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真核翻譯延伸因子在檢測乳腺癌試劑中的應用的制作方法

文檔序號:12697984閱讀:398來源:國知局
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學
技術領域
,具體涉及真核翻譯延伸因子在檢測乳腺癌試劑中的應用。
背景技術
:乳腺癌是一種全身性疾病、其發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復雜過程,包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此,基因突變在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。乳腺癌是一個多因素遺傳變異性疾病,只有不足10%是由于單基因缺陷引起的。隨著高通量基因技術的發(fā)展,越來越多與乳腺癌相關基因被發(fā)現(xiàn),這些基因上潛在的遺傳變異(單核苷酸多態(tài)和拷貝數(shù)變異)可能引起乳腺癌藥物治療效果的差異。由于遺傳變異的存在使抗腫瘤藥物的代謝途徑以及藥物作用的目標基因可能受到影響,進而影響療效以及預后。SNP(singlenucleotidepolymorphism,SNP,即單核苷酸多態(tài)性)是1996年由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心學者Lander提出的一類分子遺傳標記,主要是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP表現(xiàn)出的多態(tài)性僅涉及到單個堿基的變異,表現(xiàn)是有轉換、顛換、插入和缺失等。單核苷酸多態(tài)性為第三代遺傳標志,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。目前對于不同分型乳腺癌預后、療效的預測性研究主要集中在SNP水平。SNP賦予個體對環(huán)境暴露、藥物治療等的不同反應,從而產(chǎn)生不同的表型,因此SNP可能是導致個體疾病發(fā)生發(fā)展差異的重要遺傳基礎。利用疾病易感的SNP譜診斷疾病,具有快速、靈敏、準確等特點,因而應用前景廣闊。近年來,利用SNP診斷疾病的發(fā)生發(fā)展已成為臨床和科研工作者的研究熱點。然而,目前還沒有將SNP應用于乳腺癌診斷的報道,若能篩選出乳腺癌易感的SNP作為生物標志物,并研制相應的診斷試劑盒,必將有力地推動我國乳腺癌早期診斷的現(xiàn)狀,并為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟新的途徑。技術實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的是針對上述技術問題,提出一種EEF1D易感SNP位點。本發(fā)明的第二個目的是提供檢測EEF1D易感SNP位點基因型的試劑。本發(fā)明的第三個目的是提供乳腺癌輔助診斷試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康女性對照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性,尋找一組與乳腺癌高度相關的高特異性和敏感性的SNP,并研制出可便于臨床應用的乳腺癌輔助診斷試劑盒,為乳腺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術方案實現(xiàn)的:本發(fā)明首先提供了真核翻譯延伸因子在檢測乳腺癌試劑中的應用,所述真核翻譯延伸因子包括真核翻譯延伸因子1δ和真核翻譯延伸因子2。具體地,所述檢測乳腺癌試劑是指檢測真核翻譯延伸因子易感SNP位點基因型的試劑。所述真核翻譯延伸因子1δ的SNP位點是位于人類第8染色體第144671461位堿基由G到A的SNP位點突變,所述真核翻譯延伸因子2的SNP位點是位于人類第19染色體第3977255位堿基由M到V的SNP位點突變。所述位點突變具體信息為EEF1D:NM_001130053:exon3:c.G791A:p.R264Q,EEF2:NM_001961:exon14:c.A2341G:p.M781V。其中,EEF1D(eukaryotictranslationelongationfactor1delta,真核翻譯延伸因子1δ),該基因編碼翻譯延伸因子1復合物的eEF1Bδ亞基,這個復合物負責氨基酰tRNA進入核糖體的酶促降解。eEF1Bδ亞基在復合物中發(fā)揮鳥嘌呤核苷酸轉換因子的作用。據(jù)報道,HIV-1感染后,該亞基與HIV-1Tat蛋白相互作用,這種相互作用抑制了宿主細胞蛋白的翻譯但卻增強了病毒蛋白的翻譯過程。這種錯誤翻譯影響了多個剪接體變異并翻譯形成了多個編碼異構體,從而導致了許多假基因的出現(xiàn),如分別在染色體1,6,7,9,11,13,17,19上發(fā)現(xiàn)了該基因的假基因(由RefSeq提供,Aug2010)。