本發(fā)明屬于微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種沙門氏菌的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

沙門氏菌（Salmonella enteritidis）是腸桿菌科中重要的病原菌屬，能引起人和動(dòng)物的敗血癥與胃腸炎，甚至流產(chǎn)，并能引起人類食物中毒，是人類細(xì)菌性食物中毒的最主要病原菌之一，嚴(yán)重危害食品安全和人體健康。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)主要包括噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)、PCR技術(shù)、抗體檢測(cè)等。但往往需要對(duì)菌體進(jìn)行裂解，難以直接檢測(cè)，或者涉及昂貴儀器的使用，難以大范圍推廣，以及檢測(cè)靈敏度有待進(jìn)一步提高。

因此，迫切需要建立一種操作簡單、快速、靈敏度高的沙門氏菌活菌檢測(cè)方法，并使檢測(cè)過程無需使用檢測(cè)儀器，這對(duì)于預(yù)防和控制沙門氏菌感染，保障食品安全和人體健康具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種沙門氏菌的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒，包括氯高鐵血紅素、雜交緩沖液、顯色緩沖液體系、核酸內(nèi)切酶和下列核酸序列：

核酸序列H1：依次具有A、B、C區(qū)域，其中A區(qū)是沙門氏菌的核酸適體，C與A部分互補(bǔ)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，A與C不互補(bǔ)的序列凸起于莖環(huán)結(jié)構(gòu)外側(cè)，B構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部分，B中包含一段與H2的H區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列；

核酸序列H2：依次具有D、F、H、G、E區(qū)域，其中D和E區(qū)域互補(bǔ)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，F(xiàn)和G區(qū)域是富含G堿基的序列，H區(qū)域?yàn)楹怂醿?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)序列；H區(qū)域與H1的B區(qū)域部分核酸序列互補(bǔ)，形成部分雙鏈DNA。

優(yōu)選的，A區(qū)的核酸序列為 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-5'。

優(yōu)選的，B區(qū)的堿基數(shù)為7-15個(gè)，更優(yōu)選的堿基數(shù)為13個(gè)。

優(yōu)選的，C區(qū)的堿基數(shù)6-10個(gè)，更優(yōu)選為8個(gè)。

優(yōu)選的，D和E區(qū)域的堿基數(shù)為5-10個(gè)。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G區(qū)域包含有四組GGG序列，各組GGG序列中間隔1-3個(gè)非G堿基。F和G的堿基組成可以一樣，也可以不一樣。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G的區(qū)域的核酸序列為GGGTAGGGCGGGTTGGG。

優(yōu)選的，核酸內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)特定的識(shí)別序列，通過結(jié)合識(shí)別序列，對(duì)識(shí)別序列進(jìn)行切割；具體包括核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Nt.BbvCI時(shí)，H2的H區(qū)域的核酸序列為5'-CCTCAGC-3'，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTGAGG-3'序列。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Bmtl時(shí)，H2的H區(qū)域的核酸序列為5'-GCTAGC-3'，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTAGC-3'序列。

優(yōu)選的，顯色緩沖液體系由顯色緩沖液、底物以及雙氧水構(gòu)成，包括四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水緩沖液體系、鄰苯二胺-雙氧水緩沖液體系或2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水緩沖液體系。

優(yōu)選的，雜交緩沖液為10 mM Tris-HCl，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100μg/ml BSA。

優(yōu)選的，所述的檢測(cè)試劑盒，包括核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：

核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-TTCGGAGTCGCTA-GAGGAGAC-5'（SEQ ID NO：1）；

核酸序列H2: 5'-AGTACTAG-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTCAGC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CTAGTACT-3'（SEQ ID NO：2）。

一種沙門氏菌的檢測(cè)方法，包括下列步驟：

1)先用雜交緩沖液分別溶解核酸H1和H2，將1 M的H1與待測(cè)溶液充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

