本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一組擴增熒光假單胞菌基因的雙重PCR引物。此外，本發(fā)明還涉及一種檢測熒光假單胞菌的試劑盒，以及一種檢測熒光假單胞菌的方法。

背景技術：

熒光假單胞菌是原料乳中常見的主要危害嗜冷菌。在原料乳的加工生產(chǎn)過程中，熒光假單胞菌可能會在生產(chǎn)設備管道中或設備表面形成生物膜。生物膜一旦形成，將難以清除，并可能長期危害乳品的質(zhì)量和安全。

當前檢測微生物生物膜形成的方法，如結晶紫染色法、顯微鏡觀測法等，只能識別微生物是否具有生物膜的形成能力，但不能鑒別微生物的種類。而能夠鑒別微生物的基因檢測方法，只能對熒光假單胞菌進行種類識別，不能鑒別熒光假單胞菌的生物膜形成能力。

對于乳品生產(chǎn)來說，具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌最具危害性，其對乳品生產(chǎn)的質(zhì)量和安全有重要意義。此前，發(fā)明人開發(fā)了一種檢測熒光假單胞菌的檢測方法，通過設計一對引物進行單重PCR來檢測，由于檢測靶點單一，可能存在漏檢的情況。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一組擴增熒光假單胞菌基因的PCR引物，采用該組引物進行雙重PCR，可以特異性地擴增出單個靶點對應的基因擴增片段，一次性進行雙靶點檢測，降低了漏檢率，提高了檢測結果的可靠性。

具體的，第一方面，提供一組用于擴增熒光假單胞菌基因的雙重PCR引物，所述PCR引物包括用于擴增熒光假單胞菌adnA基因的第一引物對，及用于擴增熒光假單胞菌fliC基因的第二引物對；

第一引物對：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，

adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；

第二引物對：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，

fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。

第二方面，提供了一種檢測熒光假單胞菌的試劑盒，包括第一方面所述的第一引物對和第二引物對、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。

第三方面，提供了一種檢測熒光假單胞菌的方法，包括以下步驟：

(a)提取待測菌株的基因組DNA，獲得模板DNA；

(b)進行雙重PCR反應，雙重PCR反應體系包括：權利要求1所述的第一引物對和和第二引物對、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH₂O；

(c)將步驟(b)反應得到的產(chǎn)物進行電泳。

結合第三方面，在第三方面的一種可能的實現(xiàn)方式中，所述步驟(b)中，反應體系中第一引物對的正向引物adnA-for、第一引物對的反向引物adnA-rev、第二引物對的正向引物fliC-for和第二引物對的反向引物fliC-rev的最終濃度均為1μM。

結合第三方面或上述某些可能的實施方式，在第三方面的一種可能的實現(xiàn)方式中，所述步驟(b)中，反應體系中Taq酶的最終濃度為0.2-0.5U/μl。

結合第三方面或上述某些可能的實施方式，在第三方面的一種可能的實現(xiàn)方式中，所述步驟(b)中，PCR緩沖液包括KCl、Tris-HCl和MgCl₂，三者在反應體系中的最終濃度分別為50mM、10mM和1.5mM。

結合第三方面或上述某些可能的實施方式，在第三方面的一種可能的實現(xiàn)方式中，所述步驟(b)中，反應體系中脫氧核糖核苷三磷酸最終濃度為0.25mM。

結合第三方面或上述某些可能的實施方式，在第三方面的一種可能的實現(xiàn)方式中，所述步驟(b)中，雙重PCR擴增的反應條件包括：94℃，預變性5min；94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min50s，循環(huán)40次；72℃延伸10min；4℃，保存。

在上述反應體系及反應條件下，檢測熒光假單胞菌的方法中雙重PCR的擴增效率更高，從而使檢測效果更好。

結合第三方面或上述某些可能的實施方式，在第三方面的一種可能的實現(xiàn)方式中，所述步驟(c)中產(chǎn)物電泳檢測到長度為1.47kb的條帶和/或長度為0.75kb的條帶。

