本發(fā)明屬于病原微生物檢測領域，具體涉及一種同時檢測多種腹瀉病原菌的試劑盒及應用。

背景技術：

感染性腹瀉是當今全球性重要的公共衛(wèi)生問題，亞、非、拉地區(qū)5歲以下兒童每年因腹瀉而死亡者約為500萬，年發(fā)病數(shù)約為7.5億～10億人次。感染性腹瀉病原體主要有沙門菌、志賀菌、空腸彎曲菌、致病性大腸桿菌等。目前，對于腹瀉病原體的檢測主要有常規(guī)分離培養(yǎng)和生化鑒定、免疫學方法、分子生物學方法。常規(guī)分離培養(yǎng)操作繁瑣、費時，人為影響較大，容易造成漏檢；免疫學方法不需要復雜的儀器、操作簡單，但由于病原體的抗原性和毒力因子不一定相關，導致病原難以確定，免疫學方法也依賴較高濃度的純菌，增菌過程比較費時，對于一些不能培養(yǎng)細菌也不能檢測；分子生物學方法主要有探針雜交、多重實時PCR和基因芯片，大大提高了檢測的速度和敏感性。

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、成本低廉等特點。目前已有多種運用定量PCR技術的試劑盒應用于臨床疾病相關的病原體檢測、基因分型、突變研究等。本研究中應用的是taqman熒光探針作為熒光基團，PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種同時擴增多種腹瀉病原菌的引物，以解決現(xiàn)有技術中操作繁瑣、費時，人為影響較大，容易造成漏檢的問題。

本發(fā)明還要解決的技術問題是，提供包括上述同時擴增多種腹瀉病原菌的引物的試劑盒。

本發(fā)明最后要解決的技術問題是，上述同時擴增多種腹瀉病原菌的試劑盒的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：

同時檢測多種腹瀉病原菌的引物，其特征在于，包括如下五組引物：

第一組擴增金黃色葡萄球nuc基因、志賀菌ipaH基因、副溶血弧菌tlh基因引物對，包括如下三對引物和探針：

檢測金黃色葡萄球菌nuc基因的引物對和探針：

F1(SEQ ID NO.：1)：ATCCTAAAAAAGGTGTAGAG，

R1(SEQ ID NO.：2)：TATCAGTTCTTTGACCTTTG，

P1(SEQ ID NO.：3)：FAM-ATATGGTCCTGAAGCAAGTGCA-MGB；

檢測志賀菌ipaH基因的引物和探針：

F2(SEQ ID NO.：4)：ATAAAGTCAGAACTCTCC，

R2(SEQ ID NO.：5)：AACGCATTTCCTTCACGG，

P2(SEQ ID NO.：6)：VIC-ATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCC-TAMRA；

檢測副溶血弧菌tlh基因的引物和探針：

F3(SEQ ID NO.：7)：TCAACCGCTCATCGTCTGT，

R3(SEQ ID NO.：8)：CTGCGACATAGCGGTGAGT，

P3(SEQ ID NO.：9)：CY5-CACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGT-BQ2；

