和bhq熒光淬滅劑分子。當(dāng)pcr體系中有待擴(kuò)增序列時，taqman探針會與待檢測序列通過互補(bǔ)配對原則相結(jié)合，從而在pcr過程中被taq酶水解，fam熒光素與bhq熒光淬滅劑分子分離，從而放出熒光。

所用核酸探針以及pcr引物均由上海占標(biāo)生物科技有限公司合成。所用序列見表1。

表1taqman探針序列以及pcr引物序列

試劑與儀器：depc水(sangonbiotech)、引物與探針(上海占標(biāo)生物科技有限公司)、lightcycler480probesmaster(roche)、bx51熒光顯微鏡(olympus)。

(2)樣本中pcdhgb6基因啟動子區(qū)域甲基化程度的檢測

第一步，對樣本進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。本實施例中，待檢測樣本為從肺癌患者手術(shù)切除的癌組織與癌旁組織中提取的基因組dna。將每個待檢測樣本均分為相等的兩份：a部分與b部分。b部分中按照hpaii甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶的使用說明，將b部分樣本進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理37攝氏度12小時，最后85攝氏度15分鐘使hpaii失活，b部分樣本中的pcdhgb6基因啟動子非甲基化拷貝將被限制性內(nèi)切酶切割消化，只剩下該基因啟動子區(qū)域的甲基化拷貝。a部分不使用hpaii甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理。兩部分樣本在進(jìn)行完上述步驟后保存待用。

第二步：利用pdms材料制作的陣列式數(shù)字pcr微流體芯片對待檢測基因的甲基化程度進(jìn)行絕對定量檢測。將第一步中處理過的a部分與b部分樣本，分別加入10ul羅氏480probsmastermix，0.5ul濃度為10um前引物與后引物，0.5ul濃度為10um的taqman探針，并加水至總體積為20ul。使用陣列式數(shù)字pcr微流體芯片分別對a與b兩部分樣本進(jìn)行絕對定量檢測。經(jīng)過pcr過程之后，統(tǒng)計出a部分與b部分樣本中的拷貝數(shù)。

從a部分的結(jié)果中得到了甲基化與非甲基化等位基因總數(shù)，從b部分的定量結(jié)果中，得到樣本中的甲基化拷貝數(shù)。兩者相除，便最終得到待測樣本中甲基化等位基因的百分比，即樣本的甲基化程度。

本實施例中利用本發(fā)明所公布的方法，共對四個樣本進(jìn)行了pcdhgb6基因啟動子區(qū)域的甲基化程度測定，四個樣本編號分別為樣本1、樣本2、樣本3、樣本4。同時對這四個樣本的甲基化程度進(jìn)行了焦磷酸測序，本發(fā)明中的方法與焦磷酸測序方法的檢測結(jié)果具有一致性，證明了本發(fā)明中檢測方法的可行性。兩種方法測定的結(jié)果對比如表2：

表2實施例中四個樣本的pcdhgb6啟動子區(qū)域甲基化程度數(shù)字pcr檢測結(jié)果與焦磷酸測序檢測結(jié)果對比

sequencelisting

<110>中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所

<120>一種基于數(shù)字pcr芯片的基因甲基化程度定量方法

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gatgtacacctgcattttcg20

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cgttcgctcgggttctcgct20

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acgccggggatccgtcagcctctgg25