本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及采用分子標(biāo)記進(jìn)行基因檢測，具體為一種人類常染色體和Y染色體InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：親權(quán)鑒定和個體識別是法醫(yī)DNA鑒定的主要內(nèi)容。短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat，STR)分型技術(shù)是目前普遍采用的技術(shù)手段。STR基因座是核心序列為2～6bp的短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性遺傳標(biāo)記。20世紀(jì)90年代初，STR基因座首次作為一種重要的遺傳標(biāo)記在人類親權(quán)鑒定中被使用。從此，法醫(yī)物證鑒定進(jìn)入了DNA鑒定時代。隨著STR基因座在法醫(yī)DNA分析中的廣泛應(yīng)用，其缺陷也日益受到關(guān)注，如STR基因座的高突變率不利于親權(quán)鑒定的結(jié)果解釋，PCR擴(kuò)增子較長不易實(shí)現(xiàn)對降解檢材的DNA分型，STR基因座的數(shù)量有限不利于復(fù)雜親緣關(guān)系的鑒定等。而曾被學(xué)界提出有望作為STR替代標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)則因受到分型系統(tǒng)的限制而止步于更廣泛的法醫(yī)DNA鑒定的應(yīng)用。InDel多態(tài)性是人類基因組中一種特殊類型的二等位基因遺傳標(biāo)記，表現(xiàn)為基因組中插入或缺失了不同大小的小片段。InDel作為新一代的法醫(yī)遺傳學(xué)鑒定標(biāo)記，兼具STR和SNP的優(yōu)點(diǎn)。與STR相比，InDel突變頻率較低，約為10-8，比STR小幾個數(shù)量級，相對比較穩(wěn)定。同時在結(jié)構(gòu)上屬于二等位基因多態(tài)性，等位基因都固定并且已知，能夠通過很小的擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增高度降解檢材的成功率。與SNP相比，InDel本質(zhì)上屬于長度多態(tài)性，可以應(yīng)用于目前法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室普及的毛細(xì)管電泳技術(shù)平臺上進(jìn)行分析，分型技術(shù)易于掌握和普及。2006年，Mills等創(chuàng)建了第一個人類基因組InDel圖譜。該圖譜中包含有415000多個具有特異性的多態(tài)性位點(diǎn)，平均密度為每7.2kb一個InDel位點(diǎn)。2011年的隨訪研究又報道了在79種不同人群的基因組中發(fā)現(xiàn)了近200萬個InDel多態(tài)性標(biāo)記。這項(xiàng)工作被認(rèn)為是InDel位點(diǎn)識別方面里程碑式的進(jìn)展，大大促進(jìn)了InDel在相關(guān)領(lǐng)域的研究，同時也引起了法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注。2009年，Pereira等建立了一種用于人類個體識別的多重PCR體系，該體系包含有38個位于非編碼區(qū)的常染色體InDel。目前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多的InDel商品化試劑盒是QIAGEN公司的InvestigatorDIPplexKit熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，該試劑盒包含了30個常染色體InDel位點(diǎn)，采用四色熒光標(biāo)記技術(shù)，其優(yōu)勢在于能夠通過一次PCR得到所有目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳平臺進(jìn)行檢測分型。但是由于InDel屬于二等位基因，已有的報道顯示30個InDel位點(diǎn)在國內(nèi)外多個人群中的多態(tài)性表現(xiàn)不能完全達(dá)到司法鑒定案件中遺傳標(biāo)記的要求，且并非根據(jù)我國主要民族群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)篩選得到的高多態(tài)性位點(diǎn)，因此一定程度上制約了該InDel試劑盒在個體識別和親權(quán)鑒定上的應(yīng)用。中國專利CN101956005A，公開了一種熒光標(biāo)記的插入缺失遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)及其應(yīng)用，具體為：該現(xiàn)有技術(shù)包含擴(kuò)增35個InDel位點(diǎn)的特異性引物，所述引物由FAM、HEX、TAMRA、ROX四種熒光素標(biāo)記，該試劑盒可以應(yīng)用于三聯(lián)體親子鑒定、二聯(lián)體親子鑒定、祖孫鑒定、同胞鑒定以及個體識別和人類學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具有高靈敏度、多態(tài)性高、穩(wěn)定性、重復(fù)性好、分型結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但是該現(xiàn)有技術(shù)存在以下不足：(1)采用四色熒光系統(tǒng)，鑒定效率較低；(2)部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大于200bp，對于降解的檢材，檢測效果不佳；(3)檢測的位點(diǎn)較少，人群識別度不高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種針對中國人群，且適用于高度降解的檢材的鑒定分析的試劑盒，本發(fā)明提供了一種人類常染色體和Y染色體InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種人類常染色體和Y染色體InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，所述試劑盒包含47對常染色體InDel位點(diǎn)基因座的特異性擴(kuò)增引物、2對Y染色體InDel位點(diǎn)基因座的