本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，涉及一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及檢測方法。適用于臨床常見致病細菌的菌種鑒定，可以為臨床細菌感染患者合理地進行抗菌藥物治療提供指導。

背景技術：

細菌感染是臨床常見的感染性疾病，其發(fā)病率和死亡率高，如果得不到早期的診斷和治療，會嚴重危及患者的生命。從臨床樣本中直接分離得到細菌表示感染嚴重需要立即進行抗菌治療。不同的致病菌對藥物種類和濃度的敏感性不同，治療成功的關鍵在于早期應用合適足量的藥物。而傳統(tǒng)的檢測致病菌的方法如顯微鏡檢查、培養(yǎng)法、生物化學檢查和免疫學方法等，由于各種因素的影響，通常需要幾種方法聯(lián)合使用，而且耗時也較長，需要1～3d，這期間用藥不當往往使得患者病情加重或增加菌株耐藥性。特別是在多種細菌聯(lián)合感染的情況下，更增加了菌種鑒定和用藥的復雜性。因此，建立一種快速且特異性強的微生物檢測方法是十分必要的。

PCR方法是近年來發(fā)展起來的診斷技術，這種技術快速、靈敏，在臨床微生物檢測方面獲得了極為廣泛的應用；但是PCR檢測方法也存在一些不足，如檢測每一種病原菌都需要特異性引物，因而每次反應只能確定一種病原菌的有無，這種“一對一”的模式不適合檢測混合感染的復雜標本。臨床微生物的檢測急需建立一種“一對多”的檢測系統(tǒng)，可以通過一次反應檢測多種目標病原體。而通過恒溫擴增-分子信標探針——一種新興的高通量檢測技術，使得通過一次反應對多種病原菌的同時檢測成為可能。

轉(zhuǎn)錄介導的核酸擴增技術(Transcription mediated amplification，恒溫擴增)是近年來發(fā)展起來的一種直接快速檢測RNA的等溫擴增技術，它克服了以往核酸擴增的不足，更為簡便高效，尤其適用于RNA病毒的檢測。與PCR不同，恒溫擴增是在M-MLV、T7RNA聚合酶兩種酶的共同協(xié)作下，在41～42℃，由一對引物指導的連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等溫擴增酶促反應。其中一條引物其5’端具有被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列。在恒溫擴增基礎上結合分子信標(molecular beacon)探針建立的等溫擴增技術，具有以下優(yōu)點：⑴等溫擴增：反應在同一恒溫體系條件下進行；⑵快速高效、靈敏度高:該反應時一種無需升降溫的連續(xù)快速擴增，也不需RT-PCR反應中第一階段15～30分鐘的反轉(zhuǎn)錄過程，整個反應時間短、單鏈RNA產(chǎn)物積累迅速，可以在30～60分鐘內(nèi)完成檢測，一個反應可同時完成對多種臨床常見致病細菌的快速鑒定；并使模板RNA擴增10⁹倍以上，靈敏度甚至可以達到檢測拷貝數(shù)為個位的模板RNA。恒溫擴增技術比目前商品化的免疫檢測試劑盒敏感10～1000倍，比常規(guī)PCR方法也敏感10～100倍；⑶特異性強：反應不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會被擴增，而通過分子信標探針進行熔解曲線分析進一步提高了檢測的特異性和靈敏度；⑷設計簡單：只需設計1對引物和1條探針來識別靶RNA的3個不同區(qū)域。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用，以解決現(xiàn)有技術中臨床常見致病細菌檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易污染出現(xiàn)假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的引物和分子信標探針，包括如下序列：

正向引物F1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物R1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

正向引物F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

反向引物R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

分子信標探針P1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

分子信標探針P2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

分子信標探針P3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述反向引物R1的5’端的31個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端20個堿基是與細菌16S rRNA互補的特異性序列；

所述反向引物R2的5’端的31個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端20個堿基是與細菌16S rRNA互補的特異性序列。

所述分子信標探針P1的5’端和3’端的6個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16S rRNA反義鏈互補的特異性序列；