EEF2,(eukaryotictranslationelongationfactor2,真核翻譯延伸因子2),該基因編碼GTP結合翻譯延伸因子家族中的一員,其編碼蛋白是蛋白合成中的重要因子,它促進了蛋白質鏈合成初期核糖體A位點到P位點GTP依賴的翻譯。這種蛋白在EF-2激酶磷酰化時是完全失活的。由UniProt-GOA提供geneontology分析表明這些基因除了參與翻譯延伸外,EEF1D基因還參與轉錄調控和信號轉導等過程,具有翻譯延伸因子活性、翻譯因子活性和信號轉導活性等;而EEF2基因還參與GTP結合、肌動蛋白絲結合、蛋白激酶結合和核糖體結合等功能。所述NM_001130053是EEF1D的一個轉錄本,所述SNP位點突變發(fā)生在該轉錄本的第3個外顯子上,并且第791位發(fā)生了由G到A的錯義突變,該突變導致了編碼蛋白由精氨酸R到谷氨酰胺Q的轉變。所述NM_001961是EEF2的一個轉錄本,所述SNP位點突變發(fā)生在該轉錄本的第14個外顯子上,并且第2341位發(fā)生了由A到G的錯義突變,該突變導致了編碼蛋白由蛋氨酸M到纈氨酸V的轉變。進一步地,本發(fā)明提供了一種檢測真核翻譯延伸因子易感SNP位點基因型的試劑,所述試劑包括用于擴增所述SNP位點的引物對,或是包括用于擴增所述SNP位點的引物對和限制性內切酶;所述SNP位點是位于人類第8染色體第144671461位堿基由G到A的SNP位點突變,所述EEF2的SNP位點是位于人類第19染色體第3977255位堿基由M到V的SNP位點突變。優(yōu)選的,擴增所述EEF1D和EEF2的SNP位點的引物對是按照PrimerPremier5引物設計軟件或NCBI數(shù)據(jù)庫提供的在線引物設計軟件設計的引物對,在一優(yōu)選實施例中本發(fā)明選用如SEQIDNO:3-4所示的引物對擴增EEF1D基因,擴增的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示;選用如SEQIDNO:7-8所示的引物對擴增EEF2基因,擴增的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。本發(fā)明選用的引物對特異性強,擴增效果好,擴增的序列亦可作為乳腺癌診斷、預測、評估等分子手段的生物標志物。更進一步地,本發(fā)明提供了一種乳腺癌輔助診斷的試劑盒,其包括檢測EEF1D:NM_001130053:exon3:c.G791A和EEF2:NM_001961:exon14:c.A2341G的SNP位點基因型的試劑。優(yōu)選的,所述的試劑包括用于擴增所述SNP位點的引物對,或是包括用于擴增所述SNP位點的引物對和限制性內切酶。優(yōu)選的,擴增所述SNP位點的引物對是按照PrimerPremier5引物設計軟件或NCBI數(shù)據(jù)庫提供的在線引物設計軟件設計的引物對,在一優(yōu)選實施例中本發(fā)明選用如SEQIDNO:3-4所示的引物對擴增EEF1D基因,選用如SEQIDNO:7-8所示的引物對擴增EEF2基因,本發(fā)明選用的引物對特異性強,擴增效果好。優(yōu)選的,所述試劑盒還包括PCR反應常用的酶和試劑,如dNTPs、Taq酶、Mg2+、PCR反應緩沖液等;還可以含有標準品和/或對照品。本發(fā)明有益效果:本發(fā)明研究SNP在乳腺癌輔助診斷的應用前景,闡述SNP對于乳腺癌進展的影響,揭示其診斷價值。因此,本發(fā)明通過SNP基因型診斷試劑和診斷試劑盒的研制和應用,可使得乳腺癌的診斷更加方便易行,為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情,為臨床治療效果評價奠定基礎,并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明的技術方案具體包括:采集符合標準的血液樣本,系統(tǒng)收集完整的人口學資料和臨床資料;基因型檢測:選擇乳腺癌病例、與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性對照,利用外顯子測序,找出與乳腺癌相關的SNP;對篩選出的陽性關聯(lián)SNP,進一步采用基因分型進行檢測,驗證其應用于臨床診斷的可重復性;乳腺癌輔助診斷試劑盒的研制:根據(jù)乳腺癌病例和健康女性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。數(shù)據(jù)分析中各數(shù)值表示如下:1、ljb23_sift:SIFT分值(version2.3),表示該變異對蛋白序列的影響,包含三個值,一是SIFT初始分值,二是轉換后的值(1-SIFT),三是T或者D。當該變異同時影響多個蛋白序列時,對每條蛋白序列有一個SIFT值,取最小值。SIFT分值越小越“有害”,表明該SNP導致蛋白結構或功能改變的可能性大;D:Deleterious(sift<=0.05);T:tolerated(sift>0.05));2、ljb23_pp2hvar:利用PolyPhen2基于HumanVar數(shù)據(jù)庫預測該變異對蛋白序列的影響,用于單基因遺傳病。