特異性擴(kuò)增引物以及1對性別鑒定基因的特異性擴(kuò)增引物；所述InDel位點(diǎn)基因座為：InDel-01(rs3067397)、InDel-02(rs10607699)、InDel-03(rs71852971)、InDel-04(rs67487831)、InDel-05(rs140683187)、InDel-06(rs5787309)、InDel-07(rs34287950)、InDel-08(rs67100350)、InDel-09(rs769299)、InDel-10(rs3076465)、InDel-11(rs67939200)、InDel-12(rs145941537)、InDel-13(rs67264216)、InDel-14(rs35453727)、InDel-15(rs35065898)、InDel-16(rs60575667)、InDel-17(rs66911131)、InDel-18(rs61490765)、InDel-19(rs34419736)、InDel-20(rs34421865)、InDel-21(rs66739142)、InDel-22(rs3029189)、InDel-23(rs33971783)、InDel-24(rs72085595)、InDel-25(rs34529638)、InDel-26(rs11277697)、InDel-27(rs10558392)、InDel-28(rs538690481)、InDel-29(rs140323077)、InDel-30(rs66477007)、InDel-31(rs3834231)、InDel-32(rs145577149)、InDel-33(rs35309403)、InDel-34(rs66595817)、InDel-35(rs1160980)、InDel-36(rs79225518)、InDel-37(rs3217112)、InDel-38(rs67426579)、InDel-39(rs151335218)、InDel-40(rs142221201)、InDel-41(rs34209360)、InDel-42(rs67700747)、InDel-43(rs67365630)、InDel-44(rs35464887)、InDel-45(rs5897566)、InDel-46(rs35267904)、InDel-47(rs67405073)、InDel-48(rs199815934)、InDel-49(rs76041101)，性別鑒定基因?yàn)锳melogenin；其中括號中的rs號表示該位點(diǎn)在dbSNP數(shù)據(jù)庫中的編號。上述InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)的篩選原則如下：應(yīng)用VCFtools等生物信息分析軟件，分析1000GenomesProject和其它遺傳信息數(shù)據(jù)庫中的人類基因組遺傳變異數(shù)據(jù)，篩選在東亞人群中多態(tài)性高的100個左右常染色體InDel、10個左右Y染色體InDel作為候選位點(diǎn)。建立單位點(diǎn)檢測體系，使用候選InDel位點(diǎn)分別在10～20個漢族樣本中進(jìn)行分型，進(jìn)一步篩選出單位點(diǎn)檢驗(yàn)中多態(tài)性高、檢驗(yàn)效果好的47個常染色體InDel位點(diǎn)、2個Y-InDel位點(diǎn)。其中最終篩選到的InDel位點(diǎn)必須符合：1、最低等位基因頻率(MAF)0.3-0.5之間，對應(yīng)的理論平均雜合度(HET)在0.4以上；2、Hardy—Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)p>0.05；3、intron區(qū)域的位點(diǎn)；4、InDel等位基因片段長度差異(插入或缺失的堿基)在3-6bp；5、分散在不同的染色體上且距離在5M以上；6、hg38版基因組以及DBsnp147-common中能找到的位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述特異性擴(kuò)增引物的序列如下：InDel-01、SEQIDNO.1-2；InDel-02、SEQIDNO.3-4；InDel-03、SEQIDNO.5-6；InDel-04、SEQIDNO.7-8；InDel-05、SEQIDNO.9-10；InDel-06、SEQIDNO.11-12；InDel-07、SEQIDNO.13-14；InDel-08、SEQIDNO.15-16；InDel-09、SEQIDNO.17-18；InDel-10、SEQIDNO.19-20；InDel-11、SEQIDNO.21-22；InDel-12、SEQIDNO.23-24；InDel-13、SEQIDNO.25-26；InDel-14、SEQIDNO.27-28；InDel-15、SEQIDNO.29-30；InDel-16、SEQIDNO.31-32；InDel-17、SEQIDNO.33-34；InDel-18、SEQIDNO.35-36；InDel-19、SEQIDNO.37-38；InDel-20、SEQIDNO.39-40；InDel-21、SEQIDNO.41-42；InDel-22、SEQIDNO.43-44；InDel-23、SEQIDNO.45-46；InDel-24、SEQIDNO.47-48；InDel-25、SEQIDNO.49-50；InDel-26、SEQIDNO.51-52；InDel-27、SEQIDNO.53-54；InDel-28、SEQIDNO.55-56；InDel-29、SEQIDNO.57-58；InDel-30、SEQIDNO.59-60；InDel-31、SEQIDNO.61-62；InDel-32、SEQIDNO.63-64；InDel-33、SEQIDNO.65-66；InDel-34、SEQIDNO.67-68；InDel-35、SEQIDNO.69-70；InDel-36、SEQIDNO.71-72；InDel-37、SEQIDNO.73-74；InDel-38、SEQIDNO.75-76；InDel-39、SEQIDNO.77-78；InDel-40、SEQIDNO.79-80；InDel-41、SEQIDNO.81-82；InDel-42、SEQIDNO.83-84；InDel-43、SEQIDNO.85-86；InDel-44、SEQIDNO.87-88；InDel-45、SEQIDNO.89-90；InDel-46、SEQIDNO.91-92；InDel-47、SEQIDNO.93-94；InDel-48、SEQIDNO.95-96；InDel-49、SEQIDNO.97-98；Amelogenin、SEQIDNO.99～100。