本發(fā)明屬于中藥材鑒定技術領域，具體涉及一種鑒定中藥守宮的特異性引物、試劑盒及鑒別方法。
背景技術：
守宮為壁虎科動物無蹼壁虎(Gekko Swinhoana Gunther)的全體，其藥性寒、味咸，有小毒，入肺、腎經。具有散結解毒、滋陰涼血、熄風鎮(zhèn)痙、透經達絡等功效。古代醫(yī)學典籍中關于守宮的記載有很多，如《本草綱目》中記載，守宮主治中風癱瘓，手足不舉，或歷節(jié)風痛，及風驚癇，小兒疳痢，血積瘰，療蝎螫；清代趙其光在《本草求原》中提到守宮入血分、治血病，有滋陰降痰之功效；《四川中藥志》稱其能“驅風、破血積包塊，治腫瘤”。
由于守宮的來源比較復雜，市售守宮常出現(xiàn)混雜或偽品，如東方蠑螈、中國瘰螈、變色樹蜥、蛤蚧、紅螺疣螈、喜山巖蜥、青海沙蜥、石龍子和變色沙蜥等。對其中的一些品種，守宮正品與之形態(tài)學特征差別細微，采用傳統(tǒng)的鑒別方法很難對守宮藥材進行鑒定，鑒于守宮在炮制、加工、儲藏和運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)形態(tài)有所改變，使得守宮及其混偽品的性狀特征消失，從而加大了鑒別難度。而不法分子在經濟利益的驅使下，守宮“以假充真”、“以次充好”、“不合格產品”的市場現(xiàn)象普遍存在，即使具有豐富鑒別經驗的人員也很難根據(jù)形態(tài)特征進行準確地鑒別。為確保中藥材的質量及臨床療效，已有研究采用現(xiàn)代分子生物學PCR擴增技術，可在短時間內完成對部分中藥材的鑒別，然而現(xiàn)有技術中還未提出一種利用PCR技術來快速鑒別中藥守宮種的特異性引物以及方法。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的第一個技術問題在于提供一種鑒定中藥守宮的特異性引物，采用所述引物鑒定中藥守宮，鑒定結果準確、穩(wěn)定、可靠、靈敏度高，能夠在短時間內對大量待測中藥守宮進行快速鑒定，效率高。
本發(fā)明要解決的第二個技術問題在于提供一種鑒定中藥守宮的試劑盒，采用所述試劑盒鑒定中藥守宮，鑒定結果準確、穩(wěn)定、可靠、靈敏度高，能夠在短時間內對大量待測中藥守宮進行快速鑒定，效率高。
本發(fā)明要解決的第三個技術問題在于提供一種鑒定中藥守宮的方法，采用所述方法鑒定中藥守宮，鑒定結果準確、穩(wěn)定、可靠、靈敏度高，能夠在短時間內對大量待測中藥守宮進行快速鑒定，效率高。
為此，本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥守宮的引物，所述引物如下：
上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；
下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。
本發(fā)明提供了一種鑒定中藥守宮的試劑盒，含有上述的引物。
所述的試劑盒，每支所述試劑盒包括各自獨立包裝的引物液部分和PCR反應液部分；所述PCR反應液部分含有用于進行PCR擴增的含Mg2+擴增緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH2O。
本發(fā)明還提供了一種所述的引物或所述的試劑盒在鑒定中藥守宮中的應用。
本發(fā)明提供了一種鑒定中藥守宮的方法，包括如下步驟：
(1)提取待測中藥守宮的總DNA，備用；
(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，采用如下引物進行PCR擴增：
上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；
下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。
(3)測定步驟(2)中所得的PCR擴增產物的大小，若所述PCR擴增產物中含有100～250bp的DNA片段，則所述待測中藥守宮為真；反之，則所述待測中藥守宮為假。
所述的方法，所述步驟(2)中，所述PCR反應體系包括：
DNA模板，100ng，2μL；
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
PCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
反應總體積為22μL。
所述的方法，所述步驟(2)中，所述PCR擴增程序如下：95℃預變性5min，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，進行30個循環(huán)，然后繼續(xù)72℃延伸5min，降溫至4℃，獲得的擴增產物4℃保存。
所述的方法，所述步驟(3)中，所述100～250bp的DNA片段為110～150bp的DNA片段。