所述分子信標探針P2的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的34個堿基是與細菌16S rRNA反義鏈互補的特異性序列；

所述分子信標探針P3的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16S rRNA反義鏈互補的特異性序列。

其中，所述分子信標探針P1，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團CY5，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；

所述分子信標探針P2，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團HEX，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；

所述分子信標探針P3，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL。

一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒，包括如下試劑：2×恒溫擴增反應液、5×酶混合液；

其中，2×恒溫擴增反應液的配方如下：Tris-HCl pH8.0 80mM、KCl 140mM、MgCl₂24mM、DTT 10mM、dNTP 2mM、NTP 4mM、甜菜堿2M、體積分數(shù)為30％的DMSO、正向引物F1 0.4μM、反向引物R1 0.4μM、正向引物F2 0.4μM、反向引物R2 0.4μM、分子信標探針P1 0.05μM、分子信標探針P2 0.05μM、分子信標探針P3 0.1μM。

其中，所述5×酶混合液的配方如下：M-MLV 20U/μl、T7RNA聚合酶100U/μl、BSA 10.5ug/μl。

作為優(yōu)選該試劑盒包括空白對照，所述空白對照為無核酸酶的DEPC水。

上述RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒在檢測致病細菌中的應用在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

一種RNA等溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的方法，包括以下步驟：

(1)待測樣品RNA的提?。?/p>

(2)RNA恒溫擴增反應和熔解曲線檢測：

取12.5ul 2×恒溫擴增反應液，5ul模板RNA溶液，加DEPC水補充至20ul，分別以待測樣本、陰性對照(經(jīng)過核酸提取過程的無菌生理鹽水)、空白對照作為模板，加入96孔板反應孔中；

RNA恒溫擴增：65℃保溫5分鐘，41℃保溫5分鐘；向96孔板反應孔中加入5ul酶混合液，瞬時離心；將96孔板放入熒光定量PCR儀中，41℃反應30分鐘；

熔解曲線檢測：按照0.14℃/step升溫速率，從40℃到75℃逐漸升高溫度，熔解曲線分析程序記錄每一次升溫分子信標產(chǎn)生的熒光值。Melting analysis程序在熒光定量PCR儀(LightCycler 480型，Roche公司)上進行。

本發(fā)明試劑盒能夠檢測臨床常見的致病細菌如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、熒光假單胞菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、洋蔥克雷伯菌、噬麥芽食單胞菌的16S rRNA，具有特異性高、靈敏度高(可達10³CFU/ml)、污染低(擴增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及準確(避免假陽性)、快速(常規(guī)1小時完成檢測)檢測的特點，將在臨床微生物的快速鑒定和檢測分析中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。

有益效果：

(1)高特異性、低污染：通過精心設計并結合臨床樣本篩查優(yōu)化選擇出的特異性正向引物、反向引物和分子信標探針，同步識別臨床常見致病細菌的3個不同區(qū)域，保證了擴增的特異性；同時，由于采取封閉式的恒溫放大檢測系統(tǒng)，整個過程中無需打開反應體系，因而避免了擴增子的污染。

(2)快速檢測:將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，而且整個過程中沒有溫度的升降級循環(huán)，因而所需時間大大縮短，擴增檢測只需要45分鐘；

(3)污染易控：與普通PCR及熒光PCR相比，本發(fā)明的擴增產(chǎn)物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制比較容易；

(4)結果直觀明了：反應結束后，根據(jù)熔解曲線的Tm值即可確定所檢測樣本的菌種。

綜上所述，本發(fā)明試劑盒能夠鑒定臨床常見致病細菌，具有特異性高、靈敏度高、污染低(擴增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(60分鐘完成擴增檢測)的特點，將在臨床微生物早期快速診斷中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1幾種常見致病細菌RNA恒溫擴增檢測結果圖示其中1奇異變形桿菌 2陰溝腸桿菌 3洋蔥克雷伯菌 4陰性對照 5空白對照。