2)加入1 M的H2，分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

3)加入25 U的核酸內(nèi)切酶如Nt.BbvCI，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘；

4)加入0.3 M的氯高鐵血紅素，室溫反應(yīng)30分鐘；取出50 L反應(yīng)液，加入到950 L顯色緩沖液體系中，室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化；如果待測(cè)溶液含有沙門氏菌時(shí)，溶液變色，如果待測(cè)溶液不含沙門氏菌時(shí)，溶液無色；

其中，雜交緩沖液體系、核酸內(nèi)切酶、顯色緩沖液體系和核酸序列H1、H2如上述任一項(xiàng)所述。

本發(fā)明方法的反應(yīng)原理(見圖1)為：

（1）莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸H1中的A序列是沙門氏菌的核酸適體，沙門氏菌與A結(jié)合后，打開H1，使B暴露出來。B中包含一段與H2的H區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列。

（2）H1的B部分核酸序列與H2的H互補(bǔ)，形成部分雙鏈DNA。H的核酸序列為核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)序列。F和G為富含G堿基的序列，F(xiàn)和G的堿基組成可以一樣也可以不一樣。D和E互補(bǔ)，堿基數(shù)為5-10個(gè)。

（3）加入核酸內(nèi)切酶（Nt.BbvCI）后，可識(shí)別雙鏈DNA中的酶切位點(diǎn)，在H2的H部分切割H2，使H2分成兩部分。H2的F和G變成單鏈。同時(shí)H1的B部分可循環(huán)進(jìn)入下一輪，繼續(xù)與H2反應(yīng)，啟動(dòng)酶切割。最后產(chǎn)生大量的單鏈F和G。核酸內(nèi)切酶有多種（例如：Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI ），只要替換對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列，也能完成檢測(cè)。

（4）F和G是一段富含G堿基的序列。加入氯高鐵血紅素（Hemin）后，會(huì)形成具有催化活性的G四聚體結(jié)構(gòu)。它們能催化氧化TMB-H₂O₂（四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水）、OPD-H₂O₂（鄰苯二胺-雙氧水）或ABTS-H₂O₂（2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水）等檢測(cè)體系，產(chǎn)生有色底物，結(jié)果肉眼可見，從而達(dá)到檢測(cè)沙門氏菌的目的。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）無需對(duì)菌液進(jìn)行裂解提取，操作簡單，可快速檢測(cè)活菌含量；

（2）只需一種工具酶即可完成信號(hào)擴(kuò)增，成本低廉，響應(yīng)迅速；

（3）靈敏度高、選擇性好，無需對(duì)溫度進(jìn)行精確控制；

（4）無需標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果直接肉眼可見，無需檢測(cè)儀器，適于現(xiàn)場快檢測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的檢測(cè)方法的原理圖；

圖2為對(duì)不同濃度的沙門氏菌的結(jié)果圖；

圖3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

一種沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒，包括氯高鐵血紅素、雜交緩沖液、顯色緩沖液體系、核酸內(nèi)切酶和下列核酸序列：

核酸序列H1：依次具有A、B、C區(qū)域，其中A區(qū)是沙門氏菌的核酸適體，C與A部分互補(bǔ)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，A與C不互補(bǔ)的序列凸起于莖環(huán)結(jié)構(gòu)外側(cè)，B構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部分，B中包含一段與H2的H區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列；

核酸序列H2：依次具有D、F、H、G、E區(qū)域，其中D和E區(qū)域互補(bǔ)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分，F(xiàn)和G區(qū)域是富含G堿基的序列，H區(qū)域?yàn)楹怂醿?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)序列；H區(qū)域與H1的B區(qū)域部分核酸序列互補(bǔ)，形成部分雙鏈DNA。

