本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)，尤其涉及一種全血直接擴(kuò)增核酸檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的引物、引物組、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：PCR是一種利用DNA聚合酶將極微量的標(biāo)本百億倍甚至千億倍擴(kuò)大的現(xiàn)代技術(shù)，其起始模板通常是基因組DNA。人類基因組DNA主要來源于血液，需要對(duì)其進(jìn)行提取，除了商品化試劑盒外，還有很多其他的提取方法，如：酚/氯仿抽提法、碘化鉀法、直接煮沸法、高鹽沉淀法等。這些方法雖然有效，但是操作步驟繁瑣，容易造成污染，而且基本上都需要用到恒溫水浴鍋、低溫高速離心機(jī)等裝置，對(duì)儀器設(shè)備和試劑的要求都比較多。如果不經(jīng)過DNA提取而直接進(jìn)行PCR，則可以大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本，同時(shí)也避免了因多步操作可能造成的樣本間交叉污染。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用全血直接進(jìn)行DNA擴(kuò)增。如：McCuskerJ.等人對(duì)一定量的全血標(biāo)本95℃預(yù)處理15分鐘，以降低血液中的PCR抑制成份對(duì)擴(kuò)增的影響；MercierB在全血擴(kuò)增前利用3個(gè)循環(huán)的預(yù)變性程序來去除血液中的PCR抑制成分等。這些方法雖然以全血為起始模板直接擴(kuò)增DNA，但操作不夠簡(jiǎn)便，條件難以控制，重復(fù)性不好，不能形成商品化試劑盒，不利于推廣使用，且相關(guān)研究未見后續(xù)進(jìn)一步報(bào)道?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葉酸利用能力受遺傳結(jié)構(gòu)(基因)影響，如果與葉酸代謝相關(guān)的酶活性偏低(即相關(guān)基因功能異常)，這一人群如按常量(400微克/天)補(bǔ)充葉酸，機(jī)體葉酸水平也會(huì)不足。遺傳體質(zhì)的差異導(dǎo)致了機(jī)體對(duì)葉酸利用能力的差異，因此，葉酸增補(bǔ)應(yīng)因人而異，增補(bǔ)過多或過少都不利于胎兒健康和孕婦健康?？茖W(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，與甲基類維生素(葉酸及維生素B12)代謝密切相關(guān)的基因是MTHFR。MTHFR編碼蛋白5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶，其基因變異會(huì)引起相應(yīng)的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，導(dǎo)致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而增加新生兒出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)或自發(fā)性流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)。MTHFR全稱5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶)，位于一號(hào)染色體1p36.3位置。MTHFE全長(zhǎng)19.3kb，mRNA全長(zhǎng)7105bp，共有外顯子12個(gè)，編碼共有657個(gè)氨基酸編碼子的蛋白。亞甲基四氫葉酸還原酶催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之能為同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。該酶是人體葉酸代謝中的一個(gè)十分重要的酶。目前市面上檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的方法都是需要從人全血或口腔上皮組織中抽提人基因組DNA，然后在熒光定量PCR儀上，利用熒光探針或熒光染料法進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)弱或溶解曲線來判斷突變類型。這些方法雖然可以做到當(dāng)天出結(jié)果，但是不適合國(guó)內(nèi)二三線城市的醫(yī)院或婦幼保健院內(nèi)檢測(cè)。原因如下：1、熒光定量PCR儀價(jià)格昂貴，國(guó)產(chǎn)儀器售價(jià)也超過幾十萬元，不是所有醫(yī)院都能配備；2、試劑盒在不同廠家或不同型號(hào)的熒光定量PCR儀上判讀方法或結(jié)果不一致，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)或測(cè)序驗(yàn)證后才能大規(guī)模檢測(cè)；3、需要抽提基因組DNA，額外增加檢測(cè)人員工作量及檢測(cè)成本，并且容易造成樣本污染。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種適用于二三線城市的醫(yī)院或婦幼保健院內(nèi)檢測(cè)的葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的方法。一種利用全血直接擴(kuò)增核酸檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的方法，包括取全血樣本為起始材料，加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，加入擴(kuò)增目的基因引物，直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增核酸反應(yīng)試劑為BRTaq聚合酶，所述基因引物的引物和探針序列如下：用于MTHFRC677T型多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的引物：MTHFRC677T-seq-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；MTHFRC677T-seq-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；2)用于MTHFRA1298C型多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的引物：MTHFRA1298C-seq-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；MTHFRA1298C-seq-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述BRTaq聚合酶位于緩沖液條件下，所述緩沖液的pH值為8.8，鉀離子濃度為95mmol/L。