本發(fā)明屬于微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

沙門氏菌屬(Salmonella)分類屬細(xì)菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Bacillales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，是一種重要的腸道致病菌，已發(fā)現(xiàn)有近一千種(或菌株)。感染沙門氏菌，可引起人類的傷寒、腸熱癥、感染性腹瀉、敗血癥和胃腸炎等疾病，并引起動(dòng)物發(fā)生沙門氏菌病，是常見的人畜共患型致病菌。蛋、家禽、肉類、水產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)每年因沙門氏菌而導(dǎo)致的食物中毒事件占所有食物中毒事件的70％～80％，居細(xì)菌性食物中毒的首位，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將沙門氏菌列入具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原菌。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)是以培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的微生物學(xué)方法，普遍用于食品和藥品中沙門氏菌的檢驗(yàn)，也是沙門氏菌檢驗(yàn)的法定仲裁方法。由于沙門氏菌的血清型過(guò)于繁多，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法需要經(jīng)過(guò)前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清學(xué)分型鑒定等5個(gè)步驟，工作量大，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且受到檢測(cè)人員的專業(yè)、經(jīng)驗(yàn)等多種因素限制，容易出現(xiàn)誤判。因此，如何提供一種便捷快速的檢測(cè)沙門氏菌的方法一直是研究的熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌進(jìn)行安全、特異、快速、靈敏、簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種用于檢測(cè)食源性致病菌沙門氏菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增引物對(duì)和探針，其中引物對(duì)的序列信息如下：

正向引物F-RPA:5′-

GGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物R-RPA:ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(SEQ ID NO:2)；

其中反向引物的5′端進(jìn)行生物素Biotin標(biāo)記；

探針的序列信息如下：

RPA-P2:5′-

TTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCGTTTATCGTT-3′(SEQ ID NO:2)；

其中探針的5′端進(jìn)行羧基熒光素FAM標(biāo)記，3′端進(jìn)行C3-Spacer標(biāo)記；且第30位的C用四氫呋喃替代；

上述的引物組和探針用于非疾病診斷或治療領(lǐng)域的食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)；

上述的非疾病診斷或治療領(lǐng)域的食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)，是指對(duì)水產(chǎn)品中食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌沙門氏菌的方法，包括如下的步驟：

1)配制RPA反應(yīng)體系：

各引物的終濃度為：引物F-RPA和引物R-RPA各420nmol/μL；探針P 120nmol/μL；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl 50mmol/μL、KAc 100mmol/μL,DTT 2mmol/μL，5％PEG 20mol/μL，dNTPs200μmol/μL,ATP 3mmol/μL，磷酸肌酸激酶)50mmol/μL，肌酸激酶)100ng/μL，DNA聚合酶Bsu 30ng/μL、單鏈綁定蛋白Gp32300ng/μL、重組酶UvsX 240ng/μL、輔助酶UvsY 60ng/μL、核酸內(nèi)切酶Nfo 200ng/μL；待檢測(cè)的樣品DNA模板10ng，加雙蒸水使未反應(yīng)的混合體系體積為18μL；280mmol/μL MgAc 1.0μL，使反應(yīng)體系總體積為20μL；

2)RPA反應(yīng)體系擴(kuò)增：

無(wú)菌離心管中依次加入除醋酸鎂和模板DNA以外的所有反應(yīng)組分，振蕩后離心；加入10ng模板DNA，振蕩后離心；向混合體系中加入280mmol/μL MgAc 1.0μL于無(wú)菌離心管的蓋子上，蓋上蓋子，離心；搖晃10次，離心；37℃，孵育4min；取出反應(yīng)管，搖晃10次，離心；40℃，繼續(xù)孵育16min；

