本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性(snp)標(biāo)志物、試劑盒及應(yīng)用，特別是涉及與抗結(jié)核藥物引起的藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的尚未公開的snp標(biāo)志物及其組合、試劑盒以及它們的應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病可謂是傳染病中的一個最大災(zāi)難——全世界每年會有上百萬人因該病致死，是當(dāng)前導(dǎo)致發(fā)展中國家居民(尤其是兒童)死亡的主要疾病之一。藥物化療是當(dāng)前治療結(jié)核病的主要手段，常用的藥物為異煙肼(isoniazid，inh)、利福平(rifampicin，rfp)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，pza)和乙胺丁醇(ethambutol，emb)。雖然藥物化療對于結(jié)核病的臨床治療效果較好，但是在治療過程中出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)(adversedrugreactions，adr)，影響了抗結(jié)核治療效果和患者健康。其中，抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)(anti-tuberculosisdruginducedhepatotoxicity，atdh)是最嚴(yán)重的常見抗結(jié)核adr。既往研究認(rèn)為年齡、體重、性別、合并用藥、營養(yǎng)狀況等因素會影響atdh的發(fā)病。隨著遺傳領(lǐng)域中藥物基因組學(xué)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)在揭示個體不同的表型性狀、以及對于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)的研究中受到人們的重視，有關(guān)snp與atdh個體差異的關(guān)系的研究越來越深入，且多聚焦于n-乙酰轉(zhuǎn)移酶2基因(n-acetyltrangerase2，nat2)。nat2是治療結(jié)核病的常用藥物異煙肼(isoniazid，inh)代謝過程中的主要代謝酶。遺傳學(xué)研究顯示，nat2的乙?；x型(快、中、慢乙?；x型)主要由其編碼區(qū)功能多態(tài)性位點及其單體型(快、中、慢乙?；x型)決定。功能學(xué)實驗證明，部分編碼區(qū)snp突變等位基因相對其野生型等位基因所產(chǎn)生的氨基酸改變，減低了nat2的表達(dá)量和/或其乙?；富钚?。目前已經(jīng)公開的相關(guān)研究有：“n-乙?；D(zhuǎn)移酶2及谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶m1基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物性肝損傷的關(guān)系研究”，安慧茹等，《中國防癆雜志》，2014年1月，第36卷第1期，第14－20頁)公開了nat2的rs1805158、rs1801280、rs72554617、rs1799930、rs1799931多態(tài)性位點與抗結(jié)核藥致肝損傷相關(guān)，統(tǒng)計的患者為接受異煙肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺聯(lián)合治療后造成肝損傷的患者，所使用的方法為對每個snp位點與肝損傷的相關(guān)性進(jìn)行單獨分析，沒有公開將某些snp組成一組時與藥物肝損傷的關(guān)聯(lián)是否更高；wo2015109608a1公開了nat2的rs1041983、rs1495741snp及其組合與抗結(jié)核藥異煙肼、利福平、吡嗪酰胺中任一種或其組合造成的肝損傷相關(guān)，并公開了一些包含nat2rs1041983或rs1495741以及xo基因rs2295475或rs1884752snp的組合與藥物肝損傷的相關(guān)性；cn106119363a公開了n-乙酰轉(zhuǎn)移酶2基因(n-acetyltrangerase2，nat2)的7個snp位點(rs1801279、rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208和rs1799931)的組合可以用于抗結(jié)核藥物肝損傷易感基因型檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供尚未公開的、與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp標(biāo)志物，以更加全面、準(zhǔn)確地分子遺傳標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起的藥物肝毒性反應(yīng)，從而進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇和用藥預(yù)測，實現(xiàn)個體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)。本發(fā)明的目的還在于提供上述snp標(biāo)志物在抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)方面非診斷的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于通過準(zhǔn)確檢測上述與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp標(biāo)志物，以更加全面、準(zhǔn)確評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp標(biāo)志物，所述的snp標(biāo)志物是包括kcne3基因snp位點和nat2基因snp位點的組合，所述的kcne3基因snp位點是rs12272502，所述nat2基因snp位點是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一個或多個。