所述的方法，所述100～250bp的DNA片段為116bp的DNA片段。
所述的方法，所述的116bp的DNA片段序列如SEQ ID NO：3所示。
本發(fā)明技術方案，具有如下優(yōu)點：
(1)本發(fā)明所述的用于鑒定中藥守宮的特異性引物，基于守宮的CYT B基因設計了大量的引物，且通過大量引物篩選研究，篩選出了具有種屬特異性的引物，使用上述引物對待測中藥守宮進行鑒定，能將守宮藥材與其他混淆品準確的分開，且其PCR擴增產物僅為100～250bp，分子量小，保證了其在短時間內進行大量的中藥守宮鑒定，鑒定結果準確、穩(wěn)定、可靠、靈敏度高。
(2)本發(fā)明所述的用于鑒定中藥守宮的試劑盒，所述試劑盒中含有所述的用于鑒定中藥守宮的特異性引物，所述引物具有種屬特異性，使用上述引物對待測中藥守宮進行鑒定，能將守宮藥材與其他混淆品準確的分開，在短時間內進行大量的中藥守宮鑒定，鑒定結果準確、穩(wěn)定、可靠、靈敏度高。
(3)本發(fā)明所述的鑒定中藥守宮的方法，包括如下步驟：(1)提取待測中藥守宮的總DNA，備用；(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，采用本發(fā)明設計的引物進行PCR擴增；(3)測定步驟(2)中所得的PCR擴增產物的大小，若所述PCR擴增產物中含有100～250bp的DNA片段，則所述待測中藥守宮為真；反之，則所述待測中藥守宮為假；所述方法能將守宮藥材與其他混淆品準確的分開，且PCR擴增產物僅為100～250bp，分子量小，保證了其在短時間內進行大量的中藥守宮鑒定，鑒定結果準確、穩(wěn)定、可靠、靈敏度高。
(4)本發(fā)明所述的鑒定中藥守宮的方法，所述步驟(3)中，所述100～250bp的DNA片段為116bp的DNA片段，PCR擴增產物分子量小，保證了其在短時間內進行大量的中藥守宮鑒定。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，很顯然下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發(fā)明實施例3中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施方式
本發(fā)明所使用的主要試劑如下：
Genomic DNA Kit(OMEGA公司)、PCR SuperMix(+dye)和Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技術公司)。
本發(fā)明所使用的主要設備如下：
ST16R高速冷凍離心機購自賽默飛世爾、V-GES電泳儀購自威泰克、Dolphin View凝膠成像系統(tǒng)購自威泰克。
實施例1
本實施例提供了一種用于鑒定中藥守宮的特異性引物，針對守宮的CYT B基因設計的特異性引物如下，參見序列表中SEQ ID NO：1-2所示：
上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；
下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。
上述引物由上海英濰捷基公司(北京合成部)合成。
實施例2
本實施例提供了一種用于鑒定中藥守宮的試劑盒，每支所述試劑盒包括各自獨立包裝的引物液部分和PCR反應液部分；所述引物液為含所述實施例1中的所述特異性引物；所述PCR反應液部分含有用于進行PCR擴增的含Mg2+擴增緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH2O，每支所述試劑盒的配方為：
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
PCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL。
實施例3
本實施例提供了一種利用實施例1的特異性引物或實施例2的試劑盒鑒定中藥守宮的方法，包括如下步驟：
(1)藥材收集于山西、安徽、廣西和河北等省份(表1)，表1中試驗所有的樣品均為市售產品，可以通過購買得到，或是自來源地采集或購買。
表1守宮及其常見偽品樣品來源
選取上表1中的樣品的凍干粉采用Genomic DNAKit提取總DNA，按照說明書操作，步驟如下：
(1)提取待測中藥守宮的總DNA
1)分別取各樣品的凍干粉≤25mg，置于一無菌的1.5mL離心管中；
2)加入100μL的LB2(裂解液)和20μL的Proteinase K(蛋白酶K)；
3)55℃金屬浴孵育直至完全裂解，大約1小時，每15min顛倒混勻一次；
4)加入20μL的RNase A(RNA酶)于樣品中，室溫孵育2min，以去除RNA的干擾；
5)12000rpm離心5min，轉移上清液于一無菌的離心管中；
