本發(fā)明涉及一種微生物多態(tài)性動態(tài)變化監(jiān)測方法，特別涉及一種快速分析微生物多態(tài)性動態(tài)變化的微型熒光凝膠電泳方法。

背景技術(shù)：

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是微生物多態(tài)性分析中重要的分子生物學(xué)分子方法。基本原理是對不同的生物種群或微生物類群特定的DNA片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，不同微生物DNA片段中酶切位點不同，產(chǎn)生酶切片段大小和數(shù)量不同，通過對酶切DNA片段分析獲得微生物多樣性結(jié)果。RFLP可以檢測到酶切位點因DNA變異造成的酶切片段長度的差異，分辨率高，重復(fù)性強(qiáng)。通過RFLP的方法進(jìn)行檢測和篩選，簡單，成本低廉，高效快速，因此能夠大大節(jié)約實驗成本和時間。關(guān)于RFLP技術(shù)已有報道，但是利用該技術(shù)監(jiān)測微生物組分動態(tài)變化卻沒報道。目前最常用的檢測環(huán)境微生物是高通量測序的方法，這種方法需要提供高質(zhì)量的基因組DNA，而且費用非常昂貴，整個過程比較耗時，而且可重復(fù)性比較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速分析微生物多態(tài)性動態(tài)變化的微型熒光凝膠電泳方法，簡單易行，成本低，高效快速，重復(fù)性好。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種快速分析微生物多態(tài)性動態(tài)變化的微型熒光凝膠電泳方法，包括如下步驟：

(1)用引物PCR擴(kuò)增微生物16S rDNA，引物為27F和1492R，其中27F的5’端有FAM熒光標(biāo)記，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對確定菌種；

(2)利用HhaⅠ限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，會產(chǎn)生多條大小不一的片段，每條16S rDNA只有最左端限制性酶切片段具有熒光標(biāo)記，其它片段沒有熒光標(biāo)記；

(3)利用微型垂直PAGE凝膠電泳分離各個微生物物種的熒光標(biāo)記片段，最后通過熒光成像系統(tǒng)觀察凝膠，根據(jù)片段大小、熒光強(qiáng)弱，確定各微生物物種的動態(tài)變化。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，27F的核苷酸序列為：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，M為A或C；1492R的核苷酸序列為：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)，Y為C或T。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，PCR擴(kuò)增體系：5μl的10×Buffer，4μl的dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mM的混合物)，1.5μl的27F(濃度為10μM)，1.5μl的1492R(濃度為10μM)，0.25μl的rTaq酶(濃度為10U/μl)，1μl的DNA模板，用ddH₂O補(bǔ)足至50μl；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循環(huán)40次；最后72℃延伸10min。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，HhaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系如下：10×buffer7μl，HhaⅠ限制性內(nèi)切酶0.5μl(濃度為10U/μl)，PCR產(chǎn)物47μl，ddH₂O 15.5μl；酶切反應(yīng)條件為：37℃恒溫金屬浴過夜。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，電泳緩沖液為TBE，電泳條件為100v恒壓，2h。作為優(yōu)選，電泳凝膠的配方為：蒸餾水5.5mL，30％Acr-Bis(30％為Acr-Bis(質(zhì)量比為29:1)的混合物質(zhì)量濃度)25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％過硫酸銨(10％質(zhì)量濃度)0.5mL，TEMED 0.02mL。

本發(fā)明的有益效果是：簡單易行，成本低，高效快速，重復(fù)性好，應(yīng)用性廣，可廣泛應(yīng)用于原核生物的研究。

附圖說明

圖1是在不同培養(yǎng)條件下生物表面活性劑和石油降解微生物的變化。A，油污微生物在MSM+YE培養(yǎng)基條件下的生長曲線，B，油污微生物在MSM+Glu培養(yǎng)基條件下的生長曲線，C，在MSM+YE培養(yǎng)基條件下，油污微生物件隨著時間的變化而發(fā)生種類的動態(tài)變化，D，在MSM+Glu培養(yǎng)基條件下，油污微生物件隨著時間的變化而發(fā)生種類的動態(tài)變化。

圖2是在MSM+YE和MSM+Glu兩種培養(yǎng)基條件下積累的優(yōu)勢菌種的生長曲線。A，Alcaligenes CT10，B，Donghicola，C，Bacillus CT6，D，Pseudomonas ZS1。

圖3是在MSM+YE培養(yǎng)條件下，Alcaligenes CT10和Pseudomonas ZS1共培養(yǎng)時，隨著時間的變化，Alcaligenes CT10可抑制Pseudomonas ZS1生長。A，Alcaligenes CT10和Pseudomonas ZS1共培養(yǎng)的生長曲線，B，Alcaligenes CT10和Pseudomonas ZS1共培養(yǎng)時微生物的動態(tài)變化，C，在接種有Pseudomonas ZS1的固體培養(yǎng)基上，Alcaligenes CT10培養(yǎng)液的上清液可抑制Pseudomonas ZS1。