圖2臨床常見致病細菌RNA恒溫擴增檢測試劑盒靈敏度測試結果圖示其中1為1.5×10⁷CFU/ml菌液提取RNA、2為1.5×10⁶CFU/ml菌液提取RNA、3為1.5×10⁵CFU/ml菌液提取RNA、4為1.5×10⁴CFU/ml菌液提取RNA、5為1.5×10³CFU/ml菌液提取RNA、6為陰性對照。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

實施例1：RNA恒溫擴增引物和熔解曲線檢測分子信標探針的設計

由于16S rRNA基因序列的保守性和存在的普遍性，應用16S rRNA作為分子指標已逐漸成為微生物檢測和分類鑒定的一種強有力工具。分子信標探針的設計思想是：綜合考慮對常見致病細菌檢測的特異性和通用性、引物和探針設計應遵循的普遍性原則(如Tm值、3’末端自由能、GC含量、避免出現(xiàn)內(nèi)部結構及形成二聚體等)，以及反向引物加上T7噬菌體啟動子序列后的影響等。對于設計出的引物和探針合成回來后再通過20種常見致病細菌的RT-PCR實驗和RNA恒溫擴增熔解曲線反應實驗進行篩選驗證，最后本發(fā)明優(yōu)選出如下引物和探針：

正向引物F1：5’-GAAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)

反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTACTCACCCGTCCGCCACT-3’(SEQ ID NO：2)

正向引物F2：5’-GCAACGCGAAGAACCTTACC-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物R2：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGACAGCCATGCAGCACCT-3’(SEQ ID NO：4)

分子信標探針P1：5’-GCGCGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGGACGGGGAGCTTGCCCGCGC-3’(SEQ ID NO：5)

分子信標探針P2：5’-GCCCGTTAGAGATAGAGGCTTCACCTTCGGAGGACAATGTGAACGGGC-3’(SEQ ID NO：6)

分子信標探針P3：5’-CGCGCGG GCCGAACACAAAAAGTTAAGCTTCTTAGCGCCGATTGTAG CCGCGCG-3’(SEQ ID NO：7)

所述反向引物R1、R2的5’端的31個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端20個堿基是與細菌16S rRNA互補的特異性序列；

所述分子信標探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團CY5，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；P1的5’端和3’端的6個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16S rRNA反義鏈互補的特異性序列；

所述分子信標探針P2在其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團HEX，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；P2的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的34個堿基是與細菌16S rRNA反義鏈互補的特異性序列；

所述分子信標探針P3在其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；P3的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16S rRNA反義鏈互補的特異性序列；

為保證引物和分子信標探針的質(zhì)量，委托上海生工生物工程有限公司以HPLC的純度標準進行合成。

實施例2：臨床常見致病細菌RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測體系的建立與優(yōu)化

針對RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測體系一些重要的影響因素進行條件的優(yōu)化。

1、方法

(1)Mg²⁺濃度：按照表1的反應體系配制2×恒溫擴增反應液，固定其它參數(shù)，分別調(diào)節(jié)Mg²⁺的終濃度至4mM、8mM、12mM、16mM、20mM、24mM，以提取的屎腸球菌總RNA為模板進行恒溫擴增等溫擴增。實驗結束后比較不同Mg²⁺濃度對擴增效率和熔解曲線的影響。

(2)K⁺濃度：按照表1的反應體系配制2×恒溫擴增反應液，固定其它參數(shù)，分別調(diào)節(jié)K⁺的終濃度至30mM、50mM、70mM、90mM、110mM、220mM，以提取的屎腸球菌總RNA為模板進行恒溫擴增等溫擴增。實驗結束后比較不同K⁺濃度對擴增效率和熔解曲線的影響。

(3)dNTP/NTP的濃度組合：按照表1的反應體系配制2×恒溫擴增反應液，固定其它參數(shù)，分別調(diào)節(jié)dNTP/NTP的終濃度至0.4mM/1.6mM、0.6mM/1.6mM、0.8mM/1.6mM、1mM/1.6mM、0.8mM/2mM、1mM/2mM，以提取的屎腸球菌總RNA為模板進行恒溫擴增等溫擴增。實驗結束后比較不同dNTP/NTP的濃度組合對擴增效率和熔解曲線的影響。

