本發(fā)明屬于植物分子技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測sh_2-i基因型甜玉米的引物及試劑盒與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甜玉米(Zea mays L.saccharata Sturt.)為玉米屬(Zea mays L.)子粒胚乳基因發(fā)生突變而產(chǎn)生的1個亞種，主要包括su₁、su₂、sh₁、sh₂、sh₄、du、ae、bt₁、bt₂、se等隱性突變基因，其中sh₁、sh₂、sh₄、bt₁和bt₂基因突變體的蔗糖向淀粉的轉(zhuǎn)變過程明顯受阻，致使其胚乳的含糖量較高，乳熟期胚乳的可溶性糖含量高達15％以上。甜玉米起源于美洲，至今已有100多年的栽培歷史。我國甜玉米育種始于20世紀50年代，興盛于本世紀初，最初的育種材料引自美國。目前，我國育種資源仍主要來自美國、泰國和我國臺灣等地，育種技術(shù)上主要以選育二環(huán)系為主，基礎(chǔ)較薄弱，整體水平與國外先進水平相比還有一定差距。搜集與研究遺傳基礎(chǔ)多樣、適應(yīng)性強的甜玉米育種資源并加以有效利用和開發(fā)，才能從根本上提升甜玉米育種水平。

玉米胚乳含糖突變基因su₁、sh₂的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用引發(fā)甜玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了巨大社會經(jīng)濟效益。su₁類型普甜玉米含糖量低主要用于加工，籽粒胚乳中的含糖量達8％～10％，相當于普通玉米的3～4倍。普甜玉米籽粒種皮較薄，胚乳中有1/3的淀粉為分子量較小的支鏈淀粉。這種淀粉溶解于水，具有粘性，被稱為水溶性多糖(water-soluble polysaccharide，簡稱WSP)，易于被人體吸收。而淀粉含量只占35％左右，比普通玉米減少了一半。籽粒成熟后皺縮透明，其較高的糖分含量與WSP構(gòu)成了其特有的粘、香的風味。sh₂類型超甜玉米，是目前第2個最廣泛利用的胚乳類型，含糖量比普通甜玉米高1倍或以上，可達20％以上，籽粒中主要是蔗糖、果糖、葡萄糖，淀粉少，一般以鮮穗供應(yīng)市場為主，但植物糖原即水溶性多糖WSP含量少僅5％左右，因而不具粘性香味不濃，保鮮期較短，種子發(fā)芽率較低。sh_2-i基因最早由美國科學(xué)家Gyula Ficsor利用EMS方法從成熟玉米籽粒誘變而來，2001年佛羅里達大學(xué)Curt Hannah引入甜玉米群體，2001年威斯康辛大學(xué)Bill Tracy培育su₁sh_2-i自交系，2008年成功培育sh₂sh_2-isu₁su₁基因型雜交種。sh_2-i突變導(dǎo)致ADP葡萄糖-焦磷酸化酶部分失活，突變體內(nèi)含子剪切位點大約10％轉(zhuǎn)錄本被正確剪切產(chǎn)生淀粉。與sh₂比較，籽粒中蔗糖含量低、WSP和淀粉含量較高，sh_2-i為sh₂的等位基因。利用基因sh_2-i，結(jié)合su₁、sh₂能夠培育多基因復(fù)合甜玉米品種，克服sh₂單基因遺傳上的缺陷，該基因材料有潛在的遺傳研究與商業(yè)價值，其研究與利用將擴展甜玉米的遺傳基礎(chǔ)，為開發(fā)新型甜玉米品種奠定基礎(chǔ)。

因此，基于甜玉米新基因sh_2-i種質(zhì)特征，需要尋找一種高效、準確的鑒定方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服僅從籽粒外觀和形態(tài)鑒定判別sh_2-i基因種質(zhì)及其滲入超甜玉米的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種檢測sh_2-i基因型甜玉米的引物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測sh_2-i基因型甜玉米的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述引物或試劑盒的應(yīng)用。

實踐證明，本發(fā)明可有效鑒定sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)滲入超甜玉米基因型中，是一種獲得早代甜玉米基因型的高效、準確的育種材料鑒定技術(shù)。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種檢測sh_2-i基因型甜玉米的引物，其序列如下：