3)LFD檢測(cè)：取2.0μL核酸擴(kuò)增產(chǎn)物將產(chǎn)物加入到98μL Buffer中混勻，然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測(cè)，通過(guò)試紙條顯色情況判斷擴(kuò)增結(jié)果。試紙條的檢測(cè)線和控制線都呈紅色，說(shuō)明結(jié)果陽(yáng)性；只有控制線呈現(xiàn)紅色，檢測(cè)線位置無(wú)顏色，說(shuō)明結(jié)果陰性；控制線未顯色，結(jié)果無(wú)效。

本發(fā)明提供一種基于分子生物學(xué)的快速檢測(cè)食源性致病菌沙門氏菌的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌進(jìn)行安全、特異、快速、靈敏、簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的不足。并且此方法非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，能夠及時(shí)、有效的抑制沙門氏菌病疫情的發(fā)生，完善食品安全保障體系。

附圖說(shuō)明

圖1：沙門氏菌的RPA-LFD優(yōu)化的引物和探針設(shè)計(jì)示意圖，其中引物由方框圈出，探針由斜體并加下劃線表示；

圖2：本發(fā)明方法的反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖3：本發(fā)明方法的反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖4：本發(fā)明引物和探針的靈敏度的檢測(cè)結(jié)果圖；

圖5：本發(fā)明引物和探針的特異性檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)是一項(xiàng)由多種酶和蛋白參與、在恒定溫度條件下實(shí)現(xiàn)核酸指數(shù)擴(kuò)增的新技術(shù)。通過(guò)模擬DNA體內(nèi)擴(kuò)增，在37～42℃的等溫條件下10min內(nèi)產(chǎn)生目的片段，在40～60min完成數(shù)十億的DNA拷貝。橫向流動(dòng)試紙條(LFD)，融合了免疫層析技術(shù)和分子生物學(xué)手段，能在紙條上形成有顏色的檢測(cè)線從而可以特異性地檢測(cè)出該目標(biāo)產(chǎn)物。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)與橫向流動(dòng)試紙條(LFD)相互結(jié)合的技術(shù)，使RPA擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可視化，檢測(cè)結(jié)果明顯直觀，通過(guò)肉眼即可辨認(rèn)，RPA-LFD方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無(wú)設(shè)備及技術(shù)限制，非常適合野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，能對(duì)突發(fā)狀況作出迅速、及時(shí)而準(zhǔn)確的判斷。但是在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)如果沒有有效的引物和探針組合，常會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性或檢測(cè)靈敏度低下的問(wèn)題。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：引物及探針設(shè)計(jì)與篩選：

根據(jù)沙門氏菌侵襲蛋白(invasion protein A,invA)編碼基因invA基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過(guò)NCBI查找到公開的invA基因序列

(U43272.1)，根據(jù)保守區(qū)域，經(jīng)同源性分析后，以位于101-672的基因?yàn)槟康钠芜M(jìn)行RPA引物設(shè)計(jì)。

設(shè)計(jì)3組引物對(duì)進(jìn)行最佳引物篩選，引物組及序列如下：

第1組:

正向引物F1-RPA:5′-

TTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC-3′(30bp)

反向引物R1-RPA:5′-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

產(chǎn)物長(zhǎng)度：231bp

第2組:

正向引物F2-RPA:5′-

TGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTT-3′(30bp)

反向引物R1-RPA:5′-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

產(chǎn)物長(zhǎng)度：227bp

第3組:

正向引物F3-PRA:5′-

GGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTT-3′(32bp)