(4)引物和探針的濃度比：按照表1的反應體系配制2×恒溫擴增反應液，固定其它參數(shù)，分別調(diào)節(jié)引物和探針的濃度比為1:1、2:1、3:1、4:1，以提取的屎腸球菌總RNA為模板進行RNA等溫擴增。實驗結束后比較不同引物和探針的濃度比對擴增效率和熔解曲線的影響。

2、結果

針對每個動力學優(yōu)化實驗，系統(tǒng)比較恒溫擴增反應所獲得的熒光增長曲線情況，結果發(fā)現(xiàn)當Mg²⁺濃度選用12mM、K⁺濃度選用70mM、dNTP/NTP的濃度組合選用1mM/2mM、引物和探針的濃度比為4:1時，通過40分鐘的RNA等溫擴增所得的擴增效果最佳。因此選用上述最優(yōu)條件確定為試劑盒各組分的組成。

實施例3：臨床常見致病細菌(RNA恒溫擴增熔解曲線法)試劑盒的組成和檢測方法

1、試劑盒的組成(保存于-20℃)

(1)2×恒溫擴增反應液：其組分為：80mM Tris-HCl(pH8.0)、140mM KCl、24mM MgCl₂、10mM DTT、2mM dNTP、4mM NTP、Q-solution、0.4μM正向引物F1(F2)、0.4μM反向引物R1(R2)、0.05μM分子信標探針P1(P2)、0.1μM分子信標探針P3；其中正向引物F1是序列編號為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反向引物R1是序列編號為SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，正向引物F2是序列編號為SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，反向引物R2是序列編號為SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，分子信標探針P1是序列編號為SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，分子信標探針P2是序列編號為SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，分子信標探針P3是序列編號為SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

(2)5×酶混合液：其組分為200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、1000U T7RNA聚合酶、105μg BSA；

(3)陰性對照：為無菌生理鹽水，在核酸提取時與標本同時平行提取以作為陰性對照使用；

(4)DEPC水：為DEPC處理的無核酸酶的超純水，作為空白對照使用。

2、方法

(1)提取待測樣品的RNA，即模板RNA。

(2)按照以下方法配制反應液：反應總體積為25μl：取12.5μl 2×恒溫擴增反應液加入0.2ml光學PCR反應管，再加入5μl樣本RNA(或陰性對照和空白對照)，加水補充至20μl，然后輕輕將管蓋蓋好；

(3)反應預處理：將上述反應管置于恒溫浴器或普通PCR儀上，經(jīng)65℃加熱5分鐘，41℃加熱5分鐘后，再加入5μl 5×酶混合液，輕彈混勻，再次短暫離心；

(4)上機檢測：將預處理的反應管放入熒光定量PCR儀上進行RNA等溫擴增和熔解曲線檢測。RNA等溫擴增條件：41℃反應30-60分鐘；熔解曲線檢測條件：按照0.14℃/step升溫速率，從40℃到75℃逐漸升高溫度，熔解曲線分析程序記錄每一次升溫分子信標產(chǎn)生的熒光值。Melting analysis程序在熒光定量PCR儀(LightCycler 480型，Roche公司)上進行。

(5)結果判定：根據(jù)檢測樣本的熔解曲線Tm值判斷結果。首先是質(zhì)控系統(tǒng)判斷，即陰性對照和空白對照均無熔解峰，否則系統(tǒng)檢測無效。當系統(tǒng)檢測有效時，判斷待測樣本結果，不同菌對應不同熔解Tm值(如圖1所示)。

(6)注意事項：實驗全過程都應使用無粉手套。為了避免實驗中的交叉污染，在加模板的過程中，應首先加空白對照和陰性對照，其次加待測樣本，最后加陽性對照。實施例4：臨床常見致病細菌RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測試劑盒的靈敏度分析

