本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)志物、試劑盒及應(yīng)用，特別是涉及與抗結(jié)核藥物引起的藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的尚未公開的SNP標(biāo)志物及其組合、試劑盒以及它們的應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病可謂是傳染病中的一個最大災(zāi)難——全世界每年會有上百萬人因該病致死，是當(dāng)前導(dǎo)致發(fā)展中國家居民(尤其是兒童)死亡的主要疾病之一。藥物化療是當(dāng)前治療結(jié)核病的主要手段，常用的藥物為異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)。雖然藥物化療對于結(jié)核病的臨床治療效果較好，但是在治療過程中出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)(adversedrugreactions，ADR)，影響了抗結(jié)核治療效果和患者健康。其中，抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)(anti-tuberculosisdruginducedhepatotoxicity，ATDH)是最嚴(yán)重的常見抗結(jié)核ADR。既往研究認(rèn)為年齡、體重、性別、合并用藥、營養(yǎng)狀況等因素會影響ATDH的發(fā)病。隨著遺傳領(lǐng)域中藥物基因組學(xué)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)在揭示個體不同的表型性狀、以及對于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)的研究中受到人們的重視，有關(guān)SNP與ATDH個體差異的關(guān)系的研究越來越深入，且多聚焦于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2基因(N-acetyltrangerase2，NAT2)。NAT2是治療結(jié)核病的常用藥物異煙肼(isoniazid，INH)代謝過程中的主要代謝酶。遺傳學(xué)研究顯示，NAT2的乙?；x型(快、中、慢乙酰化代謝型)主要由其編碼區(qū)功能多態(tài)性位點(diǎn)及其單體型(快、中、慢乙酰化代謝型)決定。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，部分編碼區(qū)SNP突變等位基因相對其野生型等位基因所產(chǎn)生的氨基酸改變，減低了NAT2的表達(dá)量和/或其乙?；富钚?。目前已經(jīng)公開的相關(guān)研究有：“N-乙?；D(zhuǎn)移酶2及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶M1基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物性肝損傷的關(guān)系研究”，安慧茹等，《中國防癆雜志》，2014年1月，第36卷第1期，第14－20頁)公開了NAT2的rs1805158、rs1801280、rs72554617、rs1799930、rs1799931多態(tài)性位點(diǎn)與抗結(jié)核藥致肝損傷相關(guān)，統(tǒng)計(jì)的患者為接受異煙肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺聯(lián)合治療后造成肝損傷的患者，所使用的方法為對每個SNP位點(diǎn)與肝損傷的相關(guān)性進(jìn)行單獨(dú)分析，沒有公開將某些SNP組成一組時與藥物肝損傷的關(guān)聯(lián)是否更高；WO2015109608A1公開了NAT2的rs1041983、rs1495741SNP及其組合與抗結(jié)核藥異煙肼、利福平、吡嗪酰胺中任一種或其組合造成的肝損傷相關(guān)，并公開了一些包含NAT2rs1041983或rs1495741以及XO基因rs2295475或rs1884752SNP的組合與藥物肝損傷的相關(guān)性；CN106119363A公開了N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2基因(N-acetyltrangerase2，NAT2)的7個SNP位點(diǎn)(rs1801279、rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208和rs1799931)的組合可以用于抗結(jié)核藥物肝損傷易感基因型檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供尚未公開的、與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP標(biāo)志物，以更加全面、準(zhǔn)確地分子遺傳標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起的藥物肝毒性反應(yīng)，從而進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇和用藥預(yù)測，實(shí)現(xiàn)個體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)。本發(fā)明的目的還在于提供上述SNP標(biāo)志物在抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)方面非診斷的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于通過準(zhǔn)確檢測上述與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP標(biāo)志物，以更加全面、準(zhǔn)確評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP標(biāo)志物，所述的SNP標(biāo)志物是包括FLT3基因SNP位點(diǎn)和NAT2基因SNP位點(diǎn)的組合，所述的FLT3基因SNP位點(diǎn)是rs9319408，所述NAT2基因SNP位點(diǎn)是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一個或多個。進(jìn)一步地，上述SNP標(biāo)志物組合與VAV2基因SNP位點(diǎn)rs679106、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372和IL6基因SNP位點(diǎn)rs2069852中一個或多個相組合，可以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確地標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起藥物肝毒性反應(yīng)的目的。更進(jìn)一步地，以上所有情況還可以與其它的NAT2基因的與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其組合(如：NAT2基因的SNP位點(diǎn)rs1041983或rs1495741，或者兩者的組合)相組合，可以更準(zhǔn)確地標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起藥物肝毒性反應(yīng)。