本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種高信噪比多探針PCR Taqman探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程的定量實驗技術(shù)。多探針熒光定量PCR是在同一PCR反應(yīng)體系含有針對多個特異的靶序列的多對探針進行PCR反應(yīng)和熒光檢測。

目前熒光定量PCR采用最多的探針為Taqman探針，該探針為一寡核苷酸，探針的5'端修飾一個報告熒光基團，3'端修飾一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5'端→3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

但是由于Taqman探針的長度一般在18～45nt之間，因此淬滅基團無法完全的吸收報告基團的熒光，所以在熒光定量PCR的過程中存在一定的背景噪音。而在多重?zé)晒舛縋CR過程中，一個通道中探針個數(shù)會增加到10個甚至更多，這樣會導(dǎo)致背景噪音的疊加，從而降低了熒光信號的信噪比，導(dǎo)致多重?zé)晒舛縋CR在同一熒光通道探針較多的情況時出現(xiàn)靈敏度降低等檢測困難的現(xiàn)象。

中國發(fā)明專利CN200710122376.X公開了一種熒光標記的寡核苷酸探針及其應(yīng)用。該發(fā)明的探針一改傳統(tǒng)Taqman探針中把熒光報告基團和熒光淬滅基團分別放在探針兩端的設(shè)計方法，把熒光淬滅基團設(shè)計在探針的中部，同時在熒光淬滅基團兩端各修飾一個熒光報告基團，該發(fā)明的探針一分子探針被水解時可以釋放兩分子熒光，可以增強熒光信號強度，提高檢測的靈敏度，但是其成本也加倍，并且背景噪音沒有減弱，甚至?xí)鼜?，因此開發(fā)一種高信噪比的多重?zé)晒舛縋CR Taqman探針對于提高多重?zé)晒舛縋CR的靈敏度是十分必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種多探針PCR Taqman探針，其能夠有效降低Taqman探針PCR尤其是多Taqman探針PCR的背景噪音，提高檢測的靈敏度。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種熒光定量PCR Taqman探針，其為標記有熒光基團和淬滅基團的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一堿基T，所述淬滅基團標記在所述堿基T上，以確保淬滅基團標記的穩(wěn)定性，保證淬滅效果，所述熒光基團標記在淬滅基團的上游堿基上，并且與所述淬滅基團距離8～25nt(nt為單鏈核苷酸)，使淬滅基團可最大程度上吸收熒光基團發(fā)射的熒光，降低熒光定量PCR背景，但熒光基團與淬滅基團的標記的距離也不能過近，當熒光基團與淬滅基團之間的距離小于8nt時，探針上熒光基團與淬滅基團標記的位置越近，熒光基團被水解釋放后發(fā)射的熒光信號強度越低，影響結(jié)果檢測的靈敏度。

優(yōu)選的是，其中，所述寡核苷酸序列的長度為18～45nt(nt為單鏈核苷酸)，既保證探針與模板結(jié)合效率，又保證淬滅基團的淬滅效果。

優(yōu)選的是，其中，所述熒光基團選自標記穩(wěn)定且其發(fā)射熒光較易被淬滅的FAM(6-羧基熒光素)、ROX(5-羧基-X-羅丹明)、JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基熒光素)、CY3(3H-吲哚菁)、CY5(5H-吲哚菁)、TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)、VIC、NED中的任意一種。

優(yōu)選的是，其中，所述淬滅基團為本身不會發(fā)射熒光的BHQ或QSY，在多探針PCR檢測中，若淬滅基團本身也可發(fā)生熒光，易產(chǎn)生熒光交叉干擾，增加背景干擾。

優(yōu)選的是，其中，所述寡核苷酸序列的3’端使用磷酸基團、氨基或封閉堿基予以封閉，防止探針在PCR擴增過程中被延伸。

優(yōu)選的是，其中，當所述寡核苷酸序列的5’端為堿基G時，所述熒光基團標記于5’端以外的位置，因為5’端的堿基G有淬滅效果，且即使探針被水解成單個堿基，與熒光基團相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號，干擾對結(jié)果的判斷。

優(yōu)選的是，其中，在多探針熒光定量PCR反應(yīng)體系中所述Taqman探針加入的濃度為0.0001～10μmol/L。

優(yōu)選的是，其中，多探針熒光定量PCR反應(yīng)體系的多個探針中至少有一個所述Taqman探針，以保證背景噪音的降低，提高檢測靈敏度。

本發(fā)明熒光定量PCR Taqman探針可廣泛應(yīng)用于各種使用探針的領(lǐng)域，尤其適用于一個通道存在多個探針的核酸PCR檢測領(lǐng)域，尤其適用于廣譜人乳頭瘤病毒(HPV)核酸的一管檢測。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