反向引物R1-RPA:5′-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

產(chǎn)物長(zhǎng)度：253bp

引物篩選：包括如下的步驟

1)配制RPA反應(yīng)體系：

各引物的終濃度為：引物F-RPA和引物R-RPA各420nmol/μL；探針P 120nmol/μL；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl(pH7.9)50mmol/μL、KAc(醋酸鉀)100mmol/μL,DTT(二硫蘇糖醇)2mmol/μL，5％PEG 20mol/μL，dNTPs 200μmol/μL,ATP 3mmol/μL，pcr(磷酸肌酸激酶)50mmol/μL，CK(肌酸激酶)100ng/μL，DNA聚合酶Bsu 30ng/μL、單鏈綁定蛋白Gp32 300ng/μL、重組酶UvsX 240ng/μL、輔助酶UvsY 60ng/μL、核酸內(nèi)切酶Nfo200ng/μL；樣品DNA模板10ng，加雙蒸水使未反應(yīng)的混合體系(reaction mix)體積為18μL；280mmol/μL MgAc(醋酸鎂)1.0μL，使反應(yīng)體系總體積為20μL。醋酸鎂能使反應(yīng)迅速開始，因此需要最后加入。

2)RPA反應(yīng)體系擴(kuò)增：

無(wú)菌離心管中依次加入除醋酸鎂和模板DNA以外的所有反應(yīng)組分，振蕩后離心；加入10ng模板DNA，振蕩后離心；向reaction mix中加入280mmol/μL MgAc(醋酸鎂)1.0μL于無(wú)菌離心管的蓋子上，蓋上蓋子，離心；搖晃10次，離心；37℃，孵育4min；取出反應(yīng)管，搖晃10次，離心；40℃，繼續(xù)孵育16min。

3)LFD檢測(cè)：取2.0μL核酸擴(kuò)增產(chǎn)物將產(chǎn)物加入到98μL Buffer中混勻，然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測(cè)，通過(guò)試紙條顯色情況判斷擴(kuò)增結(jié)果。試紙條的檢測(cè)線和控制線都呈紅色，說(shuō)明結(jié)果陽(yáng)性；只有控制線呈現(xiàn)紅色，檢測(cè)線位置無(wú)顏色，說(shuō)明結(jié)果陰性；控制線未顯色，結(jié)果無(wú)效。

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同反應(yīng)條件，第3組引物的擴(kuò)增效率、產(chǎn)物純度優(yōu)于其他2組引物，因此將第3組引物作為優(yōu)選，并對(duì)反向引物R1-RPA的5′端進(jìn)行生物素Biotin標(biāo)記。RPA引物的序列如下：

正向引物F-RPA:5′-

GGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTT-3′(30bp)

反向引物R-RPA:5′-biotin-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

探針設(shè)計(jì)及篩選：

探針設(shè)計(jì)：以優(yōu)選引物組對(duì)應(yīng)目的條帶區(qū)間為模板設(shè)計(jì)2條探針，在探針的合適位置插入四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)作為脫堿基位點(diǎn)類似物替代原序列中的堿基，并對(duì)探針的5′端進(jìn)行羧基熒光素FAM標(biāo)記，3′端進(jìn)行C3-Spacer標(biāo)記。修飾后探針序列如下：

RPA-P1:5′-FAM-

CCAAAGGTTCAGAACGTGTCGCGGAAGTCG[THF]GGCCCGATTTTCTCT-C3-Spacer-3′

RPA-P2:5′-FAM-

TTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC[THF]GTTTATCGTT-C3-Spacer-3′

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同反應(yīng)條件，探針RPA-P2效果優(yōu)于探針RPA-P1，因此將探針RPA-P2作為優(yōu)選。

反應(yīng)溫度優(yōu)化

設(shè)置25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，進(jìn)行RPA-LFD實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間為20min，20μL反應(yīng)體系，根據(jù)前述反應(yīng)體系添加各組分。模板量為試劑盒提取的1.0μL沙門氏菌基因組DNA。

結(jié)果顯示，在25℃時(shí)，體系中未檢出產(chǎn)物擴(kuò)增，而在30-45℃都檢出了產(chǎn)物擴(kuò)增。40℃時(shí)擴(kuò)增效率最高。RPA反應(yīng)體系涉及比較多的酶，因此溫度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)抑制酶活性。選擇40℃為最優(yōu)反應(yīng)溫度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖2)。