上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物的引物序列可以分別為：rs9319408的引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；rs679106的引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；rs1429372的引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；rs2069852的引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；rs4921914的引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；rs10103029的引物序列為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；rs7816847的引物序列為SEQIDNo.28和SEQIDNo.29；rs1041983的引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；rs1495741的引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35。進(jìn)一步地，對應(yīng)于上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特異性延伸引物的引物序列可以分別為：rs9319408的引物序列為SEQIDNo.12；rs679106的引物序列為SEQIDNo.15；rs1429372的引物序列為SEQIDNo.18；rs2069852的引物序列為SEQIDNo.21；rs4921914的引物序列為SEQIDNo.24；rs10103029的引物序列為SEQIDNo.27；rs7816847的引物序列為SEQIDNo.30；rs1041983的引物序列為SEQIDNo.33；rs1495741的引物序列為SEQIDNo.36。本發(fā)明還提供上述SNP標(biāo)志物在抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)方面非診斷的應(yīng)用，如應(yīng)用于制備評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒。本發(fā)明還提供了一種評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的至少如下的SNP標(biāo)志物：所述的SNP標(biāo)志物是包括FLT3基因SNP位點(diǎn)和NAT2基因SNP位點(diǎn)的組合，所述的FLT3基因SNP位點(diǎn)是rs9319408，所述NAT2基因SNP位點(diǎn)是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一個或多個?？蛇x地，該試劑盒含有如下特異性擴(kuò)增引物序列：所述的SNP位點(diǎn)rs9319408的引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；所述的SNP位點(diǎn)s4921914的引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；所述的SNP位點(diǎn)rs10103029的引物序列為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；所述的SNP位點(diǎn)rs7816847的引物序列為SEQIDNo.28和SEQIDNo.29。更進(jìn)一步地，與上述試劑盒所含特異性擴(kuò)增引物序列相對應(yīng)的特異性延伸引物序列為：所述的SNP位點(diǎn)rs9319408的引物序列為SEQIDNo.12；所述的SNP位點(diǎn)rs4921914的引物序列為SEQIDNo.24；所述的SNP位點(diǎn)rs10103029的引物序列為SEQIDNo.27；所述的SNP位點(diǎn)rs7816847的引物序列為SEQIDNo.30。進(jìn)一步地，該評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒還用于檢測與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的VAV2基因SNP位點(diǎn)rs679106、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372和IL6基因SNP位點(diǎn)rs2069852中的一個或多個。相應(yīng)于此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴(kuò)增引物序列：所述的SNP位點(diǎn)rs679106的引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；所述的SNP位點(diǎn)rs1429372的引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；所述的SNP位點(diǎn)rs2069852的引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20。相應(yīng)于此檢測，進(jìn)一步地，與上述試劑盒所含特異性擴(kuò)增引物序列相對應(yīng)的特異性延伸引物序列可以為：所述的SNP位點(diǎn)rs679106的引物序列為SEQIDNo.15；所述的SNP位點(diǎn)rs1429372的引物序列為SEQIDNo.18；所述的SNP位點(diǎn)rs2069852的引物序列為SEQIDNo.21。更進(jìn)一步地，該評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒還用于檢測與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的NAT2基因位點(diǎn)rs1495741和/或rs1041983。相應(yīng)于此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴(kuò)增引物序列：所述的SNP位點(diǎn)rs1041983的引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；所述的SNP位點(diǎn)rs1495741的引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35。相應(yīng)于此檢測，進(jìn)一步地，與上述試劑盒所含特異性擴(kuò)增引物序列相對應(yīng)的特異性延伸引物序列可以為：所述的SNP位點(diǎn)rs1041983的引物序列為SEQIDNo.33；所述的SNP位點(diǎn)rs1495741的引物序列為SEQIDNo.36。可選地，該試劑盒還可以包括相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，這些常用試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照等)。