SL3：5′-CACTGTATGGCGGCATTGTT-3′；(SEQ ID No：1)

sh2R：5′-AAGTTCCAGCCTCCTTCCTG-3′；(SEQ ID No：2)

shiR：5′-TCCAGCCTCCTTCCGCTCC-3′。(SEQ ID No：3)

一種檢測sh_2-i基因型甜玉米的試劑盒，包括上述引物。

所述的檢測sh_2-i基因型甜玉米的引物在鑒定sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)滲入超甜玉米基因型中的應(yīng)用。

所述的檢測sh_2-i基因型甜玉米的試劑盒在鑒定sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)滲入超甜玉米基因型中的應(yīng)用。

一種sh_2-i基因型甜玉米分子技術(shù)鑒定的方法，包括如下步驟：

(1)引進攜帶sh_2-i基因籽粒甜玉米種質(zhì)資源；

(2)資源種植、自交、篩選鑒定：將引進的攜帶sh_2-i基因籽粒甜玉米種質(zhì)在田間種植，連續(xù)經(jīng)歷5季5輪以上選株自交，穗選、粒選、田間株選，獲得性狀一致的自交系(純系)；

(3)分別種植sh_2-i、sh₂甜玉米自交系，通過雜交、回交、自交培育sh₂sh_2-i種質(zhì)材料；

(4)將sh_2-i、sh₂甜玉米自交系sh₂基因區(qū)域進行高通量測序，比較不同基因材料在sh₂區(qū)域基因組差異，根據(jù)基因編碼特異差異設(shè)計PCR擴增特征引物；其序列如SEQ ID No：1～3所示；

(5)提取不同甜玉米種質(zhì)葉片DNA，以其為模板，進行PCR擴增；

(6)將步驟(5)中PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶差異進行判斷，或PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，通過對不同種質(zhì)材料DNA序列的差異鑒定sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)是否滲入sh₂超甜玉米中。

采用引物SL3/shiR的PCR擴增產(chǎn)物電泳中出現(xiàn)明亮目的條帶，則為基因型sh_2-ish_2-i或雜合基因型sh_2-ish₂；該目的條帶的長度是579bp，堿基序列如SEQ ID No：4所示：

CGGCATTGTTTGATTATTTCAGTTCGCACCCGTTGGACCTTGCTCATTAAAAAAGTTTATACCATGGAGTCTTTGCATGTAGTTGTGTAGTAGGGGAAGAGTGGCATAGGAGGAATCACAACTTCAGCTAGCTTCTCTAGCCTTAGGGTATTTTTGTCTTTTTGCAGTTCGGTCTTTTCGCAGCCCTGCGCTGCCCCCCCTGTCCGCCTGTCCCTAGACCTGTTTTGCGTCGGCGGGGAAGACAGTTGACAGGAAGTACACGATCTTCGTGTCCGATGCCGATCTTCATGCGAGCAGCGAGCCACTACGTCGTTGCGCTGCCAGTGTCGGCTATGGCATCCAGGCACTCGTTGTGCACGTTGACGATGAGCTCGAAGCCGGTCCGGGTGAACGCGAGCAGCACGGTGAGGTCAACGTCGTACATCCGCACGTCGATGCTGAGGCCAGCCAGCAGCGGCATGACAGATTGCGGCGTCAGGAGATTGTGCCAGTAGGTGGCGGGGCTGGGGGCAGACCGGCAGGCGAGGCCTATGGGCGGGCAGTGCTGTGAGTTAGAGCAGTGTGGCAGTGTTGGTGGTA

采用引物SL3/sh2R的PCR擴增產(chǎn)物電泳中出現(xiàn)明亮目的條帶，則為基因型sh₂sh₂或雜合基因型sh_2-ish₂；該目的條帶的長度是619bp，堿基序列如SEQ ID No：5所示：