第二組擴增小腸結腸炎耶爾森菌ail基因、艱難梭菌tpi基因、類志賀鄰單胞菌hugA基因的引物和探針，包括如下三對引物和探針：

檢測小腸結腸炎耶爾森菌ail基因的引物和探針：

F4(SEQ ID NO.：10)：TAATAGGTTCGTTTGCTTATACC，

R4(SEQ ID NO.：11)：GCGGAAAGATGGCCCCATTGTTA，

P4(SEQ ID NO.：12)：FAM-CGATTTCTTCTATGGCAGTAATAAGT–TAMRA；

檢測艱難梭菌tpi基因的引物和探針：

F5(SEQ ID NO.：13)：ACTGATGAAACTGTAAACA，

R5(SEQ ID NO.：14)：AACATCTTTAGTTTTTCCA，

P5(SEQ ID NO.：15)：HEX-CCCAATATTATGTGTTGGAGAAACTTTA-T AMRA；

檢測類志賀鄰單胞菌hugA基因：

F6(SEQ ID NO.：16)：TGACTGCTTTGAGCGCGCC，

R6(SEQ ID NO.：17)：AATCACAAGATGAATTGCC，

P6(SEQ ID NO.：18)：CY5-AGTGGTGTAGAGATCCACCAAGGTGTAG-BQ2；

第三組擴增李斯特菌hlyA基因、大腸埃希菌O157:H7rfbE基因、副溶血弧菌tlh基因的引物和探針，包括如下三對引物和探針：

擴增李斯特菌hlyA基因的引物和探針：

F7(SEQ ID NO.：19)：CAGGTGATGTAGAACTGACAAA，

R7(SEQ ID NO.：20)：GCACCTTTTTTCAAAATATCTC，

P7(SEQ ID NO.：21)：FAM-AAAGCCGTAATTTACGGTGGCTCCG-TAMRA；

擴增大腸埃希菌O157:H7rfbE基因引物和探針：

F8(SEQ ID NO.：22)：TTTCGTTGATTCAGATAATG，

R8(SEQ ID NO.：23)：AAATTTCTACTTTTGGCCAG，

P8(SEQ ID NO.：24)：HEX-TAGTGACATAGAACAAAAAATCACTAA-TA MRA；

擴增副溶血弧菌tlh基因引物和探針：

F3(SEQ ID NO.：7)：TCAACCGCTCATCGTCTGT，

R3(SEQ ID NO.：8)：CTGCGACATAGCGGTGAGT，

P3(SEQ ID NO.：9)：CY5-CACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGT-BQ2；

第四組擴增氣單胞菌gcat基因、沙門菌invA基因、產氣莢膜梭菌cpa基因引物對和探針，包括如下三對引物和探針：

擴增氣單胞菌gcat基因的引物和探針：

F9(SEQ ID NO.：25)：AAGGCGGTGCCACTGCCGT，

R9(SEQ ID NO.：26)：TCCGGCTTGAAGCTGTCTT，

P9(SEQ ID NO.：27)：FAM-TATCAGGTCATCAACAACCTGGACT-TAMRA；

擴增沙門菌invA基因的引物和探針：

F10(SEQ ID NO.：28)：TATTGGCGATAGCCTGGCGG，

R10(SEQ ID NO.：29)：TCGGCATCAATACTCATCTG，

P10(SEQ ID NO.：30)：Vic-AGTTTATCGTTATTACCAAAGGT-MGB；

擴增產氣莢膜梭菌cpa基因的引物和探針：

F11(SEQ ID NO.：31)：AGGGAAATCAATATACTATA，

R11(SEQ ID NO.：32)：TGAGAGTTAGCTAGAGTTAC，

P11(SEQ ID NO.：33)：CY5-AGTCATGCTAGCATGAGTCATAGTT-BQ2；

第五組擴增金黃色葡萄球菌nuc基因、蠟狀芽孢桿菌cesB基因、空腸彎曲菌mapA的引物和探針，包括如下三對引物和探針：

擴增金黃色葡萄球菌nuc基因的引物和探針：

F1(SEQ ID NO.：1)：ATCCTAAAAAAGGTGTAGAG，

R1(SEQ ID NO.：2)：TATCAGTTCTTTGACCTTTG，

P1(SEQ ID NO.：3)：FAM-ATATGGTCCTGAAGCAAGTGCA-MGB；

擴增蠟狀芽孢桿菌cesB基因的引物和探針：

F12(SEQ ID NO.：34)：CTGATGGGTTTAATGTAATGAA，

R12(SEQ ID NO.：35)：GTCTGACGTAATTCTGCTAATA，

P12(SEQ ID NO.：36)：VIC-ATTATAGTCGGAGTAGCAAGGGATAA–MGB；

擴增空腸彎曲菌mapA的引物和探針：

F13(SEQ ID NO.：37)：TGCTCCATAAGATATAAATT，

R13(SEQ ID NO.：38)：TTTATACTTATTTAAAACAA，

P13(SEQ ID NO.：39)：CY5-CATAAGGTGAATTTTGATCGTTATTGT-BQ2。

同時檢測多種腹瀉病原菌的試劑盒，包括如下試劑：

(1)PCR反應液:10*PCR緩沖液，Q緩沖液，DNA聚合酶，Mg²⁺及dNTPs，所述Q緩沖液包括如下組分：甜菜堿2.7M、DMSO6.7％、DTT6.7mM、BSA0.055mg/ml；