優(yōu)選的，所述特異性擴(kuò)增引物的濃度如下：InDel-01、0.08μM；InDel-02、0.1μM；InDel-03、0.07μM；InDel-04、0.06μM；InDel-05、0.12μM；InDel-06、0.09μM；InDel-07、0.07μM；InDel-08、0.07μM；InDel-09、0.11μM；InDel-10、0.09μM；InDel-11、0.08μM；InDel-12、0.05μM；InDel-13、0.07μM；InDel-14、0.08μM；InDel-15、0.12μM；InDel-16、0.11μM；InDel-17、0.1μM；InDel-18、0.06μM；InDel-19、0.07μM；InDel-20、0.11μM；InDel-21、0.08μM；InDel-22、0.06μM；InDel-23、0.07μM；InDel-24、0.12μM；InDel-25、0.11μM；InDel-26、0.06μM；InDel-27、0.08μM；InDel-28、0.08μM；InDel-29、0.07μM；InDel-30、0.09μM；InDel-31、0.05μM；InDel-32、0.06μM；InDel-33、0.12μM；InDel-34、0.08μM；InDel-35、0.09μM；InDel-36、0.07μM；InDel-37、0.11μM；InDel-38、0.1μM；InDel-39、0.05μM；InDel-40、0.06μM；InDel-41、0.13μM；InDel-42、0.09μM；InDel-43、0.08μM；InDel-44、0.07μM；InDel-45、0.05μM；InDel-46、0.06μM；InDel-47、0.1μM；InDel-48、0.11μM；InDel-49、0.09μM；Amelogenin、0.13μM。所述試劑盒中的引物及其序列和濃度如下表所示：優(yōu)選的，所述特異性擴(kuò)增引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度均小于200bp。優(yōu)選的，所述特異性擴(kuò)增引物分為五組：第一組，InDel-04、InDel-07、InDel-12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；第二組，InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；第三組，InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；第四組，InDel-06、InDel-14、InDel-20、InDel-25、InDel-33、InDel-39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；第五組：InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49；每對引物中至少一條采用熒光染料標(biāo)記其5’端。優(yōu)選的，所述熒光染料為6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG中任意一種，且每組采用的熒光標(biāo)記不同。進(jìn)一步的，所述特異性擴(kuò)增引物分組及標(biāo)記如下：熒光染料為6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG；其中6-FAM標(biāo)記InDel-04、InDel-07、InDel-12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；HEX標(biāo)記InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；TAMRA標(biāo)記InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；ROX標(biāo)記InDel-06、InDel-14、InDel-20、InDel-25、InDel-33、InDel-39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；VIG標(biāo)記InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49。所述試劑盒中含有分子量內(nèi)標(biāo)，且分子量內(nèi)標(biāo)由橙色熒光SIZ標(biāo)記。優(yōu)選的，所述試劑盒包括2.5×ReactionMix，2mL；基因組DNA，10ng；5×引物混合物，1mL；5U/μL的熱啟動Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的2.5×ReactionMix成分為：7.5mMMgCl2，125mMTris-HCl(pH8.3)，125mMKCl,7.5mMdNTPs,2mg/mLBSA，1％PCR增強(qiáng)劑。所述的人類常染色體和Y染色體InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒在人類個體識別、親權(quán)鑒定以及降解檢材識別中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述應(yīng)用的程序?yàn)椴捎镁酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增InDel位點(diǎn)，并通過毛細(xì)管電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。有益效果：(1)本發(fā)明包含49個分型較均衡的InDel位點(diǎn)和1個性別鑒定基因，采用六色STR熒光檢測系統(tǒng)，高于目前已經(jīng)公開的法醫(yī)InDel檢測試劑盒；(2)本發(fā)明包含的49個InDel位點(diǎn)篩選自我國主要民族群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，適用于中國人群的檢測；(3)本發(fā)明建立的50個位點(diǎn)的擴(kuò)增體系，擴(kuò)增片段短，擴(kuò)增子控制在200bp，適用于高度降解檢材的InDel分型；(4)本發(fā)明建立的50個位點(diǎn)的擴(kuò)增體系，提高了降解檢材中位點(diǎn)的檢出數(shù)目；(5)本發(fā)明所述的體系中引入的2個Y-InDel位點(diǎn)，能夠?qū)π詣e鑒定基因Amelogenin起到輔助判定的作用。