優(yōu)選的，A區(qū)的核酸序列為 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-5'。

優(yōu)選的，B區(qū)的堿基數(shù)為7-15個(gè)，更優(yōu)選的堿基數(shù)為13個(gè)。

優(yōu)選的，C區(qū)的堿基數(shù)6-10個(gè)，更優(yōu)選為8個(gè)。

優(yōu)選的，D和E區(qū)域的堿基數(shù)為5-10個(gè)。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G區(qū)域包含有四組GGG序列，各組GGG序列中間隔1-3個(gè)非G堿基。F和G的堿基組成可以一樣，也可以不一樣。

優(yōu)選的，F(xiàn)和G區(qū)域的核酸序列為GGGTAGGGCGGGTTGGG。

優(yōu)選的，核酸內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)特定的識(shí)別序列，通過結(jié)合識(shí)別序列，對(duì)識(shí)別序列進(jìn)行切割；具體包括核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Nt.BbvCI時(shí)，H2的H區(qū)域的核酸序列為5'-CCTCAGC-3'，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTGAGG-3'序列。

優(yōu)選的，當(dāng)核酸內(nèi)切酶為Bmtl時(shí)，H2的H區(qū)域的核酸序列為5'-GCTAGC-3'，H1的B區(qū)域中包含一段與之互補(bǔ)的5'-GCTAGC-3'序列。

優(yōu)選的，顯色緩沖液體系由顯色緩沖液、底物以及雙氧水構(gòu)成，包括四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水緩沖液體系、鄰苯二胺-雙氧水緩沖液體系或2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水緩沖液體系。

優(yōu)選的，雜交緩沖液為10 mM Tris-HCl，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100μg/ml BSA。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒，包括核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：

核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-TTCGGAGTCGCTA-GAGGAGAC-5'（SEQ ID NO：1）；

核酸序列H2: 5'-AGTACTAG-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTCAGC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CTAGTACT-3'（SEQ ID NO：2）。

一種沙門氏菌的檢測(cè)方法，包括下列步驟：

1)先用雜交緩沖液分別溶解核酸H1和H2，將1 M的H1與待測(cè)溶液充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

2)加入1 M的H2，分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；

3)加入25 U的核酸內(nèi)切酶如Nt.BbvCI，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘；

4)加入0.3 M的氯高鐵血紅素，室溫反應(yīng)30分鐘；取出50 L反應(yīng)液，加入到950 L顯色緩沖液體系中，室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化；如果待測(cè)溶液含有沙門氏菌時(shí)，溶液變色，如果待測(cè)溶液不含沙門氏菌時(shí)，溶液無色；

其中，雜交緩沖液體系、核酸內(nèi)切酶、顯色緩沖液體系和核酸序列H1、H2如上述任一項(xiàng)所述。

本發(fā)明方法的反應(yīng)原理(見圖1)為：

（1）莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸H1中的A序列是沙門氏菌的核酸適體，沙門氏菌與A結(jié)合后，打開H1，使B暴露出來。B中包含一段與H2的H區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列。

（2）H1的B部分核酸序列與H2的H互補(bǔ)，形成部分雙鏈DNA。H的核酸序列為核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)序列。F和G為富含G堿基的序列，F(xiàn)和G的堿基組成可以一樣也可以不一樣。D和E互補(bǔ)，堿基數(shù)為5-10個(gè)。

（3）加入核酸內(nèi)切酶（Nt.BbvCI）后，可識(shí)別雙鏈DNA中的酶切位點(diǎn)，在H2的H部分切割H2，使H2分成兩部分。H2的F和G變成單鏈。同時(shí)H1的B部分可循環(huán)進(jìn)入下一輪，繼續(xù)與H2反應(yīng)，啟動(dòng)酶切割。最后產(chǎn)生大量的單鏈F和G。核酸內(nèi)切酶有多種（例如：Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI ），只要替換對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列，也能完成檢測(cè)。

