本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，尤其是涉及與黃瓜ZYMV抗性基因共分離的InDel分子標記。

背景技術(shù)：

黃瓜(Cucumis sativus L.)為葫蘆科(Cucurbitaceae)一年生草本蔓生攀緣植物。原產(chǎn)喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)，我國已有2000多年的栽培歷史，是黃瓜的次生起源中心。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一，其作為重要的蔬菜作物歷來備受育種家的重視。

近年，ZYMV(Zucchini Yellow Mosaic Virus，黃瓜小西葫蘆黃化花葉病毒)對黃瓜危害愈發(fā)嚴重，黃瓜感染ZYMV后，葉片出現(xiàn)黃化、花葉，葉片表面有瘤狀突起，發(fā)病嚴重時葉片皺縮、畸形，植株矮化，甚至死亡，影響了植株的生長發(fā)育，降低了黃瓜果實的產(chǎn)量與品質(zhì)。ZYMV的防治主要是對其傳播媒介的防治，植物一旦感染ZYMV，目前尚沒有有效的藥劑可以治理，因此，要從根本上解決這些問題，需要培育優(yōu)質(zhì)抗病黃瓜新品種，以滿足種植者和消費者的需求。

常規(guī)的抗性育種費時費力，需要經(jīng)歷多代回交和雜交的過程；病害發(fā)生需要專門的病圃進行接種鑒定，且受環(huán)境影響較大；黃瓜ZYMV抗性由一對隱性基因控制，回交育種過程中需要每代自交以確認隱性抗性的滲入；這些都增加了培育黃瓜抗病品種的難度。分子育種可以大大加速抗病育種進程，顯著縮短育種周期。現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，為抗病育種開辟了新的途徑，利用生物技術(shù)培育抗病品種已成為目前的熱點。分子育種的前提是獲得相關(guān)性狀的功能基因或與其緊密連鎖的分子標記。利用分子標記分析體系，在遺傳群體上鑒定抗病遺傳規(guī)律，定位和克隆ZYMV抗性基因，研究其功能和抗性的分子調(diào)控機制，可以為黃瓜抗性基因的分子標記輔助育種及分子設計育種提供理論依據(jù)。利用與抗病基因緊密連鎖或共分離的分子標記，開展分子標記輔助選擇育種，可將多個抗病基因整合到一個品種，顯著提高育種效率，縮短育種時間，而且大幅度提高了抗病的力度和持久性，這對于培育出滿足種植者需求的黃瓜抗病新品種具有重要意義。

ZYMV擁有較長的研究歷史，1973年，Lisa等首次從西葫蘆上分離并描述了ZYMV，可通過蚜蟲進行非持久性傳播，隨后Provvidenti等人的研究表明，黃瓜的ZYMV抗性由一對隱性基因zym/zym控制。2013年，Amano等以感ZYMV黃瓜自交系‘CS-PMR1’和抗ZYMV黃瓜自交系‘A192-18’為親本構(gòu)建F₂群體，將zym^A192-18定位于黃瓜六號染色體50kb的區(qū)間內(nèi)，其中包含六個候選基因，在親本間對候選基因的分析結(jié)果表明，Vacuolar protein sorting-associated protein 4-like(VPS4-like)基因(Csa6M152960.1)為最有可能的候選基因，兩個親本間在該基因的第一外顯子處存在兩個堿基多態(tài)性，該基因可能與病毒的復制和在細胞間的移動相關(guān)。

上述研究表明，黃瓜ZYMV抗性是單個隱性基因控制，目前已獲得的某些連鎖標記遺傳距離較遠或者不適用于大規(guī)模群體篩選，不利于分子標記輔助育種的開展。因此，尋找與黃瓜ZYMV抗性基因緊密連鎖、共分離的分子標記，為其抗病分子育種提供良好的技術(shù)支撐。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了提供一種基于黃瓜ZYMV抗性候選基因開發(fā)的與黃瓜ZYMV抗性基因共分離的新型InDel分子標記，此標記利用聚丙烯酰胺凝膠電泳可以清晰地顯示出差異，方便應用于ZYMV抗性分子輔助育種。