1.本發(fā)明通過改變并縮短熒光基團和淬滅基團的標記位置，并將淬滅基團標記在探針寡核苷酸序列的堿基T上，可明顯增強淬滅基團對熒光基團的抑制效率，降低背景噪音。

2.當本發(fā)明應(yīng)用于多探針PCR時，可顯著降低背景疊加噪音，擴大熒光信號區(qū)間，提高信噪比和檢測的靈敏度，從而提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性，可進一步促進多探針PCR技術(shù)的發(fā)展，提高檢測效率，降低反應(yīng)成本。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中在FAM通道下分別使用不同濃度的普通探針和特殊探針進行多探針PCR檢測的背景噪音對比圖；

圖2為本發(fā)明實施例2中分別使用特殊探針與普通探針進行多探針PCR檢測的熒光信號區(qū)間的對比圖；

圖3為本發(fā)明實施例3中在FAM通道下分別使用普通探針組和特殊探針組進行多探針PCR檢測的背景疊加噪音對比圖；

圖4為本發(fā)明實施例3中分別采用特殊探針組和普通探針組對9個HPV亞型同時檢測的對比圖。

圖5為本發(fā)明實施例4中在ROX通道下分別使用普通探針組和特殊探針組進行多探針PCR檢測的背景疊加噪音對比圖

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

應(yīng)當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

為了更好了區(qū)分本發(fā)明的高信噪比多探針PCR Taqman探針與普通Taqman探針，我們將使用了本發(fā)明的高信噪比多探針PCR Taqman探針命名為“特殊探針”組，未使用的命名為“普通探針”組。

實施例1特殊探針與普通探針PCR檢測的背景噪音對比

針對同一HPV45型加入同等梯度濃度普通探針和特殊探針，探尋同等濃度下普通探針和特殊探針的背景信號強度和背景信號強度隨濃度變化趨勢，其中，

普通探針：FAM-5'-caagaaagacttcgcagacgtagggaacac-3'-BHQ；

特殊探針：5'-caagaaaga(FAM)cttcgcagacgt(BHQ)agggaacac-3'；

本實施例1特殊探針中，淬滅基團BHQ標記在堿基T上，熒光基團FAM標記在淬滅基團上游的堿基A上，并且距離淬滅基團BHQ 12nt。

參照圖1，在同等濃度下特殊探針的背景噪音明顯低于普通探針，隨著探針濃度增加普通探針的背景噪音快速上升且很快達到平臺期，而使用特殊探針組和特殊對比探針組的背景噪音隨探針濃度增加變化趨勢緩慢，且距離平臺期仍有較大間距。

在本實施例中，若采用淬滅基團QSY代替淬滅基團BHQ標記在堿基T上，熒光基團FAM標記在淬滅基團上游的堿基A上，并且距離淬滅基團BHQ12nt，其效果圖與圖1基本一致，使用特殊探針組的背景噪音隨探針濃度增加變化趨勢緩慢，且距離平臺期仍有較大間距。

在本實施例中，淬滅基團BHQ標記在堿基T上，采用熒光基團VIC或NED代替熒光基團FAM標記在淬滅基團上游的堿基A上，并且距離淬滅基團BHQ 12nt，其效果圖與圖1基本一致，使用特殊探針組的背景噪音隨探針濃度增加變化趨勢緩慢，且距離平臺期仍有較大間距。

實施例2特殊探針與普通探針PCR檢測信號區(qū)間對比

針對于同一HPV亞型加入同等濃度的特殊探針和普通探針，分別進行同等循環(huán)數(shù)的熒光定量PCR，對比PCR開始時的信號到PCR結(jié)束時的信號區(qū)間，其中針對同一HPV58型(亞型1)分別加入：

普通探針：FAM-5'-tttcaattcgatttcatgcac-3'-BHQ；

特殊探針：5'-tt(FAM)tcaattcgat(BHQ)ttcatgcac-3'；

針對同一HPV33型(亞型2)分別加入：

普通探針：TAMRA-5'-actatacacaacattgaactacagtgcgtggaatgc-3'-BHQ；

特殊探針1：5'-actatacacaacattg(TAMRA)aactacagtgcgtggaat(BHQ)gc-3'；

本實施例2的兩特殊探針中，淬滅基團BHQ均標記在堿基T上，針對HPV58型特殊探針中的熒光基團FAM標記在淬滅基團上游的堿基T上，且距離淬滅基團BHQ 10nt，針對HPV33型特殊探針1中的熒光基團TAMRA標記在淬滅基團上游的堿基G上，并且距離淬滅基團BHQ 18nt。

參照圖2，可以看到兩組實驗中，特殊探針熒光信號區(qū)間都明顯大于普通探針，因此采用本發(fā)明特殊探針進行熒光定量時可以有更寬的區(qū)間進行信號檢測，從而提高了信號的靈敏度。