附圖說明圖1是由血液濾紙收集的血液樣本InDel位點(diǎn)分型圖；圖2是陳舊骨骼樣本InDel位點(diǎn)分型圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1一種人類常染色體和Y染色體InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，所述試劑盒包含47對常染色體InDel位點(diǎn)基因座的特異性擴(kuò)增引物、2對Y染色體InDel位點(diǎn)基因座的特異性擴(kuò)增引物以及1對性別鑒定基因的特異性擴(kuò)增引物；所述InDel位點(diǎn)基因座為：InDel-01(rs3067397)、InDel-02(rs10607699)、InDel-03(rs71852971)、InDel-04(rs67487831)、InDel-05(rs140683187)、InDel-06(rs5787309)、InDel-07(rs34287950)、InDel-08(rs67100350)、InDel-09(rs769299)、InDel-10(rs3076465)、InDel-11(rs67939200)、InDel-12(rs145941537)、InDel-13(rs67264216)、InDel-14(rs35453727)、InDel-15(rs35065898)、InDel-16(rs60575667)、InDel-17(rs66911131)、InDel-18(rs61490765)、InDel-19(rs34419736)、InDel-20(rs34421865)、InDel-21(rs66739142)、InDel-22(rs3029189)、InDel-23(rs33971783)、InDel-24(rs72085595)、InDel-25(rs34529638)、InDel-26(rs11277697)、InDel-27(rs10558392)、InDel-28(rs538690481)、InDel-29(rs140323077)、InDel-30(rs66477007)、InDel-31(rs3834231)、InDel-32(rs145577149)、InDel-33(rs35309403)、InDel-34(rs66595817)、InDel-35(rs1160980)、InDel-36(rs79225518)、InDel-37(rs3217112)、InDel-38(rs67426579)、InDel-39(rs151335218)、InDel-40(rs142221201)、InDel-41(rs34209360)、InDel-42(rs67700747)、InDel-43(rs67365630)、InDel-44(rs35464887)、InDel-45(rs5897566)、InDel-46(rs35267904)、InDel-47(rs67405073)、InDel-48(rs199815934)、InDel-49(rs76041101)，性別鑒定基因?yàn)锳melogenin；其中括號中的rs號表示該位點(diǎn)在dbSNP數(shù)據(jù)庫中的編號。上述InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)的篩選原則如下：應(yīng)用VCFtools等生物信息分析軟件，分析1000GenomesProject和其它遺傳信息數(shù)據(jù)庫中的人類基因組遺傳變異數(shù)據(jù)，篩選在東亞人群中多態(tài)性高的100個左右常染色體InDel、10個左右Y染色體InDel作為候選位點(diǎn)。建立單位點(diǎn)檢測體系，使用候選InDel位點(diǎn)分別在10～20個漢族樣本中進(jìn)行分型，進(jìn)一步篩選出單位點(diǎn)檢驗(yàn)中多態(tài)性高、檢驗(yàn)效果好的47個常染色體InDel位點(diǎn)、2個Y-InDel位點(diǎn)。其中最終篩選到的InDel位點(diǎn)必須符合：1、最低等位基因頻率(MAF)0.3-0.5之間，對應(yīng)的理論平均雜合度(HET)在0.4以上；2、Hardy—Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)p>0.05；3、intron區(qū)域的位點(diǎn)；4、InDel等位基因片段長度差異(插入或缺失的堿基)在3-6bp；5、分散在不同的染色體上且距離在5M以上；6、hg38版基因組以及DBsnp147-common中能找到的位點(diǎn)。所述特異性擴(kuò)增引物的序列如下：InDel-01、SEQIDNO.1-2；InDel-02、SEQIDNO.3-4；InDel-03、SEQIDNO.5-6；InDel-04、SEQIDNO.7-8；InDel-05、SEQIDNO.9-10；InDel-06、SEQIDNO.11-12；InDel-07、SEQIDNO.13-14；InDel-08、SEQIDNO.15-16；InDel-09、SEQIDNO.17-18；InDel-10、SEQIDNO.19-20；InDel-11、SEQIDNO.21-22；InDel-12、SEQIDNO.23-24；InDel-13、SEQIDNO.25-26；InDel-14、SEQIDNO.27-28；InDel-15、SEQIDNO.29-30；InDel-16、SEQIDNO.31-32；InDel-17、SEQIDNO.33-34；InDel-18、SEQIDNO.35-36；InDel-19、SEQIDNO.37-38；InDel-20、SEQIDNO.39-40；InDel-21、SEQIDNO.41-42；InDel-22、SEQIDNO.43-44；InDel-23、SEQIDNO.45-46；InDel-24、SEQIDNO.47-48；InDel-25、SEQIDNO.49-50；InDel-26、SEQIDNO.51-52；InDel-27、SEQIDNO.53-54；InDel-28、SEQIDNO.55-56；InDel-29、SEQIDNO.57-58；InDel-30、SEQIDNO.59-60；InDel-31、SEQIDNO.61-62；InDel-32、SEQIDNO.63-64；InDel-33、SEQIDNO.65-66；InDel-34、SEQIDNO.67-68；InDel-35、SEQIDNO.69-70；InDel-36、SEQIDNO.71-72；InDel-37、SEQIDNO.73-74；InDel-38、SEQIDNO.75-76；InDel-39、SEQIDNO.77-78；InDel-40、SEQIDNO.79-80；InDel-41、SEQIDNO.81-82；InDel-42、SEQIDNO.83-84；InDel-43、SEQIDNO.85-86；InDel-44、SEQIDNO.87-88；InDel-45、SEQIDNO.89-90；InDel-46、SEQIDNO.91-92；InDel-47、SEQIDNO.93-94；InDel-48、SEQIDNO.95-96；InDel-49、SEQIDNO.97-98；Amelogenin、SEQIDNO.99～100。