本發(fā)明通過對ZYMV抗感黃瓜材料的抗性候選基因測序發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)抗病材料中的一個63bp的插入，利用此插入/缺失突變，我們開發(fā)了一個與黃瓜ZYMV抗性基因共分離的InDel分子標記，以便分子標記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分子標記可簡便、快速、高通量地應用于育種實踐。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一個與黃瓜ZYMV抗性基因共分離的新型InDel分子標記，命名為InDel-zym2，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段組成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段與抗病基因共分離，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段與感病基因共分離。

所述InDel-zym2由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物擴增得到。

所述抗病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述感病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

由候選基因在多個黃瓜抗病自交系中測序得到SEQ ID NO.5所示序列，由候選基因在多個黃瓜感病自交系中測序得到SEQ ID NO.6所示序列；兩者之間存在一個63bp的插入/缺失突變，根據(jù)此插入/缺失突變，可以設計多個諸如InDel-zym2與ZYMV抗性共分離的共顯性InDel分子標記。

上述SEQ ID NO.1為InDel-zym2在抗病親本擴增的序列，由119個核苷酸組成；SEQ ID NO.2為InDel-zym2在感病親本擴增的序列，由182個核苷酸組成。經(jīng)過多個抗病、感病自交系的分子檢測分析，抗病自交系均擴增出119bp大小的條帶，而感病自交系均擴增出182bp大小的條帶。通過回交分離群體分析，此標記與ZYMV抗性基因共分離。因此，此共顯性的InDel標記有利于ZYMV抗性育種的分子標記輔助體系的建立，可簡便、快速、高通量地應用于育種實踐。

上述上游引物和下游引物由上海華津生物科技有限公司合成，合成方法為常規(guī)生物學方法。

傳統(tǒng)的抗性育種費時費力，需要通過多代回交和雜交的過程。病害發(fā)生需要專門的病圃進行接種鑒定，且受環(huán)境影響較大。黃瓜ZYMV抗性由單一隱性基因控制，回交育種過程中需要每代自交以確認隱性抗性的滲入。這些因素都增加了ZYMV抗性育種的周期和難度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的共分離InDel分子標記為共顯性，能夠區(qū)分純合子和雜合子，在黃瓜苗期即可鑒定植株的基因型，省去了回交滲入過程中每代自交的步驟；此InDel標記條帶差異大，用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳即可清晰地區(qū)分基因型，用它來跟蹤抗性基因，既準確又省時省力，可用于黃瓜ZYMV抗性的分子標記輔助育種，加速黃瓜ZYMV抗性育種的進程。

附圖說明

圖1是分子標記InDel-zym2在不同的抗、感自交系的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果?？共∽越幌刀紴?19bp大小的條帶，感病自交系都為182bp大小的條帶。

圖2是分子標記InDel-zym2在回交分離群體的瓊脂糖凝膠電泳效果。圖中所示，SA0422為感病親本，TMG-1為抗病親本，F(xiàn)₁代表雜交一代；R和S分別代表回交分離群體中隨機挑選的抗病和感病植株的檢測結(jié)果；M代表Marker。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例

一、基于黃瓜ZYMV抗性候選基因的InDel標記的開發(fā)與鑒定

1、多個抗、感自交系的驗證

由候選基因在多個黃瓜抗病自交系中測序得到SEQ ID NO.5所示序列，由候選基因在多個黃瓜感病自交系中測序得到SEQ ID NO.6所示序列；兩者之間存在一個63bp的插入/缺失突變，據(jù)此突變，本發(fā)明利用Primer 5.0引物設計軟件在突變的兩側(cè)設計正反向引物。上游引物為SEQ ID NO.3所示，下游引物為SEQ ID NO.4所示，抗性材料的擴增條帶為119bp，感病材料的擴增條帶為182bp，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳可以快速區(qū)分所用材料的基因型。根據(jù)此原則，本發(fā)明經(jīng)上游引物與下游引物擴增得到與黃瓜ZYMV抗性基因共分離的InDel分子標記，命名為InDel-zym2，InDel-zym2由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段組成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段與抗病基因共分離，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段與感病基因共分離。