進(jìn)一步地，上述snp標(biāo)志物組合與blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、flt3基因snp位點rs9319408、vav2基因snp位點rs679106、xo基因snp位點rs1429372和il6基因snp位點rs2069852中一個或多個相組合，可以實現(xiàn)更準(zhǔn)確地標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起藥物肝毒性反應(yīng)的目的。更進(jìn)一步地，以上所有情況還可以與其它的nat2基因的與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp位點及其組合(如：nat2基因的snp位點rs1041983或rs1495741，或者兩者的組合)相組合，可以更準(zhǔn)確地標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起藥物肝毒性反應(yīng)。上述snp標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物的引物序列可以分別為：rs12272502的引物序列為seqidno.1和seqidno.2；rs2290714的引物序列為seqidno.4和seqidno.5；rs1031915的引物序列為seqidno.7和seqidno.8；rs9319408的引物序列為seqidno.10和seqidno.11；rs679106的引物序列為seqidno.13和seqidno.14；rs1429372的引物序列為seqidno.16和seqidno.17；rs2069852的引物序列為seqidno.19和seqidno.20；rs4921914的引物序列為seqidno.22和seqidno.23；rs10103029的引物序列為seqidno.25和seqidno.26；rs7816847的引物序列為seqidno.28和seqidno.29；rs1041983的引物序列為seqidno.31和seqidno.32；rs1495741的引物序列為seqidno.34和seqidno.35。進(jìn)一步地，對應(yīng)于上述snp標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特異性延伸引物的引物序列可以分別為：rs12272502的引物序列為seqidno.3；rs2290714的引物序列為seqidno.6；rs1031915的引物序列為seqidno.9；rs9319408的引物序列為seqidno.12；rs679106的引物序列為seqidno.15；rs1429372的引物序列為seqidno.18；rs2069852的引物序列為seqidno.21；rs4921914的引物序列為seqidno.24；rs10103029的引物序列為seqidno.27；rs7816847的引物序列為seqidno.30；rs1041983的引物序列為seqidno.33；rs1495741的引物序列為seqidno.36。本發(fā)明還提供上述snp標(biāo)志物在抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)方面非診斷的應(yīng)用，如應(yīng)用于制備評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒。本發(fā)明還提供了一種評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的至少如下的snp標(biāo)志物：所述的snp標(biāo)志物是包括kcne3基因snp位點和nat2基因snp位點的組合，所述的kcne3基因snp位點是rs12272502，所述nat2基因snp位點是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一個或多個?？蛇x地，該試劑盒含有如下特異性擴(kuò)增引物序列：所述的snp位點rs12272502的引物序列為seqidno.1和seqidno.2；所述的snp位點s4921914的引物序列為seqidno.22和seqidno.23；所述的snp位點rs10103029的引物序列為seqidno.25和seqidno.26；所述的snp位點rs7816847的引物序列為seqidno.28和seqidno.29。更進(jìn)一步地，與上述試劑盒所含特異性擴(kuò)增引物序列相對應(yīng)的特異性延伸引物序列為：所述的snp位點rs12272502的引物序列為seqidno.3；所述的snp位點rs4921914的引物序列為seqidno.24；所述的snp位點rs10103029的引物序列為seqidno.27；所述的snp位點rs7816847的引物序列為seqidno.30。進(jìn)一步地，該評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒還用于檢測與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、flt3基因snp位點rs9319408、vav2基因snp位點rs679106、xo基因snp位點rs1429372和il6基因snp位點rs2069852中的一個或多個。相應(yīng)于此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴(kuò)增引物序列：所述的snp位點rs2290714的引物序列為seqidno.4和seqidno.5；所述的snp位點rs1031915的引物序列為seqidno.7和seqidno.8；所述的snp位點rs9319408的引物序列為seqidno.10和seqidno.11；所述的snp位點rs679106的引物序列為seqidno.13和seqidno.14；所述的snp位點rs1429372的引物序列為seqidno.16和seqidno.17；所述的snp位點rs2069852的引物序列為seqidno.19和seqidno.20。相應(yīng)于此檢測，進(jìn)一步地，與上述試劑盒所含特異性擴(kuò)增引物序列相對應(yīng)的特異性延伸引物序列可以為：所述的snp位點rs2290714的引物序列為seqidno.6；所述的snp位點rs1031915的引物序列為seqidno.9；所述的snp位點rs9319408的引物序列為seqidno.12；所述的snp位點rs679106的引物序列為seqidno.15；所述的snp位點rs1429372的引物序列為seqidno.18；所述的snp位點rs2069852的引物序列為seqidno.21。