該列包含兩個值,第一個是PolyPhen2分值,數(shù)值越大越“有害”,表明該SNP導致蛋白結構或功能改變的可能性大;第二個是D或P或B(D:Probablydamaging(>=0.909),P:possiblydamaging(0.447<=pp2_hvar<=0.909);B:benign(pp2_hvar<=0.446));3、ljb23_pp2hdiv:利用PolyPhen2基于HumanDiv數(shù)據(jù)庫預測該變異對蛋白序列的影響,用于復雜疾病。該列包含兩個值,第一個是PolyPhen2分值,數(shù)值越大越“有害”,表明該SNP導致蛋白結構或功能改變的可能性大;第二個是D或P或B(D:Probablydamaging(>=0.957),P:possiblydamaging(0.453<=pp2_hdiv<=0.956);B:benign(pp2_hdiv<=0.452));4、ljb23_mt:MutationTaster分值(version2.3),表示該變異對蛋白序列的影響,包含三個值,一是MutationTaster初始分值,二是轉換后的值,三是A、D、N或者P。第二個值越大越“有害”,表明該SNP導致蛋白結構或功能改變的可能性大,其中″A″(″diseasecausingautomatic″);″D″(″diseasecausing″);″N″(″polymorphism″);″P″(″polymorphismautomatic″)。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:1.研究樣本的選擇(1)經(jīng)病理學明確診斷的乳腺癌病例25例和與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性10例作為對照,其中乳腺癌病例中有3例病人具有癌癥家族史;(2)采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史;(3)與病例年齡匹配的健康女性對照2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA,按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/μLDNA,純度(紫外2600D:2800D)在1.6-2.0。3.全外顯子芯片檢測(1)取受試者全基因組DNA樣本;(2)在全外顯子芯片(北京諾禾致源科技股份有限公司,下同)上進行掃描;(3)檢測并比較各基因型在乳腺癌病例與健康女性對照中的分別差異。4.單個SNP的基因分型(1)取受試者DNA樣本;(2)設計單個SNP的特異性擴增引物;(3)進行PCR反應,回收產(chǎn)物進行測序;(4)比較乳腺癌病例與健康女性對照中不同基因型的分布差異。5.診斷試劑盒制備方法全外顯子芯片進行掃描和單個SNP檢測后確定乳腺癌病例與健康女性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP,作為乳腺癌診斷的指標。篩選出的與乳腺癌發(fā)病有關的SNP輔助診斷試劑盒,其包括檢測位于EEF1D基因NM_001130053:exon3:c.G791A和EEF2:NM_001961:exon14:c.A2341G的SNP位點基因型的試劑,診斷試劑盒還可以包括這些SNP的特異性擴增引物,以及Taq酶、dNTPs等試劑。6.臨床應用例利用本發(fā)明人制備的乳腺癌輔助診斷試劑盒檢測待篩查的乳腺癌患者并與實際臨床檢測相比較以確定了乳腺癌輔助診斷試劑盒的有效性。具體包括測定受試者血標本DNA中上述SNP的特異性擴增引物和其他檢測試劑,為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度,及時采取更具個性化的防治方案提供支持。實施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人于2010年1月至2015年12月在深圳市第二人民醫(yī)院收集了大量的新發(fā)乳腺癌患者血標本,通過對樣品資料的整理,發(fā)明人從中選擇了25例符合下列標準的樣本,同時選擇10例年齡在25-55歲健康女性作對照進行全外顯子芯片檢測,樣本選擇標準如下:1、經(jīng)病理學明確診斷的乳腺癌病例,其中有3例病人具有癌癥家族史并分別標記為X1、X2、X3;2、采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史;3、與病例年齡匹配的健康女性對照并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。實施例2外周血DNA的提取和純化在上述符合條件的25例乳腺癌患者和10例健康女性對照中,兩組年齡均衡可比。