使用TaKaRa公司的Taq DNA Polymerase進行PCR擴增，PCR反應體系為10μL體系。擴增程序為：98℃預變性5min；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，32個循環(huán)；4℃保存。擴增后的產(chǎn)物使用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR結(jié)果。

利用此InDel標記技術(shù)，我們對多個抗、感自交系進行了電泳分析驗證。其中抗病自交系有：SA02、SA06、S94、S1003、WI7230、TMG-1，共6個抗病黃瓜自交系；感病自交系有：SA03、SA04、SA05、SA07、SA08、SA09、夏美侖、S52、S05、PI197088、S06、SA0422，共12個感病黃瓜自交系。結(jié)果顯示，在抗病自交系中擴增出119bp的片段，而感病自交系擴增出182bp的片段，結(jié)果參見圖1，圖1中，1：TMG-1，2：SA0422，3：F1(TMG-1×SA0422)，4：SA02，5：SA03，6：SA04，7：SA05，8：SA06，9：SA07，10：SA08，11：SA09，12：S94，13：WI7230，14：PI197088，15：S1003，16：S06，17：S05，18：S52，19：夏美侖。因此，這個InDel標記可以用來篩選不同的抗、感品種。

2、群體共分離驗證

為了證明InDel標記InDel-zym2是否與ZYMV抗性基因存在連鎖關(guān)系，本發(fā)明利用130株的回交分離群體對此標記進行了群體連鎖分析驗證。結(jié)果顯示，在群體中與抗病親本有一致帶型的單株表現(xiàn)為抗病，與感病親本有一致帶型的植株為感病，雜合帶型的植株也為感病(參見圖2)。此結(jié)果說明：此標記為共顯性標記，能夠區(qū)分純合子和雜合子；標記與ZYMV抗性共分離。

如圖2所示，電泳條帶清晰穩(wěn)定，用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳可顯示出片段差異。所以，此InDel標記具有穩(wěn)定、快速和使用方便的優(yōu)點，同時可以清晰地區(qū)分純合子和雜合子。本發(fā)明的分子標記可應用于黃瓜苗期ZYMV抗、感單株的輔助篩選，為ZYMV抗性的分子標記輔助育種奠定了基礎，這將大大加快黃瓜ZYMV抗性分子育種的進程。