更進(jìn)一步地，該評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒還用于檢測與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983。相應(yīng)于此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴(kuò)增引物序列：所述的snp位點rs1041983的引物序列為seqidno.31和seqidno.32；所述的snp位點rs1495741的引物序列為seqidno.34和seqidno.35。相應(yīng)于此檢測，進(jìn)一步地，與上述試劑盒所含特異性擴(kuò)增引物序列相對應(yīng)的特異性延伸引物序列可以為：所述的snp位點rs1041983的引物序列為seqidno.33；所述的snp位點rs1495741的引物序列為seqidno.36?？蛇x地，該試劑盒還可以包括相應(yīng)pcr技術(shù)所需的常用試劑，如dntps，mgcl2，雙蒸水，taq酶等，這些常用試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照等)。綜上所述，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了尚未被公開的與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的基于kcne3和nat2基因snp標(biāo)志物組合，從而更加全面、準(zhǔn)確地分子遺傳標(biāo)記抗結(jié)核藥物引起的藥物肝毒性反應(yīng)；此外，將上述未公開的snp標(biāo)志物組合應(yīng)用于評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒中，從而更加全面、準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測，以及分子標(biāo)記輔助選擇和用藥預(yù)測，實現(xiàn)個體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例1研究對象說明：本發(fā)明的研究對象是：2005-2014年在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院住院治療、年齡在0-16歲間的中國漢族結(jié)核病患兒(均是在患兒和家長知情同意的前提下)；并且，他們完全滿足以下3個標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為結(jié)核??；②以標(biāo)準(zhǔn)化療劑量及方案接受抗結(jié)核化療時間超過2周；③基礎(chǔ)肝腎功能正常。其中，結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)是：根據(jù)美國胸科協(xié)會制定的《成人和兒童結(jié)核病診斷和分級標(biāo)準(zhǔn)》和中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組制定的《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案(試行)》進(jìn)行結(jié)核病診斷。結(jié)核病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)具體為：①活動性結(jié)核病接觸史；②ppd試驗陽性；③抗結(jié)核治療有效；④排除其他疾??；滿足①至④中的任意2項，并具有典型臨床癥狀和影像學(xué)證據(jù)，臨床診斷為結(jié)核病。atdh判斷標(biāo)準(zhǔn)是：滿足以下4項中任意1項即可診斷為atdh：①血清alt含量>(2×uln)；alt代表丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；血清alt相應(yīng)的uln＝40iu/l；②血清dbil含量>(2×uln)；dbil代表直接膽紅素；血清dbil相應(yīng)的uln＝6.8μmol/l；③血清ast含量、血清alp含量和血清tbil含量均>(1×uln)，且其中n1項>(2×uln)，n1≥1；ast代表天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，alp代表堿性磷酸酶，tbil代表總膽紅素；血清ast相應(yīng)的uln＝40iu/l，血清alp相應(yīng)的uln＝220iu/l，血清tbil相應(yīng)的uln＝19.0μmol/l；④滿足標(biāo)準(zhǔn)a和標(biāo)準(zhǔn)b：標(biāo)準(zhǔn)a：血清alt含量、血清dbil含量、血清ast含量、血清alp含量和血清tbil含量，上述5項中的n2項>(1×uln)，n2≥1；標(biāo)準(zhǔn)b：具有如下肝毒性疑似癥狀之一：皮膚鞏膜黃染、肝區(qū)不適、惡心、嘔吐、厭食、發(fā)熱、皮疹、瘙癢等肝毒性疑似癥狀。atdh入組標(biāo)準(zhǔn)：①atdh發(fā)生在抗結(jié)核化療開始后；②排除外病毒感染、新生兒黃疸、肝腎基礎(chǔ)疾病及其他疾病引起的atdh；③結(jié)核藥減量或停用后，atdh癥狀減輕；④排除其他藥物致atdh的可能性。滿足①至④四項者即可診斷為atdh。對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：抗結(jié)核化療后，肝功能仍正常者。本實施例1中，使用全基因組關(guān)聯(lián)分析(gemone-wideassociationstudy，gwas)對大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了篩選。其中，基于上述研究對象標(biāo)準(zhǔn)，將385例結(jié)核病患兒分成atdh組和非atdh對照組，atdh組77例，對照組308例。1、關(guān)于gwas全基因組芯片：gwas全基因組芯片數(shù)據(jù)來自于前期的中國漢族人群結(jié)核病易感研究，通過質(zhì)控分析，最終得到了691388個snp位點的分型結(jié)果。