上述技術方案中，通過設計了一組(兩對)用于擴增熒光假單胞菌基因的雙重PCR引物，可以特異性地擴增出熒光假單胞菌中的adnA基因片段和/或fliC基因片段，而對于其他種類的假單胞菌，則無法擴增出adnA基因片段和fliC基因片段，對于無生物膜形成能力的熒光假單胞菌，也無法擴增出adnA基因片段和fliC基因片段。因此，將第一引物對和第二引物對共同用于進行雙重PCR來擴增待測菌株的adnA基因片段和/或fliC基因片段，通過檢測adnA基因片段或fliC基因片段是否存在，就可以判斷是否存在具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

采用第一引物對和第二引物對進行雙重PCR，一次實驗操作可以同時得到兩段基因片段的擴增產(chǎn)物，進而實現(xiàn)雙靶點檢測，相比于單一靶點檢測方法而言提高了檢測結果的可靠性，降低了漏檢率，同時也沒有增加檢測時間，與逐一檢測靶點的方法相比還降低了檢測費用，提高了檢測效率。采用該方法操作簡單，能夠快速有效地檢測具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所提供的第一個實施例的電泳結果。

圖2為本發(fā)明所提供的第二個實施例的電泳結果。

具體實施方式

為更清楚的對本發(fā)明技術方案予以闡述，下面將結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行進一步闡述。

adnA基因是負責熒光假單胞菌生物膜形成的調(diào)控基因，此前，發(fā)明人開發(fā)了一種檢測熒光假單胞菌的檢測方法，通過設計一對擴增adnA基因的引物，進行單重PCR來檢測，由于檢測靶點單一，可能存在漏檢的情況。為此，發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性勞動，提供一種改進方案，通過設計另一對擴增fliC基因的引物，fliC基因是負責熒光假單胞菌鞭毛生物合成的基因，adnA基因和fliC基因都是負責熒光假單胞菌生物膜形成的關鍵基因，將兩對引物一起進行雙重PCR來檢測具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，從而大大減少了漏檢的情況。

具體地，設計的雙重PCR引物包括用于擴增熒光假單胞菌adnA基因的第一引物對，及用于擴增熒光假單胞菌fliC基因的第二引物對；

第一引物對：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，

adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；

第二引物對：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，

fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。

雙重PCR和單重PCR相比，由于引物的增多，會導致引物二聚體以及非特異性擴增的概率增多，因此，引物的設計十分重要。通過上述的兩對引物對，從而實現(xiàn)同時特異性擴增adnA基因和fliC基因，提高了熒光假單胞菌的檢測結果的可靠性，降低了漏檢率，同時也沒有增加檢測時間，與逐一檢測靶點的方法相比還降低了檢測費用，提高了檢測效率。

進一步地，通過優(yōu)化雙重PCR的條件，使得檢測方法中兩對引物對與反應體系中各組分的濃度、反應條件等相互配合，進一步減少引物二聚體和非特異性擴增。例如，通過優(yōu)化退火溫度，確保同一個退火溫度下更好地實現(xiàn)兩個PCR反應，從而進一步的增強引物PCR的特異性，減少非特異性擴增，得到特異性更強的條帶。

以下實施例中涉及的菌種有熒光假單胞菌1035，M73，M55，M45，1044、1034、N25和D64，惡臭假單胞菌菌株796，莓實假單胞菌菌株M66、海雀假單胞菌菌株M62，非熒光假單胞菌菌株A102、D103和784，上述菌種在本發(fā)明中均為待測菌株，只是為了驗證說明本發(fā)明技術方案的技術效果，不涉及本發(fā)明技術方案的本身，不會影響本發(fā)明技術方案的實施。

以下實施例中使用的10X buffer為PCR緩沖液中的一種，10X buffer包括200mM KCl、40mM Tris-HCl和6mM MgCl₂。dNTP為脫氧核糖核苷三磷酸，ddH₂O為雙蒸水，均為本領域?qū)I(yè)術語。

下列實施例中未作特別說明的試劑和實驗設備，均可以通過商業(yè)途徑直接購得。

實施例一

(1)已知的，熒光假單胞菌1035，M73，M55，M45，1044和1034均是具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌菌株，熒光假單胞菌N25是不具備生物膜形成能力的熒光假單胞菌菌株，將上述7個菌株從-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％體積比的接種量接種到含1ml LB培養(yǎng)基的EP管中，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