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

在最適合的反應(yīng)溫度下，探究最佳反應(yīng)時(shí)間。設(shè)置4min，8min，12min，16min，20min。反應(yīng)溫度為40℃，20μL反應(yīng)體系，根據(jù)前述反應(yīng)體系添加各組分。模板量為試劑盒提取的1.0μL沙門氏菌基因組DNA。

結(jié)果顯示，在加入鎂離子(反應(yīng)促進(jìn)劑)反應(yīng)開始后4min時(shí)，體系中未檢出產(chǎn)物擴(kuò)增，此時(shí)的擴(kuò)增子含量可能比較少，還未達(dá)到可檢測(cè)濃度，也可能體系中的各組分之間還在相互作用，沒有產(chǎn)物產(chǎn)生，這可能與酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有關(guān)。反應(yīng)開始后8min，LFD檢測(cè)線呈現(xiàn)微紅色，說(shuō)明檢出了產(chǎn)物擴(kuò)增，只是含量較少。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到12min以上，擴(kuò)增子的含量增加。LFD檢測(cè)線顏色表明，模板量足夠的情況下，反應(yīng)時(shí)間12min已經(jīng)能夠檢測(cè)到明顯的陽(yáng)性擴(kuò)增。說(shuō)明RPA反應(yīng)體系反應(yīng)迅速，這點(diǎn)優(yōu)勢(shì)非常適用于快速檢測(cè)?？紤]到模板量低的情況，后續(xù)反應(yīng)時(shí)間選擇為16min(圖3)。

實(shí)施例2引物探針的檢測(cè)靈敏度和特異性

設(shè)置5組不同濃度的沙門氏菌DNA模板(DNA濃度梯度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、0)，進(jìn)行RPA最適條件下的核酸擴(kuò)增。

參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取的沙門氏菌DNA，將所提取的DNA模板原始濃度(511.7ng/μL)按10倍梯度稀釋成100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL，分別取1μL作為反應(yīng)模板。按照前述加樣方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物L(fēng)FD進(jìn)行檢測(cè)：

結(jié)果顯示，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針組合能夠保證檢測(cè)時(shí)的靈敏性，檢測(cè)靈敏度為DNA終濃度5fg/μL，相當(dāng)于5CFU/mL。當(dāng)模板濃度低于提取DNA濃度的10-8時(shí)，不能檢出產(chǎn)物的擴(kuò)增(圖4)。

檢測(cè)特異性

反應(yīng)時(shí)間溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為16min，20μL反應(yīng)體系，根據(jù)前述反應(yīng)體系添加各組分。Sal模板量為100ng，非特異性菌株(副溶血性弧菌VP，單增李斯特菌LM，溶藻弧菌VA，霍亂弧菌Vc，哈維氏弧菌VH，鰻弧菌Van，金黃色葡萄球菌SA)的DNA分別為各100ng。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用LFD進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，除了Sal對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)線和控制線都出現(xiàn)了紅色，其他非特異性菌株的實(shí)驗(yàn)組都只有控制線出現(xiàn)了顯色。結(jié)果表明，此方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的特異性檢測(cè)，不與其他相關(guān)致病菌發(fā)生交叉反應(yīng)(圖5)。

實(shí)施例3對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用

1.樣品采購(gòu)：

水產(chǎn)品來(lái)自于水產(chǎn)品流通市場(chǎng)，包括海瓜子(Moerella iridescens)、蟶子(Sinonovacula constricta)、淡菜(Mytilidae)、蛤蜊(Clam)、血蚶(Sanguinolaria)(10g凈含量/份)。

2.樣品制備

2.1非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)。

2.2貝類取全部?jī)?nèi)容物，包括貝肉和體液。帶殼貝類則應(yīng)先在自來(lái)水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無(wú)菌操作打開外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。

2.3以無(wú)菌操作取樣品10g，加入Buffered Peptone Water培養(yǎng)基(BPW)90mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8 000r/min均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，為增菌前樣品液。