芯片執(zhí)行情況如下：1)gwas芯片類型：illumina公司humanomnizhonghua-8beadchip；2)gwas芯片的數(shù)據(jù)分析方法：plink軟件。芯片共得到900，015個snp位點的分型結(jié)果，經(jīng)過檢出率、hardy-weinberger平衡(hwe)、樣本親緣關(guān)系以及主成分分析等質(zhì)控，最終得到691388個snp位點用于后續(xù)分析。(1)檢出率標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定和hwe分析：snp分型數(shù)據(jù)需符合以下標(biāo)準(zhǔn)，才能納入后續(xù)分析：樣品檢出率＞99％、snp位點檢出率＞95％、對照組hwe的p值＞0.0001和最小等位基因頻率＞0.01。除此之外，采用genomestudiov3.0(illumina)軟件進(jìn)行snp位點散點圖的篩查，舍棄聚類不良的snp位點。(2)樣本親緣關(guān)系分析：為明確個體間是否有血緣關(guān)系，采用血緣同源(ibd)等位基因的概率分布進(jìn)行分析。在分析中發(fā)現(xiàn)，病例組和對照組分別有一對樣本ibd的pi-hat＞0.05，因此，對具有血緣關(guān)系的病例和對照及其相對應(yīng)的對照和病例樣本給予刪除。另外，我們隨機(jī)選擇15個樣本進(jìn)行重現(xiàn)性的檢測，其基因分型吻合率為99.99％，證明：芯片檢測結(jié)果穩(wěn)定，snp位點基因分型數(shù)據(jù)可靠。(3)主成分分析：整合千人基因組計劃中非洲人(yri)、歐洲人(ceu)，日本人(jpt)、中國北方人(chb)和中國南方人(chs)的數(shù)據(jù)以及我們芯片數(shù)據(jù)，并對整合數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，確保芯片檢測的病例和對照組樣本具有中國人群的遺傳特征，遺傳背景一致。(4)對于芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行人群分層分析：為研究樣本的人群分層情況，進(jìn)行膨脹系數(shù)(λgc)的分析。λgc為1.017，說明我們很好地削減了人群分層對于結(jié)果的影響。2、使用上述gwas全基因組芯片對大樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：對于芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析：對上述385例atdh病例及對照樣本的snp位點分型結(jié)果進(jìn)行了數(shù)據(jù)調(diào)取。采用plink軟件對385例atdh和非atdh對照兒童的691388個snp位點進(jìn)行基因型比較分析，采用年齡性別對數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正，并結(jié)合離散關(guān)聯(lián)決策算法對數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，得到snp位點與atdh易感相關(guān)性的結(jié)果。選取的atdh關(guān)聯(lián)snp位點or值和p值如表1所示：表1：atdh關(guān)聯(lián)snp位點or值和p值snp位點基因or值(95％ci)p值rs6696544camta12.412(1.612-3.611)1.87e-05rs12272502kcne32.228(1.494-3.324)8.63e-05rs2290714blnk2.281(1.535-3.391)4.54e-05rs1031915ppp2r2b2.197(1.479-3.263)9.7e-05rs9319408flt32.832(1.455-5.51)2.18e-03rs679106vav22.938(1.779-4.852)2.56e-05rs1429372xo1.821(1.231-2.693)2.68e-03rs2069852il61.540(1.053-2.254)2.62e-02rs4921914nat23.544(2.289-5.489)1.42e-08rs10103029nat23.589(2.296-5.611)2.09e-08rs7816847nat23.408(2.188-5.307)5.82e-08rs1041983nat23.434(2.236-5.273)1.73e-08rs1495741nat23.522(2.277-5.446)1.52e-08從表1中可以看出，檢測結(jié)果共涉及9個基因的13個snp位點。其中，camta1基因snp位點rs6696544、kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、flt3基因snp位點rs9319408、vav2基因snp位點rs679106、xo基因snp位點rs1429372、il6基因snp位點rs2069852、以及nat2基因snp位點rs4921914、rs10103029和rs7816847，均為首次發(fā)現(xiàn)與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp位點。實施例2：研究對象說明詳見實施例1。本實施例2中，針對實施例1中所獲得的13個snp位點，另外選取582例樣本(與上述實施例1中的385例無重合)(atdh組122例，非atdh對照組460例)，進(jìn)行質(zhì)譜驗證。1、實驗步驟：1)引物設(shè)計及合成：根據(jù)snp位點序列信息，使用引物設(shè)計軟件assaydesign3.1設(shè)計pcr反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并交由生物公司合成。各snp位點對應(yīng)的引物見表2。其中，forwardprimer為上游引物，reverseprimer為下游引物，extendedprimer為延伸引物。表2：實施例1中所獲得的13個snp位點所對應(yīng)的引物：2)dna提取：使用成品化試劑盒，提取血樣、組織、細(xì)胞、唾液中的dna。使用nanodrop2000儀器進(jìn)行od值檢測，1.25％瓊脂糖凝膠電泳檢測，dna質(zhì)檢合格，轉(zhuǎn)移至96孔板，-20℃儲存?zhèn)溆谩?)系統(tǒng)基因分型步驟：①pcr擴(kuò)增反應(yīng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的dna區(qū)域。