綜上所述，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了尚未被公開的與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的基于FLT3和NAT2基因SNP標(biāo)志物組合，從而更加全面、準(zhǔn)確地分子遺傳標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起的藥物肝毒性反應(yīng)；此外，將上述未公開的SNP標(biāo)志物組合應(yīng)用于評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒中，從而更加全面、準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測，以及分子標(biāo)記輔助選擇和用藥預(yù)測，實(shí)現(xiàn)個體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1研究對象說明：本發(fā)明的研究對象是：2005-2014年在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院住院治療、年齡在0-16歲間的中國漢族結(jié)核病患兒(均是在患兒和家長知情同意的前提下)；并且，他們完全滿足以下3個標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為結(jié)核??；②以標(biāo)準(zhǔn)化療劑量及方案接受抗結(jié)核化療時間超過2周；③基礎(chǔ)肝腎功能正常。其中，結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)是：根據(jù)美國胸科協(xié)會制定的《成人和兒童結(jié)核病診斷和分級標(biāo)準(zhǔn)》和中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組制定的《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案(試行)》進(jìn)行結(jié)核病診斷。結(jié)核病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)具體為：①活動性結(jié)核病接觸史；②PPD試驗(yàn)陽性；③抗結(jié)核治療有效；④排除其他疾??；滿足①至④中的任意2項(xiàng)，并具有典型臨床癥狀和影像學(xué)證據(jù)，臨床診斷為結(jié)核病。ATDH判斷標(biāo)準(zhǔn)是：滿足以下4項(xiàng)中任意1項(xiàng)即可診斷為ATDH：①血清ALT含量>(2×ULN)；ALT代表丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；血清ALT相應(yīng)的ULN＝40IU/L；②血清DBil含量>(2×ULN)；DBil代表直接膽紅素；血清DBil相應(yīng)的ULN＝6.8μmol/L；③血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量均>(1×ULN)，且其中n1項(xiàng)>(2×ULN)，n1≥1；AST代表天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALP代表堿性磷酸酶，Tbil代表總膽紅素；血清AST相應(yīng)的ULN＝40IU/L，血清ALP相應(yīng)的ULN＝220IU/L，血清Tbil相應(yīng)的ULN＝19.0μmol/L；④滿足標(biāo)準(zhǔn)a和標(biāo)準(zhǔn)b：標(biāo)準(zhǔn)a：血清ALT含量、血清DBil含量、血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量，上述5項(xiàng)中的n2項(xiàng)>(1×ULN)，n2≥1；標(biāo)準(zhǔn)b：具有如下肝毒性疑似癥狀之一：皮膚鞏膜黃染、肝區(qū)不適、惡心、嘔吐、厭食、發(fā)熱、皮疹、瘙癢等肝毒性疑似癥狀。ATDH入組標(biāo)準(zhǔn)：①ATDH發(fā)生在抗結(jié)核化療開始后；②排除外病毒感染、新生兒黃疸、肝腎基礎(chǔ)疾病及其他疾病引起的ATDH；③結(jié)核藥減量或停用后，ATDH癥狀減輕；④排除其他藥物致ATDH的可能性。滿足①至④四項(xiàng)者即可診斷為ATDH。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：抗結(jié)核化療后，肝功能仍正常者。本實(shí)施例1中，使用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Gemone-wideassociationstudy，GWAS)對大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了篩選。其中，基于上述研究對象標(biāo)準(zhǔn)，將385例結(jié)核病患兒分成ATDH組和非ATDH對照組，ATDH組77例，對照組308例。1、關(guān)于GWAS全基因組芯片：GWAS全基因組芯片數(shù)據(jù)來自于前期的中國漢族人群結(jié)核病易感研究，通過質(zhì)控分析，最終得到了691388個SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果。芯片執(zhí)行情況如下：1)GWAS芯片類型：Illumina公司HumanOmniZhongHua-8BeadChip；2)GWAS芯片的數(shù)據(jù)分析方法：Plink軟件。芯片共得到900，015個SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果，經(jīng)過檢出率、Hardy-Weinberger平衡(HWE)、樣本親緣關(guān)系以及主成分分析等質(zhì)控，最終得到691388個SNP位點(diǎn)用于后續(xù)分析。(1)檢出率標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定和HWE分析：SNP分型數(shù)據(jù)需符合以下標(biāo)準(zhǔn)，才能納入后續(xù)分析：樣品檢出率＞99％、SNP位點(diǎn)檢出率＞95％、對照組HWE的P值＞0.0001和最小等位基因頻率＞0.01。除此之外，采用GenomeStudiov3.0(Illumina)軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)散點(diǎn)圖的篩查，舍棄聚類不良的SNP位點(diǎn)。(2)樣本親緣關(guān)系分析：為明確個體間是否有血緣關(guān)系，采用血緣同源(IBD)等位基因的概率分布進(jìn)行分析。在分析中發(fā)現(xiàn)，病例組和對照組分別有一對樣本IBD的PI-HAT＞0.05，因此，對具有血緣關(guān)系的病例和對照及其相對應(yīng)的對照和病例樣本給予刪除。另外，我們隨機(jī)選擇15個樣本進(jìn)行重現(xiàn)性的檢測，其基因分型吻合率為99.99％，證明：芯片檢測結(jié)果穩(wěn)定，SNP位點(diǎn)基因分型數(shù)據(jù)可靠。