(2)引物和探針混合液:將SEQ ID NO.：1～39所示的核苷酸序列按照權利要求1分組，每種引物的終濃度為1μmol/L；

(3)陽性對照：含有腹瀉病原細菌基因組DNA，其中，每一種腹瀉病原細菌基因組DNA濃度為10ng/μL；

(4)陰性對照：大腸桿菌基因組DNA,濃度為100ng/μL。

上述同時檢測多種腹瀉病原菌的試劑盒在檢測腹瀉病原菌中的應用在本發(fā)明的保護范圍之內。

其中，所述腹瀉病原菌包括：金黃色葡萄球菌、志賀菌、副溶血弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、艱難梭狀桿菌、鄰單胞菌、李斯特菌、大腸埃希菌O157：H7、氣單胞菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌、蠟狀芽孢桿菌和空腸彎曲菌中的應用。

有益效果：

本發(fā)明公開了一種同時檢測多種腹瀉病原菌的引物及其應用，通過5組熒光定量PCR可以檢測出金黃色葡萄球菌、志賀菌、副溶血弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、艱難梭狀桿菌、鄰單胞菌、李斯特菌、大腸埃希菌O157：H7、氣單胞菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌、蠟狀芽孢桿菌和空腸彎曲菌共13種腹瀉病原菌。細菌的檢出限為10～10⁴cfu/ml，靈敏度較高。

附圖說明

圖1檢測金黃色葡萄球菌引物的靈敏度為10cfu/ml。

圖2檢測志賀菌的靈敏度為10cfu/ml。

圖3檢測副溶血弧菌的靈敏度為10²cfu/ml。

圖4檢測小腸結腸炎耶爾森菌的靈敏度為10cfu/ml。

圖5檢測艱難梭菌的靈敏度為10⁴cfu/ml

圖6檢測類志賀鄰單胞菌的靈敏度為10²cfu/ml

圖7檢測單增李斯特菌的靈敏度為10⁴cfu/ml

圖8大腸埃希菌O157：H7的靈敏度為10³cfu/ml

圖9檢測氣單胞菌的靈敏度為10³cfu/ml

圖10檢測沙門菌的靈敏度為10⁴cfu/ml

圖11檢測產氣莢膜梭菌的靈敏度為10³cfu/ml

圖12檢測蠟狀芽孢桿菌的靈敏度為10³cfu/ml

圖13檢測空腸彎曲菌的靈敏度為10cfu/ml

具體實施方式

下面結合具體實施例詳細說明本發(fā)明，可以更好的理解本發(fā)明。然而，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍和應用。

實施例1：

檢測13種腹瀉病原菌的引物和探針，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，在實際應用時三種細菌的引物對和探針被分為一組，具體如下：

第一組擴增金黃色葡萄球(Staphylococcus aureus)nuc基因、志賀菌(Shigella)ipaH基因、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)tlh基因引物對，包括如下三對引物和探針：

檢測金黃色葡萄球菌nuc基因的引物對和探針：

F1(SEQ ID NO.：1)：ATCCTAAAAAAGGTGTAGAG，

R1(SEQ ID NO.：2)：TATCAGTTCTTTGACCTTTG，

P1(SEQ ID NO.：3)：FAM-ATATGGTCCTGAAGCAAGTGCA-MGB；

檢測志賀菌ipaH基因的引物和探針：

F2(SEQ ID NO.：4)：ATAAAGTCAGAACTCTCC，

R2(SEQ ID NO.：5)：AACGCATTTCCTTCACGG，

P2(SEQ ID NO.：6)：VIC-ATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCC-TAMRA；

檢測副溶血弧菌tlh基因的引物和探針：

F3SEQ ID NO.：7：TCAACCGCTCATCGTCTGT，

R3SEQ ID NO.：8：CTGCGACATAGCGGTGAGT，

P3SEQ ID NO.：9：CY5-CACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGT-BQ2；

第二組擴增小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)ail基因、艱難梭菌(Clostridium difficile)tpi基因、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)hugA基因的引物和探針，包括如下三對引物和探針：