（4）F和G是一段富含G堿基的序列。加入氯高鐵血紅素（Hemin）后，會(huì)形成具有催化活性的G四聚體結(jié)構(gòu)。它們能催化氧化TMB-H₂O₂（四甲基聯(lián)苯胺-雙氧水）、OPD-H₂O₂（鄰苯二胺-雙氧水）或ABTS-H₂O₂（2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽-雙氧水）等檢測(cè)體系，產(chǎn)生有色底物，結(jié)果肉眼可見，從而達(dá)到檢測(cè)沙門氏菌的目的。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1

一種沙門氏菌的檢測(cè)方法，按照如下步驟進(jìn)行：

（1）先用Tris-HCl緩沖液（10 mM，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100 μg/ml BSA）分別溶解核酸H1和H2。1 M的H1與沙門氏菌充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。

（2）加入1 M的H2，分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。

（3）加入25 U的核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI，充分混勻，室溫反應(yīng)90分鐘。

（4）加入0.3 M的Hemin（氯高鐵血紅素），室溫反應(yīng)30分鐘。取出50 L反應(yīng)液，加入到950 L顯色緩沖液體系中（含有26.6 mM 檸檬酸，51.4 mM磷酸氫二鈉，25 mM KCl，10 L 0.5%的TMB，20 L 30%的H₂O₂，pH=5.0），室溫反應(yīng)15分鐘，觀察顏色變化。當(dāng)有沙門氏菌時(shí)，溶液變藍(lán)，當(dāng)沒有沙門氏菌時(shí)，溶液無色。

實(shí)施例2

一種沙門氏菌檢測(cè)試劑盒包括以下成分：

（1）核酸H1和H2，序列如下：

核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC（A）-TTCGGAGTCGCTA（B）-GAGGAGAC（C）-5'（SEQ ID NO：1）；

核酸序列H2:5'-AGTACTAG（D）-GGGTAGGGCGGGTTGGG（F）-CC↓TCAGC（H）-GGGTAGGGCGGGTTGGG（G）-CTAGTACT（E）-3'（SEQ ID NO：2）；（箭頭表示切割位點(diǎn)）；

（2）核酸內(nèi)切酶Nt.BbvCI；

（3）雜交緩沖液，包含10 mM Tris-HCl，pH為7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl₂以及100 μg/ml BSA；

（4）氯高鐵血紅素；

（5）顯色緩沖液體系，包含有26.6 mM檸檬酸，51.4 mM磷酸氫二鈉，25 mM KCl，10 L 0.5%的TMB，20 L 30%的H₂O₂，pH=5.0。

實(shí)施例3

對(duì)不同濃度沙門氏菌的檢測(cè)：

配制沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為1x10¹ cfu/mL、 1x10² cfu/mL、 1x10³cfu/mL、1x10⁴ cfu/mL、1x10⁵cfu/mL、1x10⁶ cfu/mL 4℃保存。將不同濃度的沙門氏菌溶液分別加到實(shí)施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖2所示，10 cfu/mL的沙門氏菌可產(chǎn)生明顯的藍(lán)色變化，說明其檢測(cè)限為10 cfu/mL。隨著沙門氏菌濃度增加，顏色也增加，并逐漸趨于飽和。

實(shí)施例4

特異性實(shí)驗(yàn)：

配制濃度為1x10³ cfu/mL的不同菌溶液，分別是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、地桿菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、布魯氏桿菌。將1x10³ cfu/mL的不同菌溶液和1x10³ cfu/mL沙門氏菌溶液分別加到實(shí)施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后觀察顏色變化，如圖3所示，1x10³ cfu/mL的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、地桿菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、布魯氏桿菌。沒有產(chǎn)生顏色變化，對(duì)檢測(cè)不產(chǎn)生影響。只有當(dāng)加入沙門氏菌溶液后才會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，這證明該方法對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)具有很好的特異性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所

<120> 一種沙門氏菌的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgatggctgt agtgtttccg ggttatcact agtttggtgg caccaatgtc agtctcctct 60

tcggagtcgc tagaggagac 80

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtactaggg gtagggcggg ttgggcctca gcgggtaggg cgggttgggc tagtact 57