GGCATTGTTTGATTATTTCAGTTCGCACCCGTTGGACCTTGCTCATTAAAAAAGTTTATACCATGGAGTCTTTGCATGTAGTTGTGTAGTAGGGGAAGAGTGGCATAGGAGGAATCACAACTTCAGCTAGCTTCTCTAGCGGTCTAGCCTTAGGGTATTTTTGTCTTTTTGCAGTTCGGTCTTTTCGCAGCCCTGCGCTGCCCCCACCTGTCCGCCTGTCCCTAGACCTGTTTTGCGTCGGCGGGGAAGACAGTTGACAGGAAGGACACGATCTTCGTGTCCGATGCCGATCTTCATGCGAGCAGCGAGCCACTACGTTGCGTTGCCAGTGTCGGCTATGGCATCCAGGCACTCGTTGTGCACGTTGACGATGAGCTCGAAGCCGGTCCGGGTGAACGCGAGCAGCACGGTGAGGTCAACGTCGTACATCCGCACGTCGATGCTGAGGCCAGCCAGCAGCGGCATGACAGATTGCGGCGTCAGGAGATTGTGCCAGTAGGTGGCGGGGCTGGGGGCAGACCGGCAGGCGAGGCCTATGGGCGGGCAGTGCTGTGAGTTAGAGCAGTGTGGCAGTGTTGGTGGTAGTGGTGACACCCTTCGGGAGCGGAAAAGAGAAGAG

采用引物SL3/shiR或SL3/sh2R的PCR擴增產(chǎn)物電泳中均出現(xiàn)明亮目的條帶，則為雜合基因型sh_2-ish₂；

步驟(1)中所述的sh_2-i基因籽粒甜玉米種質(zhì)資源引自美國威斯康辛大學(xué)Bill Tracy，sh_2-i基因種質(zhì)與sh₂不同，但都是隱性胚乳突變基因。

步驟(2)中所述的資源種植按大田常規(guī)育種進行，在廣東1年春秋兩季種植。

步驟(3)中所述的雜交、回交、自交培育中間種質(zhì)材料按常規(guī)育種方法進行。

步驟(4)中所述的高通量測序由北京百邁客生物科技有限公司(Biomarker Tech.)按基因測序方法進行。所述的引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司(Invitrogen Biotech.)合成；

步驟(5)中所述的提取不同甜玉米種質(zhì)葉片DNA，以其為模板，進行PCR擴增按常規(guī)分子生物學(xué)方法進行。

步驟(6)中所述的PCR產(chǎn)物測序由上海英濰捷基生物技術(shù)公司(Invitrogen Biotech.)按基因測序方法進行。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明利用分子技術(shù)進行甜玉米sh_2-i基因型鑒定，能夠有效鑒定sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)滲入超甜玉米基因型中?？煽朔藘H從籽粒外觀和形態(tài)表現(xiàn)型判別sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)滲入sh₂超甜玉米種質(zhì)的不確定性、盲目性的不足與缺點，準確識別sh_2-i基因型。

(2)本發(fā)明的方法是一種可早期獲得sh_2-i甜玉米基因型的高效、準確的育種材料鑒定技術(shù)。

附圖說明

圖1是sh_2-i、sh₂基因型甜玉米與普通玉米B73在sh₂基因區(qū)域測序堿基差異圖。

圖2是實施例1中sh_2-i、sh₂基因型甜玉米PCR檢測電泳圖；其中，1，2：Y4(基因型sh_2-ish_2-i)；3，4：B7(基因型sh₂sh₂)；5，6：雜合基因型(sh_2-ish₂)。引物類型：1，3，5：SL3/shiR；2，4，6：SL3/sh2R；M：DL2000Marker。

圖3是實施例3中sh_2-i、sh₂基因型甜玉米PCR檢測電泳圖；其中，1，2：Y3(基因型sh_2-ish_2-i)；3，4：Y6(基因型sh_2-ish_2-i)；5，6：B6(基因型sh₂sh₂)；7，8：B84(基因型sh₂sh₂)；9，10，11，12雜合基因型(sh_2-ish₂)。引物類型：1，3，5，7，9，11：SL3/shiR；2，4，6，8，10，12：SL3/sh2R；M：DL2000Marker。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

sh_2-i、sh₂基因型甜玉米與普通玉米B73在sh₂基因區(qū)域測序堿基差異圖，如圖1所示。

實施例1

本發(fā)明提供一種sh_2-i基因型甜玉米分子技術(shù)鑒定的方法。能夠有效鑒定sh_2-i基因型或sh_2-i基因種質(zhì)滲入超甜玉米sh₂基因型中。本發(fā)明包括sh_2-i種質(zhì)資源引進、sh_2-i、sh₂甜玉米自交系種植、選育，雜交、回交、自交等常規(guī)育種，sh_2-i、sh₂甜玉米自交系sh₂基因區(qū)域高通量測序、根據(jù)基因編碼特異差異設(shè)計PCR擴增特征引物、不同甜玉米種質(zhì)葉片DNA提取及PCR擴增等。