所述特異性擴(kuò)增引物的濃度如下：InDel-01、0.08μM；InDel-02、0.1μM；InDel-03、0.07μM；InDel-04、0.06μM；InDel-05、0.12μM；InDel-06、0.09μM；InDel-07、0.07μM；InDel-08、0.07μM；InDel-09、0.11μM；InDel-10、0.09μM；InDel-11、0.08μM；InDel-12、0.05μM；InDel-13、0.07μM；InDel-14、0.08μM；InDel-15、0.12μM；InDel-16、0.11μM；InDel-17、0.1μM；InDel-18、0.06μM；InDel-19、0.07μM；InDel-20、0.11μM；InDel-21、0.08μM；InDel-22、0.06μM；InDel-23、0.07μM；InDel-24、0.12μM；InDel-25、0.11μM；InDel-26、0.06μM；InDel-27、0.08μM；InDel-28、0.08μM；InDel-29、0.07μM；InDel-30、0.09μM；InDel-31、0.05μM；InDel-32、0.06μM；InDel-33、0.12μM；InDel-34、0.08μM；InDel-35、0.09μM；InDel-36、0.07μM；InDel-37、0.11μM；InDel-38、0.1μM；InDel-39、0.05μM；InDel-40、0.06μM；InDel-41、0.13μM；InDel-42、0.09μM；InDel-43、0.08μM；InDel-44、0.07μM；InDel-45、0.05μM；InDel-46、0.06μM；InDel-47、0.1μM；InDel-48、0.11μM；InDel-49、0.09μM；Amelogenin、0.13μM。所述試劑盒中的引物及其序列和濃度如下表所示：所述特異性擴(kuò)增引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度均小于200bp。所述特異性擴(kuò)增引物分組及標(biāo)記如下：熒光染料為6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG；其中6-FAM標(biāo)記InDel-04、InDel-07、InDel-12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；HEX標(biāo)記InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；TAMRA標(biāo)記InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；ROX標(biāo)記InDel-06、InDel-14、InDel-20、InDel-25、InDel-33、InDel-39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；VIG標(biāo)記InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49。所述試劑盒中含有分子量內(nèi)標(biāo)，且分子量內(nèi)標(biāo)由橙色熒光SIZ標(biāo)記。所述試劑盒包括2.5×ReactionMix，2mL；基因組DNA，10ng；5×引物混合物，1mL；5U/μL的熱啟動Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的2.5×ReactionMix成分為：7.5mMMgCl2，125mMTris-HCl(pH8.3)，125mMKCl,7.5mMdNTPs,2mg/mLBSA，1％PCR增強(qiáng)劑。PCR增強(qiáng)劑為海藻糖、濃度低于5％的聚乙二醇、二甲壓砜、NP40中的一種。將上述試劑盒用于檢測由血液濾紙收集的血跡樣本，操作步驟如下：擴(kuò)增體系：組分體積ReactionMix4.0μL1.0mm孔徑紙片1片引物2.0μL熱啟動Taq酶0.4μLsdH2O補(bǔ)足至10.0μL擴(kuò)增程序：擴(kuò)增產(chǎn)物在遺傳分析儀上熒光檢測：由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子量內(nèi)標(biāo)AGCUMarkerSIZ-500組成上樣混合物〔(0.5μlAGCUMarkerSIZ-500(無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司))×(進(jìn)樣數(shù))+(12μl去離子甲酰胺)×(進(jìn)樣數(shù))〕。將12.5μl上樣混合物與本試劑盒中1μl擴(kuò)增產(chǎn)物混合，避免產(chǎn)生氣泡。95℃變性3分鐘，冰浴3分鐘，并盡快電泳；用遺傳分析儀檢測分析。分型分析：用片段分析軟件GeneMapperIDX分析遺傳分析儀檢測收集的數(shù)據(jù)。結(jié)論：應(yīng)用本實(shí)施例所述試劑盒對常用建庫檢材樣本共計(jì)50份。試劑盒的檢出率是100％。如圖1所示的某血濾紙收集的血跡樣本InDel位點(diǎn)分型。實(shí)施例2采用實(shí)施例1所述的試劑盒檢測陳舊骨骼樣本。擴(kuò)增體系：其中，DNA樣本的提取參考《GA/T383-2002法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》進(jìn)行，此類樣本均由磁珠法提取。擴(kuò)增程序：擴(kuò)增產(chǎn)物在遺傳分析儀上熒光檢測：由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子量內(nèi)標(biāo)AGCUMarkerSIZ-500組成上樣混合物〔(0.5μlAGCUMarkerSIZ-500(無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司))×(進(jìn)樣數(shù))+(12μl去離子甲酰胺)×(進(jìn)樣數(shù))〕。