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述緩沖液為15mMTrispH8.8，95mMKCl，2.5mMMgCl2，0.02％Tween-20，2％DMSO。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，全血樣本為液體血液。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，液體血液中包括有抗凝劑，所述抗凝劑包括EDTA抗凝、肝素抗凝、檸檬酸鈉抗凝。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，核酸擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，包括下述具體步驟：1)獲得含有抗凝劑的血液樣本；2)每個(gè)PCR體系為30μL，包含10×BRTaqBuffer3μL，BRTaq0.2μL，血液樣品3μL，正向反向引物各1μL，dNTP2.4μL，ddH2O19.4μL；3)將配置好的PCR體系放入PCR儀中，進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)條件為：98℃3分鐘預(yù)變性；循環(huán)階段，98℃30秒變性，58℃30秒退火，72℃30秒延伸，40個(gè)循環(huán)；4)將PCR儀中反應(yīng)完成的產(chǎn)物直接送測(cè)序或進(jìn)行DNA凝膠電泳后將目的片段切下送測(cè)序。無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂貴的熒光定量PCR儀，檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號(hào)SNP位點(diǎn)的血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的引物。無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂貴的熒光定量PCR儀，檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)的血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的引物。無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂貴的熒光定量PCR儀，同時(shí)檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號(hào)和rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)、通過PCR產(chǎn)物測(cè)序來判斷的血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒(BRTaq及專用buffer)。無需抽提人基因組DNA，而從全血直接PCR，無需昂貴的熒光定量PCR儀，同時(shí)檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號(hào)和rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)、通過PCR產(chǎn)物測(cè)序來判斷的血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的檢測(cè)方法。血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的引物，其包括以下引物對(duì)：(1)正向引物MTHFR-C677T-seq-F，其核苷酸序列SEQIDN0.1：GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT；反向引物MTHFR-C677T-seq-R，其核苷酸序列SEQIDN0.2：TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT；(2)由正向引物MTHFR-C677T-seq-F或反向引物MTHFR-C677T-seq-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單個(gè)核苷酸得到的引物；上述引物對(duì)應(yīng)的目的基因?yàn)?，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因，以該基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增所得DNA片段包含rs1801133號(hào)SNP位點(diǎn)。本發(fā)明設(shè)定并合成特定的所述特異性引物，可檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號(hào)SNP位點(diǎn)。血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的引物，其包括以下引物對(duì)：(1)正向引物MTHFR-A1298C-seq-F，其核苷酸序列SEQIDN0.3：GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG；反向引物MTHFR-A1298C-seq-R，其核苷酸序列SEQIDN0.4：CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT：(2)由正向引物MTHFR-A1298C-seq-F或反向引物MTHFR-A1298C-seq-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單個(gè)核苷酸得到的引物；上述引物對(duì)應(yīng)的目的基因?yàn)?