檢測小腸結腸炎耶爾森菌ail基因的引物和探針：

F4SEQ ID NO.：10：TAATAGGTTCGTTTGCTTATACC，

R4SEQ ID NO.：11：GCGGAAAGATGGCCCCATTGTTA，

P4SEQ ID NO.：12：FAM-CGATTTCTTCTATGGCAGTAATAAGT–TAMRA；

檢測艱難梭菌tpi基因的引物和探針：

F5SEQ ID NO.：13:ACTGATGAAACTGTAAACA，

R5SEQ ID NO.：14:AACATCTTTAGTTTTTCCA，

P5SEQ ID NO.：15:HEX-CCCAATATTATGTGTTGGAGAAACTTTA-TAMRA；

檢測類志賀鄰單胞菌hugA基因：

F6SEQ ID NO.：16：TGACTGCTTTGAGCGCGCC，

R6SEQ ID NO.：17：AATCACAAGATGAATTGCC，

P6SEQ ID NO.：18：CY5-AGTGGTGTAGAGATCCACCAAGGTGTAG-BQ2；

第三組擴增李斯特菌(Listeria monocytogenes)hlyA基因、大腸埃希菌O157:H7(E.coli O157:H7)rfbE基因、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)tlh基因的引物和探針，包括如下三對引物和探針：

擴增李斯特菌hlyA基因的引物和探針：

F7SEQ ID NO.：19：CAGGTGATGTAGAACTGACAAA，

R7SEQ ID NO.：20：GCACCTTTTTTCAAAATATCTC，

P7SEQ ID NO.：21:FAM-AAAGCCGTAATTTACGGTGGCTCCG-TAMRA；

擴增大腸埃希菌O157:H7rfbE基因引物和探針：

F8SEQ ID NO.：22:TTTCGTTGATTCAGATAATG，

R8SEQ ID NO.：23:AAATTTCTACTTTTGGCCAG，

P8SEQ ID NO.：24:HEX-TAGTGACATAGAACAAAAAATCACTAA-TAMRA；

擴增副溶血弧菌tlh基因引物和探針：

F3SEQ ID NO.：7：TCAACCGCTCATCGTCTGT，

R3SEQ ID NO.：8:CTGCGACATAGCGGTGAGT，

P3SEQ ID NO.：9:CY5-CACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGT-BQ2；

第四組擴增氣單胞菌(Aeromonas)gcat基因、沙門菌(salmonella spp)invA基因、產氣莢膜梭菌(C.perfringens)cpa基因引物對和探針，包括如下三對引物和探針：

擴增氣單胞菌gcat基因的引物和探針：

F9SEQ ID NO.：25：AAGGCGGTGCCACTGCCGT，

R9SEQ ID NO.：26：TCCGGCTTGAAGCTGTCTT，

P9SEQ ID NO.：27：FAM-TATCAGGTCATCAACAACCTGGACT-TAMRA；

擴增沙門菌invA基因的引物和探針：

F10SEQ ID NO.：28：TATTGGCGATAGCCTGGCGG，

R10SEQ ID NO.：29：TCGGCATCAATACTCATCTG，

P10SEQ ID NO.：30：Vic-AGTTTATCGTTATTACCAAAGGT-MGB；

擴增產氣莢膜梭菌cpa基因的引物和探針：

F11SEQ ID NO.：31:AGGGAAATCAATATACTATA，

R11SEQ ID NO.：32:TGAGAGTTAGCTAGAGTTAC，

P11SEQ ID NO.：33:CY5-AGTCATGCTAGCATGAGTCATAGTT-BQ2；

第五組擴增金黃色葡萄球菌nuc基因(Staphylococcus aureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)cesB基因、空腸彎曲菌mapA(Campylobacter jejuni)的引物和探針，包括如下三對引物和探針：