(3)主成分分析：整合千人基因組計(jì)劃中非洲人(YRI)、歐洲人(CEU)，日本人(JPT)、中國北方人(CHB)和中國南方人(CHS)的數(shù)據(jù)以及我們芯片數(shù)據(jù)，并對整合數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，確保芯片檢測的病例和對照組樣本具有中國人群的遺傳特征，遺傳背景一致。(4)對于芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行人群分層分析：為研究樣本的人群分層情況，進(jìn)行膨脹系數(shù)(λGC)的分析。λGC為1.017，說明我們很好地削減了人群分層對于結(jié)果的影響。2、使用上述GWAS全基因組芯片對大樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：對于芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析：對上述385例ATDH病例及對照樣本的SNP位點(diǎn)分型結(jié)果進(jìn)行了數(shù)據(jù)調(diào)取。采用Plink軟件對385例ATDH和非ATDH對照兒童的691388個SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型比較分析，采用年齡性別對數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正，并結(jié)合離散關(guān)聯(lián)決策算法對數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，得到SNP位點(diǎn)與ATDH易感相關(guān)性的結(jié)果。選取的ATDH關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)OR值和P值如表1所示：表1：ATDH關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)OR值和P值SNP位點(diǎn)基因OR值(95％CI)P值rs6696544CAMTA12.412(1.612-3.611)1.87E-05rs12272502KCNE32.228(1.494-3.324)8.63E-05rs2290714BLNK2.281(1.535-3.391)4.54E-05rs1031915PPP2R2B2.197(1.479-3.263)9.7E-05rs9319408FLT32.832(1.455-5.51)2.18E-03rs679106VAV22.938(1.779-4.852)2.56E-05rs1429372XO1.821(1.231-2.693)2.68E-03rs2069852IL61.540(1.053-2.254)2.62E-02rs4921914NAT23.544(2.289-5.489)1.42E-08rs10103029NAT23.589(2.296-5.611)2.09E-08rs7816847NAT23.408(2.188-5.307)5.82E-08rs1041983NAT23.434(2.236-5.273)1.73E-08rs1495741NAT23.522(2.277-5.446)1.52E-08從表1中可以看出，檢測結(jié)果共涉及9個基因的13個SNP位點(diǎn)。其中，CAMTA1基因SNP位點(diǎn)rs6696544、KCNE3基因SNP位點(diǎn)rs12272502、BLNK基因SNP位點(diǎn)rs2290714、PPP2R2B基因SNP位點(diǎn)rs1031915、FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408、VAV2基因SNP位點(diǎn)rs679106、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372、IL6基因SNP位點(diǎn)rs2069852、以及NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914、rs10103029和rs7816847，均為首次發(fā)現(xiàn)與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。實(shí)施例2：研究對象說明詳見實(shí)施例1。本實(shí)施例2中，針對實(shí)施例1中所獲得的13個SNP位點(diǎn)，另外選取582例樣本(與上述實(shí)施例1中的385例無重合)(ATDH組122例，非ATDH對照組460例)，進(jìn)行質(zhì)譜驗(yàn)證。1、實(shí)驗(yàn)步驟：1)引物設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息，使用引物設(shè)計(jì)軟件Assaydesign3.1設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并交由生物公司合成。各SNP位點(diǎn)對應(yīng)的引物見表2。其中，F(xiàn)orwardPrimer為上游引物，ReversePrimer為下游引物，ExtendedPrimer為延伸引物。表2：實(shí)施例1中所獲得的13個SNP位點(diǎn)所對應(yīng)的引物：2)DNA提?。菏褂贸善坊噭┖校崛⊙獦?、組織、細(xì)胞、唾液中的DNA。使用NanoDrop2000儀器進(jìn)行OD值檢測，1.25％瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質(zhì)檢合格，轉(zhuǎn)移至96孔板，-20℃儲存?zhèn)溆谩?)系統(tǒng)基因分型步驟：①PCR擴(kuò)增反應(yīng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction，PCR)用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)域。每個PCR循環(huán)，反應(yīng)混合體系都在模板變性、引物退火和引物延伸三種不同溫度下依序溫育。該過程可使用一種可編程序的溫度熱循環(huán)儀而達(dá)到自動化。②產(chǎn)物堿性磷酸酶處理：在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。③單堿基延伸反應(yīng)：在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積9μl。④樹脂純化：⑤芯片點(diǎn)樣：采用MassARRAYNanodispenserRS1000點(diǎn)樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至SpectroCHIPbioarray上。⑥質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)輸出：將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性，將結(jié)果保存并進(jìn)行分析。以上①至⑥均為本領(lǐng)域質(zhì)譜檢測的常規(guī)方法，這里不再冗述。