將12.5μl上樣混合物與本試劑盒中1μl擴(kuò)增產(chǎn)物混合，避免產(chǎn)生氣泡。95℃變性3分鐘，冰浴3分鐘，并盡快電泳；用遺傳分析儀檢測分析。分型分析：用片段分析軟件GeneMapperIDX分析遺傳分析儀檢測收集的數(shù)據(jù)。結(jié)論：應(yīng)用本發(fā)明所述試劑盒對實(shí)際案件降解檢材樣本共計(jì)13份。試劑盒的檢出率是61.5％。本發(fā)明所述試劑盒由于擴(kuò)增片段更短，在降解的檢材中表現(xiàn)較好，如圖2所示的陳舊骨骼樣本。SEQUENCELISTING<110>無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司<120>一種人類常染色體和Y染色體InDel遺傳多態(tài)性位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用<130><160>100<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1aagtagatagccaggggcca20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tgcttcactccatccaggattt22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3atcagtgaaaacttggagggt21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4aaagcaggcaaggagctagg20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5atatccaaggactcaaaacattctc25<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6acagccactaccaataactgct22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7gtagcccagcctaaagacaca21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8ctcaaaacaaacaaacaaaca21<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9acacaatgctctaggacttgga22<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10tggaatcatagaccctcacct21<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11cataataataacttgtctatgtccc25<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>12ttcccaatcttccagtggtctcc23<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>13tattttgggaaaagccaatggaga24<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>14atatctcccaagggccatctgt22<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>15gatgcccagaacccaccataggg23<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>16tttttgaatgaagcgagaactaa23<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>17tcctatgcaagttgtttacagtgtt25<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>18actaaagcatatttgggaggatgt24<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>19gttttgctgtcacttattcgtgt23<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>20tcctcacatgttatttttcttggac25<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21agagtggactctgtgcttgc20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22ttagtgcctgcagtgccttc20<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23agctcattagagccacagacac22<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>24agcaagcaggcttagaaagttttag25<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>25agggtgtggagaaacaggagaca23<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>26caaagtgctgggattgcaggcgt23<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>27cctggattaccatcacgtctg21<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>28cttttcactgaagtgggccatc22<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>29tgtcagaattcaaatccccaatgtt25<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>30atgtctaggaaggcactctgttg23<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