擴增金黃色葡萄球菌nuc基因的引物和探針：

F1SEQ ID NO.：1:ATCCTAAAAAAGGTGTAGAG，

R1SEQ ID NO.：2:TATCAGTTCTTTGACCTTTG，

P1SEQ ID NO.：3:FAM-ATATGGTCCTGAAGCAAGTGCA-MGB；

擴增蠟狀芽孢桿菌cesB基因的引物和探針：

F12SEQ ID NO.：34:CTGATGGGTTTAATGTAATGAA，

R12SEQ ID NO.：35:GTCTGACGTAATTCTGCTAATA，

P12SEQ ID NO.：36:VIC-ATTATAGTCGGAGTAGCAAGGGATAA–MGB；

擴增空腸彎曲菌mapA的引物和探針：

F13SEQ ID NO.：37:TGCTCCATAAGATATAAATT，

R13SEQ ID NO.：38:TTTATACTTATTTAAAACAA，

P13SEQ ID NO.：39:CY5-CATAAGGTGAATTTTGATCGTTATTGT-BQ2。

實施例2：試劑盒的制備方法。

(1)PCR反應液：10*PCR反應緩沖液、Q-solution、DNA聚合酶、Mg2+及dNTPs，-20℃保存；

(2)引物和探針混合液：將SEQ ID NO.：1～39所示的核苷酸序列交由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，然后按照分組，三種引物對和探針混合于一管中，用雙蒸水溶解，每一條引物的終濃度均為1μmol/L，-20℃保存；

(3)陽性對照：分別含有13種腹瀉病原細菌基因組DNA，其中，每一種含耐藥基因的細菌基因組DNA濃度為10ng/μL，-20℃保存；

(4)陰性對照：大腸桿菌基因組DNA濃度為100ng/μL，-20℃保存。

實施例3：檢測方法。

儀器：Roche480熒光定量PCR檢測儀，BECKMAN22R臺式微量冷凍離心機，Eppendorf 5810R臺式冷凍離心機，太倉華利達實驗室設備公司WH-866型渦旋振蕩器。

(1)糞便樣本前處理：1.樣品前處理：稱取1g糞便樣品用9ml無菌PBS懸浮，劇烈震蕩15min后，200r/min離心3次，每次5min，收集上清；然后5000r/min離心3min，收集菌體沉淀，用1ml PBS懸浮沉淀,重復離心，直到上清基本清澈為止；最后再用1ml PBS懸浮收集到的沉淀，置2ml Eppendorf管中-20保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)細菌基因組DNA模板的制備：參考公開的文獻，不同種類的細菌標本，采用相應的商品化基因組DNA抽提試劑盒，按照試劑盒說明書制備細菌基因組DNA，作為PCR反應模板備用。

(3)以步驟(1)得到的細菌基因組DNA為模板，利用13對特異性引物和探針進行細菌基因擴增檢測，具體包括如下步驟；

(3a)PCR反應液配制：從-20℃冰箱取出實施例2中的各組分，室溫融化，放冰盒上備用。加樣前10分鐘之內，按檢測樣本數(shù)配置PCR反應液Xμl：

X＝(23.5μl PCR反應液+7.5μl引物混合液+14μl雙蒸水)×(n份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)。

振蕩混勻后，2000rpm離心5s，按每孔45μl分裝到96孔PCR反應板中，轉至樣本制備區(qū)備用。

(3b)加樣：向分裝好試劑的反應孔中，分別加入待測細菌樣本DNA模板5μl(若樣本裂解產物保存在-20℃，使用前置室溫解凍，以13000rpm離心5min)，陽性對照孔加入5μl陽性對照，陰性對照孔加入5μl陰性對照，空白對照孔加入5μl雙蒸水，加樣過程要求冰上操作。貼好封口膜，3000rpm離心30s，然后放入PCR儀中。

(3c)PCR擴增：Roche480熒光定量PCR儀進行細菌氨基糖苷類耐藥基因檢測，反應條件如下：94℃預變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃20s，45個循環(huán)，熒光采集點在58℃，檢測模式設置為探針法，反應體積設置為50。保存文件，運行。

(3d)結果分析，具體包括如下步驟：

Roche480熒光PCR檢測儀點擊分析，選取定量模式，進入分析窗口，選定噪音線項，閾值設定為剛好超過無規(guī)則的噪音線的最高點(可根據實際情況適當調整)，且陽性曲線無拐點，保證噪音線項下的數(shù)值和分析項下的域值一致。每次實驗空白對照孔無Ct值，結果合格。點擊計算，自動計算得到每個測試的CT值。