具體步驟為:1、向儲存于2mL凍存管中的外周血加入溶血試劑(即裂解液,40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化鎂2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20mL混合后,用TrisHcl溶液定容至2000mL,下同),顛倒混勻后完全轉入。2、去除紅細胞:用溶血試劑將5mL離心管補至4mL,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘,棄上清。向沉淀中加入4mL溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄上清。3、抽提DNA:向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有122.5mL0.2M氯化鈉,14.4mL0.5M乙二胺四乙酸,15mL10%十二烷基硫酸鈉,148.1mL雙蒸水,下同)和8μL蛋白酶K,振蕩器上充分振蕩混勻,37℃水浴過夜。4、去除蛋白質:加1mL飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘,取上清轉入新的5mL離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿∶異戊醇=24∶1,v/v,下同),充分混勻后(手搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個1.5mL的離心管)。5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60μL,再加入與上清液等體積的冰無水乙醇,上下輕搖,可見白色絮狀沉淀物,再以12000rpm離心10min。6、DNA洗滌:在沉淀中加入冰無水乙醇1mL,12000rpm離心10min,棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。7、測量濃度:通常能得到20-50ng/μLDNA,純度(紫外2600D:2800D)在1.8-2.0。實施例3SNP的全外顯子組檢測將實施例2中兩組人群經(jīng)全外顯子芯片檢測獲得相關結果。1、文庫構建北京諾禾致源科技股份有限公司采用Agilent的液相芯片捕獲系統(tǒng),對人的全外顯子區(qū)域DNA進行高效富集,然后在IlluminaHiseq平臺上進行高通量、高深度測序。建庫和捕獲實驗采用AgilentSureSelectHumanAllExonV5試劑盒,嚴格使用說明書推薦的試劑和耗材,并參照最新的經(jīng)過優(yōu)化的實驗流程進行操作。實驗基本流程:將基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180-280bp的片段,經(jīng)末端修復和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。帶有特異index的文庫pooling后與多達543,872個生物素標記的探針進行液相雜交,再使用帶鏈霉素的磁珠將20,965個基因的334,378個外顯子捕獲下來,經(jīng)PCR線性擴增后進行文庫質檢,合格即可進行上機測序。2、庫檢文庫構建完成后,先使用Qubit2.0進行初步定量,稀釋文庫至1ng/μL,隨后使用Agilent2100對文庫的insertsize進行檢測,insertsize符合預期后,使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2nM),以保證文庫質量。3、上機測序庫檢合格,根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進行IlluminaHiseq平臺測序。4、數(shù)據(jù)分析與處理經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選、深度加工和生物信息學序列比對,最終確定“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的53個SNP位點為優(yōu)選敏感級位點。其中,位于EEF1D基因NM_001130053:exon3第791位堿基G/A的SNP突變,EEF2基因NM_001961:exon14第2341位堿基A/G的SNP突變,該位點變異對蛋白影響值如表1所示:表1SNP突變位點變異對蛋白影響值基因名ljb23_siftljb23_pp2hvarljb23_pp2hdivljb23_mtEEF1D0.11,0.89,T0.922,D1.0,D1,1.0,DEEF20.04,0.96,D0.008,B0.002,B1,1.0,D該位點經(jīng)過生物信息學分析,可以確認為乳腺癌候選標志物。實施例4利用危險度評分方法進一步分析SNP與乳腺癌的發(fā)病風險本發(fā)明人通過對2組樣品(“乳腺癌病例組”和“健康女性對照組”)基因型分布頻率的比較,選擇陽性關聯(lián)的SNP,以全外顯子掃描樣本中單個SNP回歸系數(shù)為權重,進一步求得危險分值,繪制ROC來評價診斷的靈敏性和特異性,進而診斷這些SNP對乳腺癌發(fā)病的判斷能力。