詳細過程如下：

(1)甜玉米種質(zhì)或自交系準備：B7(基因型sh₂sh₂)、Y4(基因型sh_2-ish_2-i)、Z5、Z6(雜合基因型，sh_2-ish₂)(購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所)；

(2)種植：將步驟(1)中甜玉米材料種植；

(3)DNA提取、PCR擴增：提取不同甜玉米材料葉片DNA，以其為模板，根據(jù)不同基因材料在sh₂區(qū)域基因編碼差異區(qū)段設(shè)計PCR擴增特征引物，其序列如SEQ ID No：1～3所示，進行PCR擴增；

(4)將步驟(3)中PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶初步進行判斷，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，通過對不同種質(zhì)材料DNA序列的差異鑒定sh_2-i籽?；蛐突騭h_2-i基因種質(zhì)是否滲入其他甜玉米基因組中；

步驟(2)中所述的甜玉米種植按常規(guī)發(fā)芽或大田常規(guī)種植。

步驟(3)中所述的提取不同甜玉米種質(zhì)或自交系葉片DNA，以其為模板，進行PCR擴增按常規(guī)分子生物學(xué)方法進行。

步驟(4)中所述的PCR產(chǎn)物測序由上海英濰捷基生物技術(shù)公司(Invitrogen Biotech.)按基因測序方法進行。

電泳結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明：應(yīng)用引物SL3/shiR進行PCR擴增，泳道1和5中出現(xiàn)明亮目的條帶，說明存在sh_2-i基因，泳道3沒有擴增出目的條帶，說明沒有sh_2-i基因；而采用引物SL3/sh2R進行PCR擴增，泳道4和6中出現(xiàn)明亮目的條帶，說明存在sh₂基因，泳道2沒有擴增出目的條帶，說明沒有sh₂基因。結(jié)果與實際基因型相符。

實施例2

一種甜玉米sh_2-i基因型甜玉米分子技術(shù)鑒定的方法。詳細過程如下：

(1)甜玉米種質(zhì)或自交系準備：S06(基因型sh₂sh₂)、Y1(基因型sh_2-ish_2-i)、Z1、Z2(雜合基因型，sh_2-ish₂)(購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所)；

(2)種植：將步驟(1)中甜玉米材料種植；

(3)DNA提取、PCR擴增：提取不同甜玉米材料葉片DNA，以其為模板，根據(jù)不同基因材料在sh₂區(qū)域基因編碼差異設(shè)計PCR擴增特征引物，其序列如SEQ ID No：1～3所示，進行PCR擴增；

(4)將步驟(3)中PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶初步進行判斷，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，通過對不同種質(zhì)材料DNA序列的差異鑒定sh_2-i籽粒基因型或sh_2-i基因種質(zhì)是否滲入其他甜玉米基因組中；

步驟(2)中所述的甜玉米種植按常規(guī)發(fā)芽或大田常規(guī)種植。

步驟(3)中所述的提取不同甜玉米種質(zhì)或自交系葉片DNA，以其為模板，進行PCR擴增按常規(guī)分子生物學(xué)方法進行。

步驟(4)中所述的PCR產(chǎn)物測序由上海英濰捷基生物技術(shù)公司(Invitrogen Biotech.)按基因測序方法進行。

實施例3

本發(fā)明提供一種sh_2-i基因型甜玉米分子技術(shù)鑒定的方法。

詳細過程如下：

(1)甜玉米種質(zhì)或自交系準備：B6、B84(基因型sh₂sh₂)、Y3、Y6(基因型sh_2-ish_2-i)、Z9，Z10，Z11，Z12雜合基因型(sh_2-ish₂)(購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所)；

(2)種植：將步驟(1)中甜玉米材料種植；

(3)DNA提取、PCR擴增：提取不同甜玉米材料葉片DNA，以其為模板，根據(jù)不同基因材料在sh₂區(qū)域基因編碼差異設(shè)計PCR擴增特征引物，其序列如SEQ ID No：1～3所示，進行PCR擴增；