在本實施例中，淬滅基團BHQ均標記在堿基T上，針對HPV58型特殊探針中采用熒光集團JOE代替熒光基團FAM標記在淬滅基團上游的堿基T上，且距離淬滅基團BHQ 10nt，可以達到幾乎一致的優(yōu)異效果，特殊探針熒光信號區(qū)間都明顯大于普通探針。

針對HPV33型特殊探針1中采用熒光集團CY3代替熒光基團TAMRA標記在淬滅基團上游的堿基G上，并且距離淬滅基團BHQ 18nt，可以達到幾乎一致的效果，特殊探針熒光信號區(qū)間都明顯大于普通探針。

實施例3特殊探針在多探針PCR中的效果

在FAM通道中同時檢測HPV31、33、39、45、51、52、56、58、66共9個HPV亞型，分別使用特殊探針組和普通探針組進行檢測，其中特殊探針組中的HPV31、33、45和52四個亞型采用本發(fā)明特殊探針而其余使用普通探針進行檢測，其中，HPV31、33、45和52分別對應(yīng)的特殊探針為：

HPV31特殊探針：5'-catagtatt(FAM)ttgtgcaaacctacagacgccatgt(BHQ)-3'；

HPV33特殊探針：5'-actatacacaacattgaacta(FAM)cagtgcgt(BHQ)ggaatgc-3'；

HPV45特殊探針：5'-caagaa(FAM)agacttcgcagacgt(BHQ)agggaaacac-3'；

HPV52特殊探針：5'-aacacag(FAM)tgtagctaacgcacggccat(BHQ)gt-3'。

本實施例3的四個特殊探針的淬滅基團BHQ均標記在堿基T上，分別針對HPV31、HPV33、HPV45和HPV52型的特殊探針中，熒光基團FAM分別標記在淬滅基團上游的堿基T、A、A和G上，并且分別距離淬滅基團BHQ25、8、15和20nt。

參照圖3，在特殊探針組中，其中9個亞型中的4個使用特殊探針后，檢測圖譜中整體的背景信號有明顯的降低，因此證明特殊探針可有效降低多探針PCR過程中的背景疊加噪音。

參照圖4特殊探針組和普通探針組對9種亞型同時檢測的結(jié)果，可以看出特殊探針組的靈敏度明顯高于普通探針組，且數(shù)據(jù)之間的差異性更小。

實施例4特殊探針使用不同熒光標記在多探針PCR中的效果

在ROX通道中同時檢測HPV31、33、45、52、56、66共6個HPV亞型，分別使用特殊探針組和普通探針組進行檢測，其中特殊探針組中的HPV31、33、45和52四個亞型采用本發(fā)明特殊探針而其余使用普通探針進行檢測，其中，HPV31、33、45和52分別對應(yīng)的特殊探針為：

HPV31特殊探針：5'-catagtatt(ROX)ttgtgcaaacctacagacgccatgt(BHQ)-3'；

HPV33特殊探針：5'-actatacacaacattgaacta(ROX)cagtgcgt(BHQ)ggaatgc-3'；

HPV45特殊探針：5'-caagaa(ROX)agacttcgcagacgt(BHQ)agggaaacac-3'；

HPV52特殊探針：5'-aacacag(ROX)tgtagctaacgcacggccat(BHQ)gt-3'。

本實施例4的四個特殊探針的淬滅基團BHQ均標記在堿基T上，分別針對HPV31、HPV33、HPV45和HPV52型的特殊探針中，熒光基團ROX分別標記在淬滅基團上游的堿基T、A、A和G上，并且分別距離淬滅基團BHQ25、8、15和20nt。

參照圖5，在特殊探針組中，其中6個亞型中的4個使用特殊探針后，檢測ROX通道圖譜中整體的背景信號有明顯的降低，與FAM通道結(jié)果一致，因此證明特殊探針可有效降低多探針熒光定量PCR過程中的在不同熒光通道背景疊加噪音。

這里說明的設(shè)備數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明。對本發(fā)明的一種高信噪比多探針PCR Taqman探針的應(yīng)用、修改和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。

如上所述，本發(fā)明通過改變并縮短熒光基團和淬滅基團的標記位置，并將淬滅基團標記在探針寡核苷酸序列的堿基T上，可顯著增強淬滅基團對熒光基團的抑制效率，降低背景噪音；同時降低成本。

當本發(fā)明應(yīng)用于多探針PCR時，可明顯降低背景疊加噪音，擴大信號區(qū)間，提高信噪比和檢測的靈敏度，從而提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性，可進一步促進多探針PCR的應(yīng)用，提高檢測效率，降低反應(yīng)成本。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域。對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。