(2)取1ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，室溫下放置5-10分鐘。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(不振蕩)，冰浴5分鐘。加入150μl預冷的溶液Ⅲ(5M醋酸鉀緩沖液，pH 4.8)，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘，4℃下12000g離心5-10分鐘。上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿(1:1)，振蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。將沉淀(待檢測DNA)溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。

(3)進行雙重PCR擴增，擴增所用的是第一引物對和第二引物對，

第一引物對：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，

adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；

第二引物對：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，

fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。

雙重PCR反應體系組成是：

PCR反應條件是：94℃，預變性5min；94℃，15s，60℃，30s，72℃，1min50s，循環(huán)40次；72℃，10min；4℃，保存。

(4)將擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳，電泳結果如附圖1所示。

1.47kb和0.75kb處的條帶分別為adnA和fliC基因片段，這兩個條帶含有其中之一或都含有則代表此泳道的菌株為具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

附圖1中，泳道M:2kbMarker，泳道1:N25，泳道2:1035，泳道3:M73，泳道4:M55，泳道5:M45，泳道6:1044，泳道7:1034。從電泳結果可見，N25在1.47kb和0.75kb處均無條帶，說明其不形成生物膜。而菌株1035，M73和1034在0.75kb處有條帶，說明這三種菌株具有生物膜形成能力。菌株M55在1.47kb和0.75kb處都有條帶，說明其具有生物膜形成能力。菌株M45和1044在1.47kb處有條帶，說明二者具有生物膜形成能力。

采用實施例的雙重PCR的方法所檢測的結果與已知的待測菌株的實際情況相符，說明采用上述技術方案所提供的雙重PCR引物進行擴增，對于不具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，無法擴增得到adnA基因和/或fliC片段，只有具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌才能擴增相應靶點的基因片段，從而實現(xiàn)有針對性地、準確快速地檢測出具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

實施例二

(1)已知的，假單胞菌菌株D64為具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，而惡臭假單胞菌菌株796，莓實假單胞菌菌株M66、海雀假單胞菌菌株M62，非熒光假單胞菌菌株A102、D103和784都不具備生物膜形成能力。將上述7個菌株從-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％體積比的接種量接種到含1ml LB培養(yǎng)基的EP管中，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

(2)取1ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，室溫下放置5-10分鐘。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(不振蕩)，冰浴5分鐘。加入150μl預冷的溶液Ⅲ(5M醋酸鉀緩沖液，pH 4.8)，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘，4℃下12000g離心5-10分鐘。上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿(1:1)，振蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。將沉淀(待檢測DNA)溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。

(3)進行雙重PCR擴增，擴增所用的是第一引物對和第二引物對，

第一引物對：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，

adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；

第二引物對：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，

fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。

雙重PCR反應體系組成是：

PCR反應條件是：94℃，預變性5min；94℃，15s，60℃，30s，72℃，1min50s，循環(huán)40次；72℃，10min；4℃，保存。

將擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳，電泳結果如附圖2所示。

附圖2中，泳道M:2kbMarker,泳道1:D64，泳道2:796，泳道3:M62，泳道4:M66，泳道5:A102，泳道6:D103，泳道7:784。從電泳結果可見，菌株D64在1.47kb和0.75kb處均有條帶，說明其是具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。796、M62、M66、A102、D103和784這6個菌株對應的泳道在1.47kb和0.75kb處均無條帶，說明這6種菌株都不形成生物膜。采用實施例的雙重PCR的方法所檢測的結果與已知的待測菌株的實際情況相符，說明采用上述技術方案所提供的雙重PCR引物進行擴增，對于不具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，以及其他菌株，均無法擴增得到adnA基因和/或fliC片段，只有具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌才能擴增相應靶點的基因片段，從而實現(xiàn)有針對性地、準確快速地檢測出具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

以上對本發(fā)明所提供的一組用于擴增熒光假單胞菌基因的雙重PCR引物、熒光假單胞菌的檢測方法及試劑盒進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 光明乳業(yè)股份有限公司

<120> 用于擴增熒光假單胞菌基因的雙重PCR引物、熒光假單胞菌的檢測方法及試

劑盒

<130> EKP170060-DD-1-SQ

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<170> PatentIn version 3.5

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