(3e)陰陽性對照品結果標準及處理，具體按照如下步驟判定：

陰性對照品PCR擴增的Ct值應無數(shù)值或大于40且增長曲線不規(guī)則；陽性對照品PCR擴增增長曲線呈S型曲線且CT值小于37。

(4)步驟(3)所得的樣本耐藥基因檢測結果判斷，具體按照如下標準：

(4a)如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為無數(shù)值或大于40，則判樣本結果為陰性。

(4b)如果增長曲線呈S型曲線且Ct值<40，則按以下方法判斷：

若樣本的CT<37，則判樣本結果為陽性；

檢測樣本Ct≥37，重新配制PCR反應液進行PCR擴增，復查結果如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為無數(shù)值或大于40，則判樣本結果為陰性。如果增長曲線呈S型且Ct值仍舊小于40則判樣本結果為陽性。

實施例4：腹瀉病原菌檢測試劑盒的靈敏度分析

將標準菌株調成1×10⁶至1×10cfu/ml菌液，然后提取DNA進行靈敏度檢測。

附圖1～13中可見13腹瀉病原細菌的檢出限為10⁴～10cfu/ml。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州迪安生物技術有限公司 杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司

<120> 同時檢測多種腹瀉病原菌的引物及其應用

<130> SG20170223001

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F1引物

<400> 1

atcctaaaaa aggtgtagag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1引物

<400> 2

tatcagttct ttgacctttg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1探針

<400> 3

atatggtcct gaagcaagtg ca 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F2 引物

<400> 4

ataaagtcag aactctcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2引物

<400> 5

aacgcatttc cttcacgg 18

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P2探針

<400> 6

atgagataga agtctacctg gccttcc 27

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F3引物

<400> 7

tcaaccgctc atcgtctgt 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R3 引物

<400> 8

ctgcgacata gcggtgagt 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P3探針

<400> 9

cacccacgca ttgcgctctg agtgt 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F4 引物

<400> 10

taataggttc gtttgcttat acc 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R4引物

<400> 11

gcggaaagat ggccccattg tta 23

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P4 探針

<400> 12

cgatttcttc tatggcagta ataagt 26

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F5引物

<400> 13

actgatgaaa ctgtaaaca 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R5 引物

<400> 14

aacatcttta gtttttcca 19

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P5探針

<400> 15

cccaatatta tgtgttggag aaacttta 28

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F6引物

<400> 16

tgactgcttt gagcgcgcc 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R6引物

<400> 17

aatcacaaga tgaattgcc 19

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P6探針

<400> 18

agtggtgtag agatccacca aggtgtag 28

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F7引物

<400> 19

caggtgatgt agaactgaca aa 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R7

<400> 20

gcaccttttt tcaaaatatc tc 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P7探針

<400> 21

aaagccgtaa tttacggtgg ctccg 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F8 引物

<400> 22

tttcgttgat tcagataatg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R8 引物

<400> 23

aaatttctac ttttggccag 20

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P8探針

<400> 24

tagtgacata gaacaaaaaa tcactaa 27

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F9引物

<400> 25

aaggcggtgc cactgccgt 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R9 引物

<400> 26

tccggcttga agctgtctt 19

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P9 探針

<400> 27

tatcaggtca tcaacaacct ggact 25

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F10引物

<400> 28

tattggcgat agcctggcgg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R10 引物

<400> 29

tcggcatcaa tactcatctg 20

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P10探針

<400> 30

agtttatcgt tattaccaaa ggt 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F11引物

<400> 31

agggaaatca atatactata 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R11引物

<400> 32

tgagagttag ctagagttac 20

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P11探針

<400> 33

agtcatgcta gcatgagtca tagtt 25

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F12引物

<400> 34

ctgatgggtt taatgtaatg aa 22

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R12引物

<400> 35

gtctgacgta attctgctaa ta 22

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P12 探針

<400> 36

attatagtcg gagtagcaag ggataa 26

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F13引物

<400> 37

tgctccataa gatataaatt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R13引物

<400> 38

tttatactta tttaaaacaa 20

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P13探針

<400> 39

cataaggtga attttgatcg ttattgt 27