，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因，以該基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增所得DNA片段包含rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)。本發(fā)明設(shè)定并合成特定的所述特異性引物，可檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)。血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，試劑盒包括葉酸代謝相關(guān)基因引物對(duì)、dNTP、BRTaq及其專用buffer和ddH2O。BRTaq為浙江中迪生物科技有限公司研發(fā)的血液耐受DNA聚合酶。BRTaq專用buffer工作體系為：15mMTrispH8.8，95mMKCl，2.5mMMgCl2，0.02％Tween-20，2％DMSO。血液直接PCR法檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，其所述方法包括利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，將所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序，在測(cè)序圖上分析突變位點(diǎn)。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒有如下優(yōu)點(diǎn)：1、血液成分復(fù)雜，里面含有很多抑制PCR反應(yīng)的因子，血漿、血紅蛋白和乳鐵蛋白等會(huì)抑制Taq酶活性，擴(kuò)增效率下降，還有一些成分會(huì)使引物發(fā)生降解，從而造成全血直接PCR的失敗。我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性PCR引物，使用經(jīng)過改造的Taq酶和減少血液中抑制因子影響的PCR緩沖液，配制了適合全血PCR的反應(yīng)體系，使之耐受全血中PCR抑制劑。2、PCR條件寬泛，無需預(yù)實(shí)驗(yàn)，適用于多數(shù)普通PCR儀。3、PCR模板為全血，無論是EDTA抗凝，肝素抗凝還是檸檬酸鈉抗凝，都適用。無需抽提基因組DNA，所以不需要額外購(gòu)買基因組DNA抽提試劑盒，節(jié)約成本，同時(shí)減少污染機(jī)會(huì)，適合大規(guī)模樣本的檢測(cè)。4、所需全血樣本極少，最少只需2μl，且對(duì)在4度冰箱保存7天內(nèi)的血液樣本，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，有利于復(fù)查，或者可以利用病人其他檢測(cè)的血液樣本，無需病人專門采血，減輕病人痛苦。5、PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)電泳純化直接外送商業(yè)化公司測(cè)序，減少工作量。同時(shí)，在測(cè)序圖上分析突變位點(diǎn)，一目了然，準(zhǔn)確率100％。操作簡(jiǎn)單，成本低廉，快捷準(zhǔn)確高通量，滿足二三線城市普通醫(yī)院的檢測(cè)。附圖說明圖1是本發(fā)明PCR檢測(cè)方法凝膠電泳結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例一不同抗凝來源的血液PCR凝膠電泳結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例二檢測(cè)7份不同來源的人血液樣本的檢測(cè)結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例三對(duì)同一個(gè)樣本的血液進(jìn)行重復(fù)5次的檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例將有助于對(duì)本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。葉酸代謝有關(guān)基因多態(tài)性PCR檢測(cè)方法凝膠電泳結(jié)果圖見圖1，其中，M：100bpDNAladder，從上到下依次為1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。其中500bp是亮帶；1：MTHFR-C677T突變-血樣1；2：MTHFR-A1298C突變-血樣1；3：MTHFR-C677T突變-血樣2；4：MTHFR-A1298C突變-血樣2。電泳結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，條帶清晰，無明顯雜帶，說明PCR體系、反應(yīng)條件以及引物特異性非常好。PCR產(chǎn)物交由上海祥音生物科技有限公司測(cè)序。各種突變類型的測(cè)序結(jié)果如下：其中，PCR產(chǎn)物序列兩端為引物結(jié)合部位，斜體部分為基因外顯子，加粗下劃線部位為SNP位點(diǎn)。MTHFRC677T：TGCTCAAGGCAGGACAATTCTTCCGCTTTGTGMTHFRA1298C：TCTTCCCCTGCCTTTGGGGAGAACCAAACCGG實(shí)施例一不同抗凝來源的血液樣本的PCR：用不同抗凝劑采集同一人的新鮮血液，分別收集在EDTA抗凝管，檸檬酸抗凝管和肝素抗凝管內(nèi)。按以下方法配制PCR反應(yīng)液，組分體積μl10×BRTaqBuffer3dNTP2.4正反向引物混合物20μM2ddH2019.4血液樣品3BRTaq0.2PCR反應(yīng)條件如下：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃30s，40cycle；72℃10min，4℃hold.