每個pcr循環(huán)，反應(yīng)混合體系都在模板變性、引物退火和引物延伸三種不同溫度下依序溫育。該過程可使用一種可編程序的溫度熱循環(huán)儀而達(dá)到自動化。②產(chǎn)物堿性磷酸酶處理：在pcr反應(yīng)結(jié)束后，將pcr產(chǎn)物用sap(shrimpalkalinephosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dntps。③單堿基延伸反應(yīng)：在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積9μl。④樹脂純化：⑤芯片點樣：采用massarraynanodispenserrs1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至spectrochipbioarray上。⑥質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)輸出：將點樣后的spectrochip芯片使用maldi-tof質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用typer4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性，將結(jié)果保存并進(jìn)行分析。以上①至⑥均為本領(lǐng)域質(zhì)譜檢測的常規(guī)方法，這里不再冗述。2、多位點聯(lián)合風(fēng)險評估：采用以or值作為權(quán)重的遺傳風(fēng)險評分(oddsratioweightedgeneticriskscore，or-grs)方法對以上582例樣本進(jìn)行多位點聯(lián)合風(fēng)險評估計算。該方法大致可以分為兩步：a)所有snp位點的or值*突變基因數(shù)量，然后求和，即：公式中，g表示一組遺傳易感位點風(fēng)險等位基因數(shù)的集合向量(gi表示第i個遺傳易感位點的風(fēng)險等位基因的數(shù)量)；b)對所有樣本的求和數(shù)值計算敏感性和特異性，繪制roc曲線，并計算曲線下面積，即：auc值。有關(guān)or-grs的原理和評分方法具體參見文獻(xiàn)“遺傳風(fēng)險評分的原理與方法”(王鋮，戴俊程，孫義民，謝蘭，潘良斌，胡志斌，沈洪兵，2015，[j].中華流行病學(xué)雜志，36(10)：1062-1064)。相關(guān)snp位點組合的auc值的結(jié)果如下：1)根據(jù)上述方法計算出來的kcne3基因snp位點rs12272502與nat2基因snp位點rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一個組合的auc值，以及該組合與其它6個基因snp位點中至少一個相組合的auc值，如表3所示。其中，所述的其它6個基因snp位點分別為blnk基因位點(rs2290714)、ppp2r2b基因位點(rs1031915)、flt3基因位點(rs9319408)、vav2基因位點(rs679106)、xo基因位點(rs1429372)和il6基因位點(rs2069852)。表3中的方案分別為：方案1：kcne3基因snp位點rs12272502與nat2基因snp位點rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一個組合；方案2：上述方案1中kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他6個snp位點中的任意一個位點的組合；方案3：上述方案1中kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他6個snp位點中的任意二個位點的組合；方案4：上述方案1中kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他6個snp位點中的任意三個位點的組合；方案5：上述方案1中kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他6個snp位點中的任意四個位點的組合；方案6：上述方案1中kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他6個snp位點中的任意五個位點的組合；方案7：上述方案1中kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他所有六個snp位點的組合。表3中示出的是針對每個組合方案所測的最大auc值(表3中auc值上帶有max下標(biāo)的組合)、最小auc值(表3中auc值上帶有min下標(biāo)的組合)，以及若干位于最大值和最小值之間的、隨機(jī)抽取的組合的auc值。表3：基于kcne3和nat2基因的snp位點組合、以及該組合與其它6個基因snp位點組合的auc值：2)上述相關(guān)snp位點組合的auc值的結(jié)果1)中所有情況與nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983(表4中表示為nat2*)組合的auc值，如表4所示。表4中的方案分別為：方案1：上述結(jié)果1)中的方案1所涵蓋的所有組合與nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合；方案2：上述結(jié)果1)中的方案2-7所涵蓋的所有組合與nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合；表4中示出的是針對每個組合方案所測的最大auc值(表4中auc值上帶有“max”下標(biāo)的組合)、最小auc值(表4中auc值上帶有“min”下標(biāo)的組合)，以及若干位于最大值和最小值之間的、隨機(jī)抽取的組合的auc值。表4：上述相關(guān)snp位點組合的auc值的結(jié)果1)中所有情況與nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合的auc值：3)比較例：比較例見表5。表5中示出的是本發(fā)明所檢測出的nat2基因的5個與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp位點各自及其組合的auc值，以及nat2基因的snp位點與xo基因和/或il6基因的snp位點的組合的auc值。