3.前增菌

用1mol/mL無(wú)菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。將增菌前樣品液于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。

4.選擇性增菌

取前增菌液劃線培養(yǎng)于亞硫酸鉍瓊脂(Bismuth Sulfite Agar，BS)平板上，培養(yǎng)37℃24h±2h。挑取可疑菌落，于1mL BPW，混勻，于36℃±1℃培養(yǎng)18h。

5.鑒定

5.1煮沸法提取DNA作為粗模板：菌液1mL，8000rpm，5min，棄上清，加50μL無(wú)菌水重懸，煮沸5min，12000rpm，5min，提取上清液。保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

5.2對(duì)比方法：參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SNT 1870-2007食品中致病菌檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》中的方法，作為對(duì)比方法。

引物序列：

F-PCR:5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’

R-PCR:5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’

P-PCR:5’-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-3’，5’標(biāo)記FAM，3’標(biāo)記TAMRA

此方法對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)限為5000CFU/mL。Real-time PCR采用兩步法擴(kuò)增核酸，反應(yīng)程序如下：94℃，預(yù)變性10min；94℃變性3s，60℃退火/延伸40s，經(jīng)40個(gè)循環(huán)。Real-time PCR通過(guò)特定的熒光信號(hào)采集進(jìn)行結(jié)果鑒定。

5.3樣品檢測(cè)

a.增菌前樣品中Sal鑒定：取1mL增菌前樣品液，用煮沸法提取DNA，2μL DNA粗模板分別進(jìn)行RPA-LFD鑒定和對(duì)比方法的鑒定。

b.增菌后樣品中Sal鑒定：取1mL選擇性增菌液，用煮沸法提取DNA，2μL DNA粗模板進(jìn)行對(duì)比方法的進(jìn)一步確認(rèn)。

5.4檢測(cè)結(jié)果

5.4.1以2μL增菌前樣品的DNA粗模板分別進(jìn)行RPA-LFD鑒定和real-time PCR方法的鑒定，結(jié)果顯示，采用RPA-LFD鑒定結(jié)果為四個(gè)樣品呈Sal陽(yáng)性，分別是B-1，C-2，G-2，X-2，其他樣品鑒定結(jié)果為陰性。而real-time PCR鑒定結(jié)果為所有樣品都為陰性，陽(yáng)性對(duì)照組(反應(yīng)體系中Sal DNA含量為500ng)出現(xiàn)熒光信號(hào)。

5.4.2以2μL選擇性增菌后樣品的DNA粗模板進(jìn)行real-time PCR方法的進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示real-time PCR鑒定Sal陽(yáng)性樣品為B-1，C-2，D-1，D-2，G-2，G-3，X-1，X-2，陰性樣品為B-2，C-1，G-1。且陽(yáng)性結(jié)果中，樣品B-1，C-2，G-2，X-2的Cq值都小于35，說(shuō)明起始模板中的目的基因含量較高，能在短時(shí)間內(nèi)完成一定量的帶標(biāo)記信號(hào)的擴(kuò)增子，使熒光信號(hào)強(qiáng)度較快達(dá)到檢測(cè)閾值。而樣品D-1，D-2，G-2，G-3，X-1的Cq值都大于35，說(shuō)明起始模板中目的基因含量很低，擴(kuò)增子熒光信號(hào)積累達(dá)到閾值需要的時(shí)間更長(zhǎng)。與擴(kuò)增前樣品檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，RPA-LFD在未經(jīng)微生物培養(yǎng)擴(kuò)增之前就靈敏檢測(cè)出部分污染微量沙門氏菌的樣品，擴(kuò)增后real-time PCR鑒定得出的陽(yáng)性樣品結(jié)果證明了RPA-LFD檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波大學(xué) 寧波海洋研究院

<120> 一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

ggcgatagcc tggcggtggg ttttgttgtc tt 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

acttcatcgc accgtcaaag gaaccgtaaa 30

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