31gtcctctcttggttctgggc20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>32tggattttggagatgggggt20<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>33agtcctttgtcagcatctcaa21<210>34<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>34tgtaacaaaagaatgcaaggaaatc25<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>35aatgtcattttagcaagatgaggc24<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>36agccagtgtacgttattcccat22<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>37cctacctgcctctgagtcct20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>38tgcagaagcatctctggagc20<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>39catcttgttaagttcccctgcc22<210>40<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>40gatattgggtgggtggtactct22<210>41<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>41tgcacaactactggcttactgg22<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>42tcagtcctgagttattcagcgt22<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>43ggaggacaaagcatggcaatc21<210>44<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>44ctctggccaagaaactgatccc22<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>45acagttccagcagaccatca20<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>46gcgactcatgacaaagtccatt22<210>47<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>47gtagtgggaagatggccacataaag25<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>48aaccacaggtcttggtgcttat22<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>49agcatatcatttgcataacccaca24<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>50tccaacagcgctcatagtgg20<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>51gttctgtaggatctcaggcaca22<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>52taatgaaggtcaatgaagacgcat24<210>53<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>53gacatccacctagaggttccag22<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>54atccaggccaaactttccttttac24<210>55<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>55ccaaatgtctgaagtccacca21<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>56ggctgtgctgactctggttt20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>57ccccctggtgacaagaagac20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>58ttttcctcccacagtggctc20<210>59<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>59agcttgctaaccctcaaagtga22<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>60tatggactgcctggatggga20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>61agggctctgggaaatttggg20<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>62gctatagctctgggccttgg20<210>63<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>63aagacttcatacaagacacaatc23<210>64<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>64aaatatactttttggtgcatagg23<210>65<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>65tgtacaccttaagtatccctcct23<210>66<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>66agcctgaaataggccatgagtaa23<