上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110> 上海交通大學

<120>與黃瓜ZYMV抗性基因共分離的新型InDel分子標記

<160> 6

<210> 1

<211> 119

<212> DNA

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 1

gtcacaagtg cgtgattccg taggaaggaa caactttacc ttatttaaag aatagttcat 60

ccaagtgtgt ttttatttaa ttttctctca gagaaacaga aaactgattt agcattggt 119

<210> 2

<211> 182

<212> DNA

<213> 黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 2

gtcacaagtg cgtgattccg taggaaggaa caactttacc ttatttaaag aatagttcat 60

ccacgagagg aaagtgaaca agaaaacaaa agaaaacaaa atcataaaaa tagttatcta 120

aatccaagtg tgtttttatt taattttctc tcagagaaac agaaaactga tttagcattg 180

gt 182

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

gtcacaagtg cgtgattccg 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400>4

accaatgcta aatcagtttt ctgt 24

<210> 5

<211> 4774

<212> DNA

<213>黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 5

atgtatagca atttcaagga gcaagctatt gaatacgtga agcaggcggt acatgaagat 60

aatgctggca attacgcaaa agcctctccg ctgtatataa acgccttgga gtacttcaaa 120

actcatttga agtatgagaa aaatcccaag atcaaggaag ctattaccca gaaattcacc 180

gagtatttgc gccgggctga ggagatacgt gctgttttgg atgatggcgg tcctggtccg 240

gcttccaatg gagatgcagc tgttgcaact aaacccaaga cgaaacctaa ggatggagaa 300

ggaggagatg gagaggatcc agaacaggct aagttacggg ctggtcttaa ttccgcaatc 360

ataagggaga aaccggatgt taagtggaac gatgttgctg gattggagag cgccaagcag 420

gcgttgcaag aggctgtaat attacccgtt aagttccccc agttctttac tggttagttc 480

cattttgctt ctttcgatct actaccgtat tgatttttgt tgtctcatgt cagtacagtt 540

gtgttccccc tttgagctga gattttcttc atttcacgtt tcagtttgat tagatcatta 600

gatgtgtagt gattacaatt atattctagt ttaattataa tggtagtgat tacaattata 660

ttctagttta attataatgg tgcttacttt ttaaataaaa tcatgtcaaa gataattgtc 720

tacctttctt taggtaagag gcgaccatgg cgagctttct tgttatatgg gcctcctgga 780

actggaaagt catacttggc aaaggctgtt gcgacagagg ctgactcgac atttttcagg 840

taacgatcct ctgaggtttg agtatatgaa cttgtcttgt gtgatttgta tggtagccat 900

atatttctta actttcctag ccattatctt ttaacgtgcc tgtgtgagca acttacaacc 960

cttgagttct catgaaactt tttttatgtc atcaacaaca ttcatgaact ctgtgttgtt 1020

ttctttattc ttatgaaatt gcagcaagta tgaacaatat cattttaaag tggtgtctct 1080

aattaaatat ttttcatgca ttagagttga ggatattagg aattattagc agatatggcc 1140

gtagggaatt tcattttcta aatgttctat ttaaccattt ctcaagattt aatgattcga 1200

agttagatgg cctgttgctc tactgcttta tgggaggtct cctaggcctt cattcatttt 1260

gttggtatag tgtaatttgt tgtcgtcatt gcaattcttt tgttctattt tgttcattta 1320

ttaattcttg aatttggtgg gctttaaatc ttgtttctat agaagaacaa taatggagat 1380

atttgttgat tactcttaag agttttagat ggttagattg gaccatctgt ttgtttggca 1440

ggaaacttaa gaggaacata tgactaaagg taaaggtaag tgctgaagcc ggaagtttaa 1500

tataatttat aaacggtttg gcaaagtagc aattttaatt cagaagatgc atttgtgtca 1560

cattttaagt ggtacaagtg caacctaccc tttctttttc tctggataag caaaagacaa 1620

caaatgctat tgaatctttt cttctacaat ttttatagta aaaaacttat atccttttct 1680

gggtgtggcc tttgagacat tgaaataaga aatccctaga ttcaaattgt gatcttccat 1740

tttttacttg cttcttgaac ttattacggt tcttggcttt gaaaaaaatt tgaggaatac 1800

agtaagctat ctttttaata atttacttta ttgaaataaa gttcaaatgc ctttggtggc 1860