2、多位點(diǎn)聯(lián)合風(fēng)險評估：采用以O(shè)R值作為權(quán)重的遺傳風(fēng)險評分(oddsratioweightedgeneticriskscore，OR-GRS)方法對以上582例樣本進(jìn)行多位點(diǎn)聯(lián)合風(fēng)險評估計(jì)算。該方法大致可以分為兩步：a)所有SNP位點(diǎn)的OR值*突變基因數(shù)量，然后求和，即：公式中，G表示一組遺傳易感位點(diǎn)風(fēng)險等位基因數(shù)的集合向量(Gi表示第i個遺傳易感位點(diǎn)的風(fēng)險等位基因的數(shù)量)；b)對所有樣本的求和數(shù)值計(jì)算敏感性和特異性，繪制ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積，即：AUC值。有關(guān)OR-GRS的原理和評分方法具體參見文獻(xiàn)“遺傳風(fēng)險評分的原理與方法”(王鋮，戴俊程，孫義民，謝蘭，潘良斌，胡志斌，沈洪兵，2015，[J].中華流行病學(xué)雜志，36(10)：1062-1064)。相關(guān)SNP位點(diǎn)組合的AUC值的結(jié)果如下：1)根據(jù)上述方法計(jì)算出來的FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408與NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一個組合的AUC值，以及該組合與其它3個基因SNP位點(diǎn)中至少一個相組合的AUC值，如表3所示。其中，所述的其它3個基因SNP位點(diǎn)分別為VAV2基因位點(diǎn)(rs679106)、XO基因位點(diǎn)(rs1429372)和IL6基因位點(diǎn)(rs2069852)。表3中的方案分別為：方案1：FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408與NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一個組合；方案2：上述方案1中FLT3基因SNP位點(diǎn)與NAT2基因SNP位點(diǎn)的組合與其他3個SNP位點(diǎn)中的任意一個位點(diǎn)的組合；方案3：上述方案1中FLT3基因SNP位點(diǎn)與NAT2基因SNP位點(diǎn)的組合與其他3個SNP位點(diǎn)中的任意二個位點(diǎn)的組合；方案4：上述方案1中FLT3基因SNP位點(diǎn)與NAT2基因SNP位點(diǎn)的組合與其他3個SNP位點(diǎn)中的所有三個位點(diǎn)的組合；表3中示出的是針對每個組合方案所測的最大AUC值(表3中AUC值上帶有max下標(biāo)的組合)、最小AUC值(表3中AUC值上帶有min下標(biāo)的組合)，以及若干位于最大值和最小值之間的、隨機(jī)抽取的組合的AUC值。表3：基于KCNE3和NAT2基因的SNP位點(diǎn)組合、以及該組合與其它3個基因SNP位點(diǎn)組合的AUC值：2)上述相關(guān)SNP位點(diǎn)組合的AUC值的結(jié)果1)中所有情況與NAT2基因位點(diǎn)rs1495741和/或rs1041983(表4中表示為NAT2*)組合的AUC值，如表4所示。表4中的方案分別為：方案1：上述結(jié)果1)中的方案1所涵蓋的所有組合與NAT2基因位點(diǎn)rs1495741和/或rs1041983組合；方案2：上述結(jié)果1)中的方案2-4所涵蓋的所有組合與NAT2基因位點(diǎn)rs1495741和/或rs1041983組合；表4中示出的是針對每個組合方案所測的最大AUC值(表4中AUC值上帶有“max”下標(biāo)的組合)、最小AUC值(表4中AUC值上帶有“min”下標(biāo)的組合)，以及若干位于最大值和最小值之間的、隨機(jī)抽取的組合的AUC值。表4：上述相關(guān)SNP位點(diǎn)組合的AUC值的結(jié)果1)中所有情況與NAT2基因位點(diǎn)rs1495741和/或rs1041983組合的AUC值：3)比較例：比較例見表5。表5中示出的是本發(fā)明所檢測出的NAT2基因的5個與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)各自及其組合的AUC值，以及NAT2基因的SNP位點(diǎn)與XO基因和/或IL6基因的SNP位點(diǎn)的組合的AUC值。表5：作為比較例的AUC值：基于FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408為首次發(fā)現(xiàn)與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)，且在表3和表4中的方案1與表5的AUC值的比較中可以看出，F(xiàn)LT3和NAT2基因的SNP位點(diǎn)組合具有與NAT2基因的5個與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)各自及其組合類似的較高的AUC值，由此可以得出結(jié)論：FLT3和NAT2基因的SNP位點(diǎn)組合為更全面、準(zhǔn)確地評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險提供了另外一種可能性。從表3中的方案2-4與表5的AUC值的比較中可以看出，進(jìn)一步地，F(xiàn)LT3和NAT2基因的SNP位點(diǎn)組合與本發(fā)明中其它3個基因SNP位點(diǎn)中至少一個相組合的AUC值顯著高于比較例(表5)中的組合方案，其大部分的AUC值略高于比較例(表5)中的組合方案的AUC值，從而表明，這些方案可以實(shí)現(xiàn)更全面、準(zhǔn)確地評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的目的。更進(jìn)一步地，從表4中的方案2與表5的AUC值的比較中可以看出，在表3中方案2-4所涵蓋的所有組合的基礎(chǔ)上，再與NAT2基因位點(diǎn)rs1495741和/或rs1041983組合(即表4中的方案2)而形成的組合中，部分組合可以達(dá)到更高的AUC值，以更準(zhǔn)確地評估抗結(jié)核藥物引起藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險。實(shí)施例3：本實(shí)施例3中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408和NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914。該試劑盒含有所需檢測SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，SNP位點(diǎn)rs9319408的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；SNP位點(diǎn)rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；該試劑盒還包括相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑：(如dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照等)。