表5：作為比較例的auc值：基于kcne3基因snp位點rs12272502為首次發(fā)現(xiàn)與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp位點，且在表3和表4中的方案1與表5的auc值的比較中，kcne3和nat2基因的snp位點組合的auc值明顯高于nat2基因的5個與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp位點各自及其組合的auc值，可以看出kcne3和nat2基因的snp位點組合為更全面、準(zhǔn)確地評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險提供了可能性。從表3中的方案2-7與表5的auc值的比較中可以看出，進(jìn)一步地，kcne3和nat2基因的snp位點組合與本發(fā)明中其它6個基因snp位點中至少一個相組合的auc值顯著高于比較例(表5)中的組合方案，尤其當(dāng)組合方案是kcne3基因snp位點與nat2基因snp位點的組合與其他6個snp位點中的至少任意二個位點的組合(表3中的方案3-7)時，其auc值明顯高于比較例(表5)中的組合方案的auc值，從而表明，這些方案可以實現(xiàn)更全面、更準(zhǔn)確地評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的目的。更進(jìn)一步地，從表4中的方案2與表5的auc值的比較中可以看出，在表3中方案2-7所涵蓋的所有組合的基礎(chǔ)上，再與nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合(即表4中的方案2)而形成的組合中，部分組合可以達(dá)到更高的auc值，以更準(zhǔn)確地評估抗結(jié)核藥物引起藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險。實施例3：本實施例3中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測kcne3基因snp位點rs12272502和nat2基因snp位點rs4921914。該試劑盒含有所需檢測snp位點的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，snp位點rs12272502的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；snp位點rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24；該試劑盒還包括相應(yīng)pcr技術(shù)所需的常用試劑：(如dntps，mgcl2，雙蒸水，taq酶等，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照等)。例如：本實施例3中的試劑盒試劑包括：dntps(25mm)，mgcl2(25mm)，primermix(500nm)，hotstartaq(5u/μl)，雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：1.85μl雙蒸水，0.1μldntp(25mm)，0.325μlmgcl2(25mm)，1μlprimermix(500nm)，0.625μlpcrbuffer(1.25x)，0.1μlhotstartaq(5u/μl)，加入1μl模板dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環(huán)；72℃延伸3min。在pcr反應(yīng)結(jié)束后，將pcr產(chǎn)物用sap(shrimpalkalinephosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dntps。延伸反應(yīng)體系：0.041μliplex酶(1x)，0.94μlprimermix，0.619μl雙蒸水，0.2μliplexterminationmix(1x)，0.2μliplexbufferplus(0.222x)，7μlsap處理后pcr產(chǎn)物。延伸反應(yīng)條件：94℃變性30s；94℃5s；52℃5s，80℃5s，40個循環(huán)；72℃延伸3min。純化后產(chǎn)物使用sequenommassarray系統(tǒng)進(jìn)行基因分型?；蛘撸琾cr擴(kuò)增的反應(yīng)體系的組成如下(50μl):基因組dna0.50ng、上游引物30pmol、下游引物30pmol、2×taqplantinumpcrmastermix25μl和去離子水。2×taqplantinumpcrmastermix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號kt204。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環(huán)；72℃延伸3min。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。上述pcr反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和后續(xù)的基因分型及評估方法，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知常識或者慣用技術(shù)手段進(jìn)行變化或者替換。該試劑盒的價值在于：評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險，從而進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇和用藥預(yù)測，實現(xiàn)個體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)。實施例4：本實施例4中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測kcne3基因snp位點rs12272502，nat2基因snp位點rs4921914和ppp2r2b基因snp位點rs1031915。該試劑盒的試劑與實施例3中基本相同，區(qū)別在于，該試劑盒還含有所需檢測ppp2r2b基因snp位點rs1031915的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，rs1031915的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.7和seqidno.8；其特異性延伸引物序列為seqidno.9。