不同抗凝來源的血液PCR電泳圖見圖2，其中M：100bpDNAladder，從上到下依次為1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，其中500bp是亮帶；1：肝素抗凝血樣品一的MTHFR-C677T；2：肝素抗凝血樣品二的MTHFR-C677T；3：檸檬酸抗凝血樣品一的MTHFR-C677T；4：檸檬酸抗凝血樣品二的MTHFR-C677T；5：EDTA抗凝血樣品一的MTHFR-C677T；6：EDTA抗凝血樣品二的MTHFR-C677T。電泳結(jié)果表明：不同抗凝方法來源的血液在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中都能獲得預(yù)期的結(jié)果，PCR條帶清晰，無雜帶。測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證這三種抗凝方法來源的血液突變位點(diǎn)一致。實(shí)施例二檢測(cè)7份不同來源的人血液樣本，按以下方法配制PCR反應(yīng)液，組分體積μl10×BRTaqBuffer3dNTP2.4正反向引物混合物20μM2ddH2019.4血液樣品3BRTaq0.2PCR反應(yīng)條件如下：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃30s，40cycle；72℃10min，4℃hold.檢驗(yàn)7份不同來源的人血液樣本的PCR電泳圖見圖3，其中M：100bpDNAladder，從上到下依次為1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp。其中500bp是亮帶。1：檸檬酸抗凝血樣品一的MTHFRC677T位點(diǎn)2：檸檬酸抗凝血樣品二的MTHFRC677T位點(diǎn)3：檸檬酸抗凝血樣品三的MTHFRC677T位點(diǎn)4：檸檬酸抗凝血樣品四的MTHFRC677T位點(diǎn)5：檸檬酸抗凝血樣品五的MTHFRC677T位點(diǎn)6：檸檬酸抗凝血樣品六的MTHFRC677T位點(diǎn)7：檸檬酸抗凝血樣品七的MTHFRC677T位點(diǎn)8：檸檬酸抗凝血樣品一的MTHFRAl298C位點(diǎn)9：檸檬酸抗凝血樣品二的MTHFRAl298C位點(diǎn)10：檸檬酸抗凝血樣品三的MTHFRAl298C位點(diǎn)11：檸檬酸抗凝血樣品四的MTHFRAl298C位點(diǎn)12：檸檬酸抗凝血樣品五的MTHFRAl298C位點(diǎn)13：檸檬酸抗凝血樣品六的MTHFRAl298C位點(diǎn)14：檸檬酸抗凝血樣品七的MTHFRAl298C位點(diǎn)電泳結(jié)果表明：7份不同來源的人血液樣本在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中都能獲得預(yù)期的結(jié)果，PCR條帶清晰，無雜帶。測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證7份不同來源的血液突變位點(diǎn)與已知結(jié)果一致。實(shí)施例三對(duì)同一個(gè)樣本的血液進(jìn)行重復(fù)5次的檢測(cè)，按以下方法配制PCR反應(yīng)液，組分體積μl10×BRTaqBuffer3dNTP2.4正反向引物混合物20μM2ddH2019.4血液樣品3BRTaq0.2PCR反應(yīng)條件如下：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃30s，40cycle；72℃10min，4℃hold.該樣本的血液進(jìn)行重復(fù)5次檢驗(yàn)的PCR電泳圖見圖4，其中M：100bpDNAladder，從上到下依次為1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp。其中500bp是亮帶。1-5：該樣本的血液進(jìn)行重復(fù)5次MTHFRC677T位點(diǎn)檢驗(yàn)。SEQUENCELISTING<110>浙江中迪生物科技有限公司<120>全血直接擴(kuò)增核酸檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的方法<130>2017<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>416<212>DNA<213>Rplasmid<400>1tgctcaaggcaggacagtgtgggagtttggagcaatccacccccactcttggaactgggc60tctgagccacctcccctgagagtcatctctggggtcagaagcatatcagtcatgagccca120gccactcactgttttagttcaggctgtgctgtgctgttggaaggtgcaagatcagagccc180ccaaagcagaggactctctctgcccagtccctgtggtctcttcatccctcgccttgaaca240ggtggaggccagcctctcctgactgtcatccctattggcaggttaccccaaaggccaccc300cgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggagc360tcgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttccgctttgtg416<210>2<211>160<212>DNA<213>人類<400>2tcttcccctgcctttggggagctgaaggactactacctcttctacctgaagagcaagtcc60cccaaggaggagctgctgaagatgtggggggaggagctgaccagtgaagacaagtgtctt120tgaagtcttcgttctttacctctcgggagaaccaaaccgg160<210>3<211>22<212>DNA<213>人類<400>3gcacttgaaggagaaggtgtct22<210>4<211>23<212>DNA<213>人類<400>4tgtgtcagcctcaaagaaaagct23<210>5<211>21<212>DNA<213>人類<400>5ggaggagctgctgaagatgtg21<210>6<211>25<212>DNA<213>人類<400>6cccgagaggtaaagaacaaagactt25當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3