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>67gtagttcctcacatgccccc20<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>68ctccgtgatcaaggtgtgct20<210>69<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>69tcctactctgactcctagcttgt23<210>70<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>70aattatttgaatgtattccttta23<210>71<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>71agatgggtttgcaaagtgaaaagt24<210>72<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>72tttgctgttactggttacatcttct25<210>73<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>73ctggccgcaagaccaaataac21<210>74<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>74ttgagatcataaaggccgacaa22<210>75<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>75ttttaagcattgacaagccacca23<210>76<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>76cctggtattcatgacgctcc20<210>77<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>77attgtctagccagggcccatt21<210>78<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>78tccactccacttctctagggtcta24<210>79<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>79tgcaaaactcggatgtacgtt21<210>80<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>80agtggaaatgccacaattagga22<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>81ttaagcatctctatgccccga21<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>82gctcatttgcctaagtgggg20<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>83ctctgtcacatctgccctgg20<210>84<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>84gacctgagatcccacacagc20<210>85<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>85ctgaagatgtgacaaccgactg22<210>86<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>86cccttcacataggctcaggtc21<210>87<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>87gagaactacatgtacccggctt22<210>88<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>88tccattagctccattcaagggtaa24<210>89<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>89aagtctcctggttgggttaag21<210>90<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>90atcagaacagctgctacttgc21<210>91<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>91tggactctactcaagaccttcca23<210>92<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>92gacatttggccacagaaccg20<210>93<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>93tccaaaggatgtgagacctaaat23<210>94<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>94cctgtacaactgtacatggcaac23<210>95<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>95agtacccaaatcaactcaactcca24<210>96<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>96ccatgtactttgtccaatgctg22<210>97<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>97accagaatgctgtttatcctct22<210>98<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>98ttctaacacaccaatgaagccaaat25<210>99<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>99tgtgttgattctttatcccag21<210>100<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>100gacacaggcttgaggccaacc21當(dāng)前第1頁1 2 3