tatggacagt atgaactcat tgagtggcct caagtggata taaagtgcgg aatgcaaaaa 1920

ctcaaatgac ttacaaaata tttccaactt ttggttgtaa aaaaataaac gacagatata 1980

aaaacaagtt ttggttatcc attttctttg ctttcattcc catcctattc aattacaggg 2040

catacccaca ccacattcta tttggatact tttggcggtt gtttgaatgt gtttttaatt 2100

atcagtaagc tctatttgct gtttcctgcc acttgcttta aattgagtat tcttttccat 2160

tttctgttga tagcatttct tcttcggacc ttgtctcgaa atggatgggt gaaagcgaga 2220

agctagtttc aaatcttttt caaatggctc gtgatagcgc gccttctatc atctttattg 2280

atgaaataga ttcgttgtgt ggtcaacgag gtgaaggtaa tgaaagtgaa gcttcaagac 2340

gcattaagac tgaacttctt gtgcaaatgc aggtattgtt tgtttgtagt gtaaaagcgt 2400

gaatattttg tgtaccaaag aaaggttgtt gattattatt attatatatg cgtcctttgc 2460

tcatttcatt gtcttgagaa tgctcatttt cagaaaatat ctcattgctg ctgatctaca 2520

tccaagtgtt tttcagccag ttgaaagttg acttaaatta tatctatagg gttttctgat 2580

agtctaatta cttgtttcta tgattctacc catctatttg ggctttaact gcttaaataa 2640

agctttagaa tatctggctt gtttcatagc ttttcggtat cccaagtttt tcaactttga 2700

tatgtgtatt gggttctcta ccttgttcac attttaaaat ttggtagttg ggcattgggc 2760

attgggcatt gggcattgat ggggacctgg atgggaaacc ctggggctta ggggctgtaa 2820

ctcattggca ttttctcttt gctcccaacc cttgaacatc tgttccacac gttacgctgt 2880

ttgtttttgt gtttgcttgc gtacaatgtc tgtattgaat aatttgtcag atgaattttg 2940

atgcatggtg aaacttgctc aatggaaatg tagcttaatt tctaattgca attaaataat 3000

ctactcatgc agcaaaaagt tattctgtta ttttattttg aagaagattt gtaattcatt 3060

tcatgaatag attagggaaa ggagttgtaa attattcgga cgtttggaga gagatttttt 3120

ttgtttatgt attatgtttt ttcttttccc tcaaacaatc aagtttaatg atagctgttt 3180

gattggattt gttagaagct tggattttga actattttta agaatggtcg tcacaagtgc 3240

gtgattccgt aggaaggaac aactttacct tatttaaaga atagttcatc caagtgtgtt 3300

tttatttaat tttctctcag agaaacagaa aactgattta gcattggttt taaactagat 3360

ctgcgaatat tatctctacc ttgttattaa ttttacttga aagctgaact atatatctcg 3420

tgcatttata gggtgtagga cacaatgatc aaaaggttct tgttcttgct gcaacaaata 3480

ctccctatgc tttggatcag gtgaagtaga atttgtctat ttccatatca tgtaaaggat 3540

tacaaaagtt gaatatctga ctgatacgtg ttttttacag gccattcgtc gacgattcga 3600

caagcggata tacattcctc tacctgattt gaaagccaga cagcacatgt tcaaagttct 3660

gagaattcta ttttattttc tccaataaaa aagcaagttt ttttgttgtt gtcatctcca 3720

tgaactttgc taatattcat agatgtattt aaataggtgc atctggggga tacaccacat 3780

aatttaacag aagcagattt tgaaaactta gcacgcaaga cagatggttt ctcgggttca 3840

gatatttcag tttgtgtaag tgtgtaatat ttgttggatg acgatgaact gaaatctttc 3900

attggtggct tgaatctata tcagatatta gttagaatgt agttcatgga tcccttgaat 3960

ttgcaggtga aggatgtgct ctttgaacct gtacgtaaaa ctcaagatgc tatgttcttc 4020

attatgactc ctgatggtat gtgggtacct tgtggaccaa agcaacaagg agctgtccaa 4080

attagcatgc aagagctagc agccaaagga cttgcctcaa aggtacatca catcttaaca 4140

tcctagatga atgtttagat taaaatttag ttattttcaa ctttcacaaa gtgacaagct 4200

tgcagatatg atatacacag actaatatat tttaacactt cttgcattgt gttcgatttg 4260

atgccacttt gtcgatagct caatggtgat gagtctcatg actgataatt ctatgattga 4320

accacaaaca aaattttgaa actattcatc tttcttctat tggtttattg ggctgttttt 4380

gtatgatttc atattttctt taagaaaaaa aaggcatttt atgcattgtt caaatttaag 4440