1、方法：

(1)樣本處理：取臨床鑒定為屎腸球菌的樣本，收集菌，用生理鹽水調(diào)菌濃度至1.5×10⁸CFU/ml，然后按100μl菌液+900μl生理鹽水的方式，將其依次做10倍梯度稀釋，12000rpm離心30s，棄700μl上清，然后加入100mg 100nm玻璃珠，震蕩儀上2000轉(zhuǎn)破碎5min，取上清約300μl至96深孔板中，核酸提取儀上提取RNA。以1.5×10⁷至1.5×10²CFU/ml菌液提取RNA作為模板，每個濃度梯度各取6μl用于擴增。

(2)RNA恒溫擴增檢測：采用實施例三所述檢測方法進行試劑配制，各梯度稀釋模板5μl，然后將反應管置于普通PCR儀上(MJ PCR儀)上于65℃加熱5分鐘，41℃加熱5分鐘后，將反應管短暫離心，加入5ul酶混合液，輕彈混勻，再次短暫離心，接著將反應管置于熒光PCR儀(Roche LightCycler 480型熒光PCR儀)上進行等溫擴增和熔解曲線檢測，設置反應條件為：41℃加熱30min，熒光檢測通道選擇CY5，熔解曲線檢測時間約為10分鐘。反應完成后觀察熔解曲線熔解峰Tm值，分析本發(fā)明所述試劑盒所能檢測到的模板濃度最低限。

(3)結果：本發(fā)明所述臨床常見致病細菌RNA恒溫擴增熔解曲線檢測試劑盒只需60分鐘左右時間可檢測到濃度為1.5×10³CFU/ml菌液提取的RNA，結果見圖2。本發(fā)明所述臨床常見致病細菌RAN恒溫擴增熔解曲線法檢測試劑盒快速、高效，靈敏度高，能在微生物菌株快速鑒定中發(fā)揮重要作用。

實施例5：臨床常見致病細菌恒溫擴增檢測試劑盒對臨床樣品的檢測

1、樣本：從浙江邵逸夫醫(yī)院取20份疑似細菌感染的尿液進行檢測。

2、方法：用核酸提取儀提取標本的細菌RNA，然后采用本發(fā)明的恒溫擴增檢測試劑盒進行檢測，并與醫(yī)院培養(yǎng)鑒定結果對比符合率。

3、檢測步驟：

(1)細菌RNA提取，取1ml尿液標本于1.5ml離心管中，12000rpm離心5min，棄700μl上清，在沉淀中加入100mg玻璃珠，研磨儀上2000轉(zhuǎn)破碎5min，取上清約300μl至96深孔板裂解孔中，采用磁珠在核酸提取儀上提?。?/p>

(2)RNA恒溫擴增和熔解曲線檢測：按實施例三的方法進行操作。

4、檢測結果：利用本發(fā)明提供的RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測試劑盒共檢出9株陽性細菌樣本，檢出率為45％，與醫(yī)院培養(yǎng)鑒定結果完全一致，兩種方法的符合率為100％，結果見表1。

表1 20份臨床細菌感染尿液樣本檢測結果

本發(fā)明可應用于臨床微生物菌株的快速鑒定。

SEQUENCE LISTING

<110> 溫州迪安醫(yī)學檢驗所有限公司

<120> 一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用

<130> SG20170223001

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物F1

<400> 1

gaagagtttg atcatggctc ag 22

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物R1

<400> 2

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttactcacc cgtccgccac t 51

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物F2

<400> 3

gcaacgcgaa gaaccttacc 20

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物R2

<400> 4

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacgacagcc atgcagcacc t 51

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子信標探針P1

<400> 5

gcgcggccta atacatgcaa gtcgagcgaa cggacgggga gcttgcccgc gc 52

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子信標探針P2

<400> 6

gcccgttaga gatagaggct tcaccttcgg aggacaatgt gaacgggc 48

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子信標探針P3

<400> 7

cgcgcgggcc gaacacaaaa agttaagctt cttagcgccg attgtagccg cgcg 54