(4)將步驟(3)中PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶初步進行判斷，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，通過對不同種質(zhì)材料DNA序列的差異鑒定sh_2-i籽粒基因型或sh_2-i基因種質(zhì)是否滲入其他甜玉米基因組中；

步驟(2)中所述的甜玉米種植按常規(guī)發(fā)芽或大田常規(guī)種植。

步驟(3)中所述的提取不同甜玉米種質(zhì)或自交系葉片DNA，以其為模板，進行PCR擴增按常規(guī)分子生物學(xué)方法進行。

步驟(4)中所述的PCR產(chǎn)物測序由上海英濰捷基生物技術(shù)公司(Invitrogen Biotech.)按基因測序方法進行。

電泳結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明：應(yīng)用引物SL3/shiR進行PCR擴增，泳道1、3、9和11中出現(xiàn)明亮目的條帶，說明存在sh_2-i基因，泳道5、7中沒有擴增出目的條帶，說明沒有sh_2-i基因；而采用引物SL3/sh2R進行PCR擴增，泳道6、8、10、12中出現(xiàn)明亮目的條帶，說明存在sh₂基因，泳道2、4中沒有擴增出目的條帶，說明沒有sh₂基因。結(jié)果與實際基因型相符。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所

<120> 一種檢測sh2-i基因型甜玉米的引物及試劑盒與應(yīng)用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SL3

<400> 1

cactgtatgg cggcattgtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sh2R

<400> 2

aagttccagc ctccttcctg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> shiR

<400> 3

tccagcctcc ttccgctcc 19

<210> 4

<211> 579

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物SL3/shiR的PCR擴增產(chǎn)物電泳中出現(xiàn)明亮目的條帶的序列

<400> 4

cggcattgtt tgattatttc agttcgcacc cgttggacct tgctcattaa aaaagtttat 60

accatggagt ctttgcatgt agttgtgtag taggggaaga gtggcatagg aggaatcaca 120

acttcagcta gcttctctag ccttagggta tttttgtctt tttgcagttc ggtcttttcg 180

cagccctgcg ctgccccccc tgtccgcctg tccctagacc tgttttgcgt cggcggggaa 240

gacagttgac aggaagtaca cgatcttcgt gtccgatgcc gatcttcatg cgagcagcga 300

gccactacgt cgttgcgctg ccagtgtcgg ctatggcatc caggcactcg ttgtgcacgt 360

tgacgatgag ctcgaagccg gtccgggtga acgcgagcag cacggtgagg tcaacgtcgt 420

acatccgcac gtcgatgctg aggccagcca gcagcggcat gacagattgc ggcgtcagga 480

gattgtgcca gtaggtggcg gggctggggg cagaccggca ggcgaggcct atgggcgggc 540

agtgctgtga gttagagcag tgtggcagtg ttggtggta 579

<210> 5

<211> 619

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物SL3/sh2R的PCR擴增產(chǎn)物電泳中出現(xiàn)明亮目的條帶的序列

<400> 5

ggcattgttt gattatttca gttcgcaccc gttggacctt gctcattaaa aaagtttata 60

ccatggagtc tttgcatgta gttgtgtagt aggggaagag tggcatagga ggaatcacaa 120

cttcagctag cttctctagc ggtctagcct tagggtattt ttgtcttttt gcagttcggt 180

cttttcgcag ccctgcgctg cccccacctg tccgcctgtc cctagacctg ttttgcgtcg 240

gcggggaaga cagttgacag gaaggacacg atcttcgtgt ccgatgccga tcttcatgcg 300

agcagcgagc cactacgttg cgttgccagt gtcggctatg gcatccaggc actcgttgtg 360

cacgttgacg atgagctcga agccggtccg ggtgaacgcg agcagcacgg tgaggtcaac 420

gtcgtacatc cgcacgtcga tgctgaggcc agccagcagc ggcatgacag attgcggcgt 480

caggagattg tgccagtagg tggcggggct gggggcagac cggcaggcga ggcctatggg 540

cgggcagtgc tgtgagttag agcagtgtgg cagtgttggt ggtagtggtg acacccttcg 600

ggagcggaaa agagaagag 619