tttttataca tgcatatatg ttgaagaaga tctataattc gatgagggaa tgctttatca 4500

taatattttg acaaagtcac tggttgatag gtggaattcc attctttata tcgctaaacg 4560

tttggttatt tgggtgcaga ttcttcctcc accaattaca agaacagatt ttgacaaggt 4620

cttagctaga caaaggccta cggtgagtaa atctgatctg gaaattcatg aaaggtttac 4680

aaaagagttt ggggaggaag gttgaggagt gtgttatagt ttttatcgag tcttatctca 4740

atcatcgctg ttgcatacaa ccaattagag ttaa 4774

<210> 6

<211> 4783

<212> DNA

<213>黃瓜（Cucumis sativus L.）

<400> 6

atgtatagca atttcaagga gcaagctatt gaatacgtga agcaggcggt acatgaagat 60

aatgctggca attacgcaaa agcctttcca ctgtatatga acgccttgga gtacttcaaa 120

actcatttga agtatgagaa aaatcccaag atcaaggaag ctattaccca gaaattcacc 180

gagtatttgc gccgggctga ggagatacgt gctgttttgg atgatggcgg tcctggtccg 240

gcttccaatg gagatgcagc tgttgcaact aaacccaaga cgaaacctaa ggatggagaa 300

ggaggagatg gagaggatcc agaacaggct aagttaaggg ctggtcttaa ttccgcaatc 360

ataagggaga aaccggatgt taagtggaac gatgttgctg gattggagag cgccaagcag 420

gcgttgcaag aggctgtaat attacccgtt aagttccccc agttctttac tggttagttc 480

cattttgctt ctttcgatct actaccgtat tgatttttgt tgtctcatgt cagtacagtt 540

gtgttccccc tttgagctga gattttcttc atttcacgtt tcagtttgat tagatcatta 600

gatgtgtagt gattacaatt atattctagt ttaattataa tggtgcttac tttttaaata 660

aaatcatgtc aaagataatt gtctaccttt ctttaggtaa gaggcgacca tggcgagctt 720

tcttgttata tgggcctcct ggaactggaa agtcatactt ggcaaaggct gttgcgacag 780

aggctgactc gacatttttc aggtaacgat cctctgaggt ttgagtatat gaacttgtct 840

tgtgtgattt gtatggtagc catatatttc ttaactttcc tagctattat cttttaatgt 900

gcctgtgtga gcaacttaca acccttgagt tctcatgaaa ctttttttat gtcatcaaca 960

acattcatga actctgtgtt gctttcttta ttcttatgaa attgcagcaa gtatgaacaa 1020

tatcatttta aagtggtgtc tctaattaaa tatttttcat gcattagagt tgaggatatt 1080

aggaattatt agcagatatg gccgtaggga atttcatttt ctaaatgttc tatttaaccg 1140

tttctcaaga tttaatgatt cgaagttaga tggcctgttg ctctactgct ttatgggagg 1200

tctcctaggc cttcattcat tttgttggta tagtgtaatt tgttgtcgtc attgcaattc 1260

ttttgttcta ttttgttcat ttattaattc ttgaatttgg tgggctttaa atcttgtttc 1320

tatagaagaa caataatgga gatatttgtt gattactctt aagagtttta gatggttaga 1380

ttggaccatc tgtttgtttg gcaggaaact taagaggaac atatgactaa aggtaaaggt 1440

aagtgctgaa gccggaagtt taatataatt tataaacggt ttggcaaagt agcaatttta 1500

attcagaaga tgcatttgtg tcacatttta agtggtacaa gtgcaaccta ccctttcttt 1560

ttctctggat aagcaaaaga caacaaatgc tattgaatct tttcttctac aatttttata 1620

gtaaaaaact tatatccttt tctgggtgtg gcctttgaga cattgaaata agaaatccct 1680

agattcaaat tgtgatcttc cattttttac ttgcttcttg aactttttac ggttcttggc 1740

tttgaaaaaa atttgaggaa tacagtaagc tatcttttta ataatttact ttattgaaat 1800

aaagttcaaa tgcctttggt ggctatggac agtttgaact cattgaatag cctcaagtgg 1860

atataaagtg gggaatgcaa aaactaaaat gacttacaaa atatttccaa cttttggttg 1920

taaaaaaata aacgacagat ataaaaacaa gttttggtta tccattttct ctgctttcat 1980

tcccatccta tttaattaca gggcataccc acaccacatt ctatttggat acttttggcg 2040

gttgtttgaa tgtgttttta attatcaata aactctattt gctgtttcct gccacttgct 2100

ttaaattgag tattcttttc cattttctgt tgatagcatt tcttcttcgg accttgtctc 2160

gaaatggatg ggtgaaagcg agaagctagt ttcaaatctt tttcaaatgg ctcgtgatag 2220