例如：本實(shí)施例3中的試劑盒試劑包括：dNTPs(25mM)，MgCl2(25mM)，PrimerMix(500nM)，HotStarTaq(5U/μl)，雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：1.85μL雙蒸水，0.1μLdNTP(25mM)，0.325μLMgCl2(25mM)，1μLPrimerMix(500nM)，0.625μLPCRBuffer(1.25x)，0.1μLHotStarTaq(5U/μL)，加入1μL模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環(huán)；72℃延伸3min。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。延伸反應(yīng)體系：0.041μLiPLEX酶(1x)，0.94μLPrimerMix，0.619μL雙蒸水，0.2μLiPLEXTerminationmix(1x)，0.2μLiPLEXBufferPlus(0.222x)，7μLSAP處理后PCR產(chǎn)物。延伸反應(yīng)條件：94℃變性30s；94℃5s；52℃5s，80℃5s，40個循環(huán)；72℃延伸3min。純化后產(chǎn)物使用SequenomMassArray系統(tǒng)進(jìn)行基因分型。或者，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系的組成如下(50μL):基因組DNA0.50ng、上游引物30pmol、下游引物30pmol、2×TaqPlantinumPCRMasterMix25μL和去離子水。2×TaqPlantinumPCRMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號KT204。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環(huán)；72℃延伸3min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。上述PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和后續(xù)的基因分型及評估方法，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知常識或者慣用技術(shù)手段進(jìn)行變化或者替換。該試劑盒的價值在于：評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險，從而進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇和用藥預(yù)測，實(shí)現(xiàn)個體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)。實(shí)施例4：本實(shí)施例4中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408，NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914、VAV2基因SNP位點(diǎn)rs679106、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372和IL6基因SNP位點(diǎn)rs2069852。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；rs679106的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.15；rs1429372的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs2069852的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.21。相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實(shí)施例3基本相同。實(shí)施例5：本實(shí)施例5中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408，NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914、VAV2基因SNP位點(diǎn)rs679106、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372、IL6基因SNP位點(diǎn)rs2069852和NAT2基因SNP位點(diǎn)rs1495741。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；rs679106的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.15；rs1429372的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs2069852的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.21；rs1495741的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.36。相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實(shí)施例3基本相同。實(shí)施例6：本實(shí)施例6中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408、NAT2基因SNP位點(diǎn)rs4921914、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372、以及NAT2基因SNP位點(diǎn)rs1041983和rs1495741。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；rs1429372的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs1041983的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.33；rs1495741的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.36。相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實(shí)施例3基本相同。實(shí)施例7：本實(shí)施例7中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點(diǎn)rs9319408、NAT2基因SNP位點(diǎn)rs10103029、XO基因SNP位點(diǎn)rs1429372、以及NAT2基因SNP位點(diǎn)rs1041983和rs1495741。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs10103029的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.27；rs1429372的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs1041983的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.33；rs1495741的特異性擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.36。