6)加入500μL的BB2(結合緩沖液)，立即渦旋5s，室溫孵育10min；
7)將全部的溶液加入離心柱中，12000rpm離心30s，棄去流出液；
8)加入500μL的CB2(清洗緩沖液)，12000rpm離心30s，棄去流出液；
9)重復步驟8)一次；
10)加入500μL的WB2(洗滌緩沖液)，12000rpm離心30s，棄去流出液；
11)重復步驟10)一次；
12)12000rpm離心2min，徹底去除殘留的WB2；
13)將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入50μL 65℃預熱EB(洗脫緩沖液)，室溫靜置1min，12000rpm離心1min，洗脫DNA，洗脫出的DNA作為供試品溶液，置于-20℃保存。
(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，采用如下引物進行PCR擴增：
上游引物：5′-CAACGGGGCCCTATATTCCG-3′；
下游引物：5′-AGGGTTGCGTATGGGGTTTC-3′。
所述PCR反應體系包括：
DNA模板，100ng，2μL；
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
PCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
反應總體積為22μL。
所述PCR擴增程序如下：
95℃預變性5min，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，進行30個循環(huán)，然后繼續(xù)72℃延伸5min，降溫至4℃，獲得的擴增產物4℃保存。
(3)取步驟(2)中的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用V-GES電泳儀，測得各樣品的PCR擴增產物的大小，瓊脂糖凝膠電泳法按照2015年版中國藥典三部附錄ⅣB，膠濃度為1％，電泳緩沖液為TAE緩沖液(Tris-EDTA-乙酸緩沖液，pH 8.3)，上述步驟(2)中獲得的各樣品的PCR反應溶液的上樣量分別為10μL，DNA分子量標記(Trans2K Plus DNA Marker)上樣量為2μL，電泳結束后，取凝膠在溴化乙錠溶液(0.5μg/mL)中染色20min，在Dolphin View凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果，其中1為DNA Marker，2為守宮，3為蛤蚧，4為變色樹蜥，5為麗斑麻蜥，6為中國石龍子(圖1)，蛤蚧、變色樹蜥、麗斑麻蜥和中國石龍子沒有條帶，而守宮的凍干粉的PCR反應液分別在100～250bp和250～500bp各有一條DNA條帶，其中250～500bp擴增條帶為非特異性擴增帶，在100～250bp位置的DNA條帶為引物設計的PCR產物大小(116bp)，表明本發(fā)明設計的引物具有種屬特異性，采用該引物及本發(fā)明方法能準確的將守宮藥材與其他混淆品鑒別開來，并且擴增的DNA片段僅為116bp，分子量小，檢測速率快，采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit純化回收在100～250bp位置的DNA條帶即116bp的DNA片段序列，然后由上海英濰捷基公司(北京合成部)進行測序，所述的116bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示，由所述序列SEQ.ID NO：3可知，所述116bp的DNA片段序列為特異性擴增條帶，進一步證明本發(fā)明設計的引物具有種屬特異性。
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京建生藥業(yè)有限公司
<120> 一種鑒定中藥守宮的特異性引物、試劑盒及鑒別方法
<130> HA201602557
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caacggggcc ctatattccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggttgcgt atggggtttc 20
<210> 3
<211> 116
<212> DNA
<213> 守宮Gekko swinhoana gunther
<400> 3
caacggggcc ctatattccg accactcact cgattaacac ttttaatcct agccaacaac 60
atcatcctac tgacctgatt aggcggagaa ccagttgaaa ccccatacgc aaccct 116