相應(yīng)的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實施例3基本相同。實施例5：本實施例5中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測kcne3基因snp位點rs12272502、nat2基因snp位點rs4921914、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、vav2基因snp位點rs679106、flt3基因snp位點rs9319408、xo基因snp位點rs1429372、il6基因snp位點rs2069852和nat2基因snp位點rs1041983。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因snp位點的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因snp位點的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物分別如下：rs12272502的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24；rs2290714的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.4和seqidno.5；其特異性延伸引物序列為seqidno.6；rs1031915的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.7和seqidno.8；其特異性延伸引物序列為seqidno.9；rs679106的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.13和seqidno.14；其特異性延伸引物序列為seqidno.15；rs9319408的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.10和seqidno.11；其特異性延伸引物序列為seqidno.12；rs1429372的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.16和seqidno.17；其特異性延伸引物序列為seqidno.18；rs2069852的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.19和seqidno.20；其特異性延伸引物序列為seqidno.21；rs1041983的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.31和seqidno.32；其特異性延伸引物序列為seqidno.33。相應(yīng)的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實施例3基本相同。實施例6：本實施例6中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測kcne3基因snp位點rs12272502、nat2基因snp位點rs4921914、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、vav2基因snp位點rs679106、flt3基因snp位點rs9319408、xo基因snp位點rs1429372、il6基因snp位點rs2069852和nat2基因snp位點rs1495741。相比于實施例5，基于本實施例6的試劑盒需檢查的snp標(biāo)志物與其只區(qū)別于，本實施例6中檢測的nat2基因snp位點為rs1495741，而不再是rs1041983。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑與實施例5中的基本相同，區(qū)別只在于：其含有snp位點rs1495741的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物，替代rs1041983的相關(guān)試劑。其中，rs1495741的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.34和seqidno.35；其特異性延伸引物序列為seqidno.36。相應(yīng)的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實施例3基本相同。實施例7：本實施例7中，制作評估抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)風(fēng)險的試劑盒，用于檢測kcne3基因snp位點rs12272502、nat2基因snp位點rs7816847和rs4921914、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、il6基因snp位點rs2069852和nat2基因snp位點rs1495741。相應(yīng)地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因snp位點的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因snp位點的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物分別如下：rs12272502的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；rs4921914的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24；rs7816847的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.28和seqidno.29；其特異性延伸引物序列為seqidno.30；rs2290714的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.4和seqidno.5；其特異性延伸引物序列為seqidno.6；rs1031915的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.7和seqidno.8；其特異性延伸引物序列為seqidno.9；rs2069852的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.19和seqidno.20；其特異性延伸引物序列為seqidno.21；rs1495741的特異性擴(kuò)增引物序列為seqidno.34和seqidno.35；其特異性延伸引物序列為seqidno.36。