相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實(shí)施例3基本相同。以上所述實(shí)施例僅為本發(fā)明各技術(shù)特征的任意組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。SEQUENCELISTING<110>北京光大隆泰科技有限責(zé)任公司<120>基于FLT3和NAT2基因的與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的SNP標(biāo)志物、試劑盒及應(yīng)用<160>36<170>PatentInversion3.5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>1acgttggatgccaaagcaagcagtcttttc30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>2acgttggatggacatagggagactgtctca30<210>3<211>19<212>DNA<213>人工引物序列<400>3ggtgactgagtgatgtgag19<210>4<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>4acgttggatgcgacctgcacaaacatatac30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>5acgttggatgtatttctgagcctgccagag30<210>6<211>17<212>DNA<213>人工引物序列<400>6tacactactcagtcccc17<210>7<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>7acgttggatgctccttgagttgagcattac30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>8acgttggatggcacacctacatttaaagtc30<210>9<211>19<212>DNA<213>人工引物序列<400>9ccatgttacagacaaatgc19<210>10<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>10acgttggatgctcatcaacagtgcataacg30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>11acgttggatggaaataccaccttacacctg30<210>12<211>26<212>DNA<213>人工引物序列<400>12ggtttctgtcatctttttataatagc26<210>13<211>29<212>DNA<213>人工引物序列<400>13acgttggatgtatctgtccgcggcgcact29<210>14<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>14acgttggatgtcttcctcactgtgccattc30<210>15<211>15<212>DNA<213>人工引物序列<400>15cagggcgcagggagt15<210>16<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>16acgttggatgtcatacacctgagcatacgg30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>17acgttggatgatgtctcattctggcccaag30<210>18<211>21<212>DNA<213>人工引物序列<400>18cccaggggcagttctcacatc21<210>19<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>19acgttggatgcttccagctgggtgacttag30<210>20<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>20acgttggatgacgtcatttaaccccagcac30<210>21<211>25<212>DNA<213>人工引物序列<400>21ctataaattacttagtcttccacaa25<210>22<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>22acgttggatgcccagacttcagtgtgcaag30<210>23<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>23acgttggatgcagtgcccgcttgctttttc30<210>24<211>20<212>DNA<213>人工引物序列<400>24agtcagtgtgcaagaataca20<210>25<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>25acgttggatgactgtcccatttaagtccag30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>26acgttggatgagtgtttgtccgagacgatg30<210>27<211>23<212>DNA<213>人工引物序列<400>27cctccgtccagaatttgttagcc23<210>28<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>28acgttggatggaatacagttcagccaagtc30<210>29<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>29acgttggatgtaaaggtgcttctggcaagg30<210>30<211>18<212>DNA<213>人工引物序列<400>30gaagccaagtcttttgcc18<210>31<211>28<212>DNA<213>人工引物序列<400>31acgttggatggtggtgtctccaggtcaa28<210>32<211>28<212>DNA<213>人工引物序列<400>32acgttggatggttcgaggttcaagcgta28<210>33<211>25<212>DNA<213>人工引物序列<400>33ggtgttacaatcctcccataaaaat25<210>34<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>34acgttggatgggccctgaagctactgtgaa30<210>35<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>35acgttggatgaggagcctctctcaggaaag30<210>36<211>19<212>DNA<213>人工引物序列<400>36aagctactgtgaatgccca19當(dāng)前第1頁1 2 3