對所有SNP標志物的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),位于EEF1D基因第791位堿基G/A的SNP突變和EEF2基因第2341位堿基A/G的SNP突變,其靈敏度和特異度都達到60%以上。因此,本發(fā)明人證明了該位點標志物能夠很好地將健康女性對照和乳腺癌患者區(qū)分。實施例5單個SNP的基因分型1、取5例乳腺癌患者和5例健康女性對照DNA樣本同實施例2;2、PCR擴增利用NCBI網(wǎng)站提供的在線引物設計軟件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd對EEF1D:NM_001130053:exon3:c.G791A和EEF2:NM_001961:exon14:c.A2341G設計單個SNP的特異性擴增引物如表2所示。表2引物序列PCR反應體系如表3所示。PCR擴增程序為:95℃預變性10min,94℃變性15s,60℃退火15s,72℃延伸30s,進行30個循環(huán),最后72℃延伸30min,于4℃保存,過夜需放置-20℃冷凍。表3反應體系組分加入量2×mix25μL上游引物(10uM)3.0μL下游引物(10uM)3.0μL模板5μL加入滅菌蒸餾水至50μL3、測序PCR擴增結束后,取5μL擴增產(chǎn)物,1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳30min,染色20min,然后將凝膠塊置于凝膠成像儀中觀察,根據(jù)比對Marker的片段大小情況,初步判斷擴增片段是否正確。進而對符合要求的擴增產(chǎn)物進行純化:采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit試劑盒,并按試劑盒要求進行操作。上樣測序:采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit試劑盒,并按試劑盒要求進行操作;用ABI公司3730型測序儀進行測序。4、結果分析通過Chromas序列分析軟件,將測序結果與標準序列進行比對,尋找SNP位點,通過分析SNP位點處堿基的類型,就可以得到SNP位點的基因型。EEF1D基因結果顯示:5例乳腺癌患者測序得到284bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,其在第254位堿基為GA、AA;而5例健康女性對照測序得到284bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,其在第254位堿基為GG;證實了該位點為GA、AA基因型時判斷為乳腺癌的易感基因型,該位點為GG基因型時判斷為乳腺癌的非易感基因型。EEF2基因結果顯示:5例乳腺癌患者測序得到325bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示,其在第283位堿基為AG、GG;而5例健康女性對照測序得到325bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示,其在第283位堿基為AA;證實了該位點為AG、GG基因型時判斷為乳腺癌的易感基因型,該位點為AA基因型時判斷為乳腺癌的非易感基因型。從而進一步確認所述EEF1D:NM_001130053:exon3:c.G791A和EEF2:NM_001961:exon14:c.A2341G的SNP位點可用于乳腺癌的檢測、治療、診斷、預后評估等輔助診斷。實施例6用于乳腺癌輔助診斷SNP試劑盒的制作基于實施例5得到的引物組,組裝本發(fā)明所述的用于乳腺癌的試劑盒,所述試劑盒包括特異擴增如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物對如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示,和擴增如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物對如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。所述試劑盒還可以有相應PCR技術所需的常用試劑,如:dNTPs,MgCl2,雙蒸水,Taq酶等,這些常用試劑都是本領域技術人員熟知的,另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。此試劑盒的價值在于只需要外周血而不需要其他組織樣品,通過最精簡和特異的引物對檢測SNP,再通過SNP譜輔助判斷乳腺癌,不僅穩(wěn)定,檢測方便,且精確,大大提高疾病診斷的敏感性和特異性,因此將此試劑盒投入實踐,可以幫助指導診斷和更有效的個體化治療。雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3 
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