圖4是在MSM+YE培養(yǎng)條件下，Pseudomonas ZS1和Donghicola與Bacillus CT6共培養(yǎng)時，隨著時間的變化，Pseudomonas ZS1可抑制Donghicola與Bacillus CT6生長。A，Pseudomonas ZS1和Donghicola共培養(yǎng)的生長曲線，B，Pseudomonas ZS1和Donghicola共培養(yǎng)時微生物的動態(tài)變化，C，在接種有Donghicola的固體培養(yǎng)基上，Pseudomonas ZS1培養(yǎng)液的上清液可抑制Donghicola。D，E和F為Pseudomonas ZS1和Bacillus CT6共培養(yǎng)，結(jié)果注釋同Pseudomonas ZS1和Donghicola共培養(yǎng)。

圖5是MSM+YE培養(yǎng)條件下，用本方法可實時監(jiān)測微生物之間的拮抗作用。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實施例：

1.樣品的制備與培養(yǎng)：取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L的MSM培養(yǎng)基中：Na₂HPO₄0.6g，KH₂PO₄ 0.2g，NaNO₃ 4.0g，MgSO₄ 0.3g，CaCl₂ 0.01g，F(xiàn)eSO₄ 0.01g，水余量。配置MSM+YE或MSM+Glu培養(yǎng)基時添加2％酵母粉或葡萄糖作為碳源。培養(yǎng)3天后，取1ml混合培養(yǎng)基分別接種到Y(jié)E和Glu作為碳源的MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)條件為30℃，180rpm，OD₆₀₀測試生長曲線(見圖1)。圖1中，A、B圖說明說明油污泥溶解于MSM+YE/Glu后的生長情況，C和D圖說明隨著時間的推移，在兩種培養(yǎng)基條件下，不同的優(yōu)勢菌種開始富集，說明本方法可對微生物種類進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。

2.菌株的富集和DNA提?。悍謩e在10h，20h，35h，50h收集菌液并提取混合細(xì)菌的DNA，DNA提取使用Axygen公司的DNA提取試劑盒。

3.16S rDNA PCR：將培養(yǎng)的細(xì)菌提取基因組DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其中正向引物帶有熒光標(biāo)記(FAM)，反向引物為微生物的16S rDNA通用引物。正向引物27F和反向引物1492R。PCR采用Takara公司的試劑盒R001B。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s,72℃延伸90s，循環(huán)40次；最后72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)體系：

4.菌種分離鑒定：對16S rDNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對菌株進(jìn)行鑒定。

5.限制性內(nèi)切酶酶切：將16S rDNA PCR產(chǎn)物使用HhaⅠ(takara,1056A)進(jìn)行酶切，37℃金屬浴恒溫過夜。樣品實驗過程中用錫箔紙包裹保持黑暗條件進(jìn)行。

酶切反應(yīng)體系如下：

6.微型垂直PAGE凝膠電泳：酶切產(chǎn)物凝膠電泳緩沖液為TBE。電泳條件為100v恒壓，2h。

電泳凝膠配制:

5×TBE的配制(1L)

Tris 54g

硼酸 27.5g

0.5M EDTA 20mL。

7.凝膠成像觀察：將PAGE凝膠置于天能5200multi凝膠成像儀，觀察熒光。

結(jié)果說明：

圖2為優(yōu)勢菌種在分離純化后培養(yǎng)的生長曲線，優(yōu)勢菌種(Alcaligenes CT10、Donghicola、Bacillus CT6、Pseudomonas ZS1)由菌株的富集和DNA提取、16S rDNA PCR和菌種分離鑒定這三部分得到，圖2說明用本方法監(jiān)測得到的優(yōu)勢菌種可培養(yǎng)，并測試了其生長曲線。

圖3為將單獨分離的兩種菌(Alcaligenes CT10和Pseudomonas ZS1)混合在一起培養(yǎng)，隨著時間的推移，可利用本方法實時觀察微生物的生長，可歸納為模擬混合油污泥中的微生物生長和拮抗。(實驗部分包括上述步驟1,2,3,5,6，7，除去4菌種鑒定部分，1部分菌種的培養(yǎng)原始樣本由油污泥改為分離得到的菌種)。圖3中A圖為將單獨分離的兩種菌混合在一起培養(yǎng)時的總體生長曲線，B圖說明本方法可實時監(jiān)測微生物發(fā)生拮抗作用時含量的變化，C圖在固體培養(yǎng)基上證明了B圖的結(jié)果。

圖4為將單獨分離的兩種菌混合(Pseudomonas ZS1和Donghicola或Bacillus CT6)在一起培養(yǎng)，隨著時間的推移，可利用本方法實時觀察微生物的生長，模擬混合油污泥中的微生物生長和拮抗。(實驗部分包括上述步驟1,2,3,5,6，7，除去4菌種鑒定部分，1部分菌種的培養(yǎng)原始樣本由油污泥改為分離得到的菌種)。

圖4中A、D圖為將單獨分離的兩種菌混合在一起培養(yǎng)時的總體生長曲線，B和E說明本方法可實時監(jiān)測微生物發(fā)生拮抗作用時含量的變化，C和F圖在固體培養(yǎng)基上證明了B和E圖的結(jié)果。

MSM+YE培養(yǎng)條件下，用本方法可實時監(jiān)測微生物之間的拮抗作用。Alcaligenes CT10抑制Pseudomonas ZS1，Pseudomonas ZS1抑制Donghicola與Bacillus CT6(圖5)。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學(xué)舟山海洋研究中心

<120> 一種快速分析微生物多態(tài)性動態(tài)變化的微型熒光凝膠電泳方法

<130> 2017.02

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22