cgcgccttct atcatcttta ttgatgaaat agattcgttg tgtggtcaac gaggtgaagg 2280

taatgaaagt gaagcttcaa gacgcattaa gactgaactt cttgtgcaaa tgcaggtatt 2340

gtttgtttgt agtgtaaaag cgtgaatatt ttgtgtacca aagaaaggtt gttgattatt 2400

attattatat atgcgtcctt tgctcatttc attgtcttga gaatgctcat tttcagaaaa 2460

tatctcattg ctgctgatct acatccaagt gtttttcagc cagttgaaag ttgacttaaa 2520

ttatatctgt agggttttct gatagtctaa ttacttgttt ctatgattct acccatctat 2580

ttgggcttta actgcttaaa taaagcttta gaatatctgg cttgtttcat agcttttcgg 2640

tatcccaagt ttttcaactt tgatatgtgt attgggttct ctaccttgtt cacattttaa 2700

aatttggtag ttgggcattg ggcattgggc attgatgggg acctggatgg gaaaccctgg 2760

ggcttagggg ctgtaactca ttggcatttt ctctttgctc ccaacccttg aacatctgtt 2820

caacatgtta cgctgtttgt ttttgtgttt gcttgcgtac aatgtctgta ttgaataatt 2880

tgtcagatga attttgatgc atggtgaaac ttgctcaatg gaaatgtagc ttaatttcta 2940

attgcaatta aataatctac tcatgcagca aaaagttatt ctgttatttt attttgaaga 3000

agatttgtaa ttcatttcat gaatagatta gggaaaggag ttgtaaatta ttcggacgtt 3060

tggagagaga ttttttttgt ttatgtatta tgttttttct tttccctcaa acaatcaagt 3120

ttaatgatag ctgtttgatt ggatttgtta gaagcttgga ttttgaacta tttttaagaa 3180

tggtcgtcac aagtgcgtga ttccgtagga aggaacaact ttaccttatt taaagaatag 3240

ttcatccacg agaggaaagt gaacaagaaa acaaaagaaa acaaaatcat aaaaatagtt 3300

atctaaatcc aagtgtgttt ttatttaatt ttctctcaga gaaacagaaa actgatttag 3360

cattggtttt aaactagatc tgcgaatatt atctctacct tgttattaat tttacttgaa 3420

agctgaacta tatatctcgt gcatttatag ggtgtaggac acaatgatca aaaggttctt 3480

gttcttgctg caacaaatac tccctatgct ttggatcagg tgaagtagaa attgtctatt 3540

tccatatcat gtaaaggatt acagaagttg aatatctgac tgataagtgt tgtttacagg 3600

ccattcgtcg acgattcgac aagcggatat acattcctct acctgatttg aaagccagac 3660

agcacatgtt caaagttctg agaattctat tttattttct ccaataaaaa agcaagtttt 3720

tttgttgttg tcgtctccat gaactttgct aatattcgta gatgtattta aataggtgca 3780

tctgggggat acaccacata atttaacaga agcagatttt gaaaacttag cacgcaagac 3840

agatggtttc tcgggttcag atatttcagt ttgtgtaagt gtgtaatatt tgttggatga 3900

cgatgaactg aaatctttca ttggtggctt gaatctatat cagatattag ttagaatgta 3960

gttcatggat cccttgaatt tgcaggtgaa ggatgtgctc tttgaacctg tacgtaaaac 4020

tcaagatgct atgttcttca ttatgactcc tgatggtatg tgggtacctt gtggaccaaa 4080

gcaacaagga gctgtccaaa ttagcatgca agagttagca gccaaaggac ttgcctcaaa 4140

ggtacatcac atcttaacat cctagatgaa tgtttagatt aaaatttagt tattttcaac 4200

tttcacaaag tgacaagctt gcagatatga taatatacac agactaatat attttaacac 4260

ttcttgcatt gtgttcgatt tgatgccact ttgtcgatag ctcaatggtg atgagtctca 4320

tgactgataa ttctatgatt gaaccacaaa caaaattttg aaactattca tctttattct 4380

attggtttat tgggccgttt ttgtatgatt tcatattttc tttaagaaaa aaaaggcatt 4440

ttatgcattg ttcaaattta agtttttata catgcatata tgttgaagaa gatctataat 4500

tcgatgaggg aatgctttat aataatattt tgacaaagtc actggttgat aggtggaatt 4560

ccattcttta tatcgctaaa cgtttggtta tttgggtgca gattcttcct ccaccaatta 4620

caagaacaga ttttgacaag gtcttagcta gacaaaggcc tacggtgagt aaatctgatc 4680

tggaaattca tgaaaggttt acaaaagagt ttggggagga aggttgagga gtgtgttata 4740

gtttttatcg agtcttatct caatcatcgc tgttgcatac aac 4783