相應(yīng)的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實施例3基本相同。以上所述實施例僅為本發(fā)明各技術(shù)特征的任意組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。sequencelisting<110>北京光大隆泰科技有限責(zé)任公司<120>基于kcne3和nat2基因的與抗結(jié)核藥物肝毒性反應(yīng)相關(guān)的snp標(biāo)志物、試劑盒及應(yīng)用<160>36<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>1acgttggatgccaaagcaagcagtcttttc30<210>2<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>2acgttggatggacatagggagactgtctca30<210>3<211>19<212>dna<213>人工引物序列<400>3ggtgactgagtgatgtgag19<210>4<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>4acgttggatgcgacctgcacaaacatatac30<210>5<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>5acgttggatgtatttctgagcctgccagag30<210>6<211>17<212>dna<213>人工引物序列<400>6tacactactcagtcccc17<210>7<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>7acgttggatgctccttgagttgagcattac30<210>8<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>8acgttggatggcacacctacatttaaagtc30<210>9<211>19<212>dna<213>人工引物序列<400>9ccatgttacagacaaatgc19<210>10<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>10acgttggatgctcatcaacagtgcataacg30<210>11<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>11acgttggatggaaataccaccttacacctg30<210>12<211>26<212>dna<213>人工引物序列<400>12ggtttctgtcatctttttataatagc26<210>13<211>29<212>dna<213>人工引物序列<400>13acgttggatgtatctgtccgcggcgcact29<210>14<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>14acgttggatgtcttcctcactgtgccattc30<210>15<211>15<212>dna<213>人工引物序列<400>15cagggcgcagggagt15<210>16<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>16acgttggatgtcatacacctgagcatacgg30<210>17<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>17acgttggatgatgtctcattctggcccaag30<210>18<211>21<212>dna<213>人工引物序列<400>18cccaggggcagttctcacatc21<210>19<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>19acgttggatgcttccagctgggtgacttag30<210>20<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>20acgttggatgacgtcatttaaccccagcac30<210>21<211>25<212>dna<213>人工引物序列<400>21ctataaattacttagtcttccacaa25<210>22<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>22acgttggatgcccagacttcagtgtgcaag30<210>23<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>23acgttggatgcagtgcccgcttgctttttc30<210>24<211>20<212>dna<213>人工引物序列<400>24agtcagtgtgcaagaataca20<210>25<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>25acgttggatgactgtcccatttaagtccag30<210>26<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>26acgttggatgagtgtttgtccgagacgatg30<210>27<211>23<212>dna<213>人工引物序列<400>27cctccgtccagaatttgttagcc23<210>28<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>28acgttggatggaatacagttcagccaagtc30<210>29<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>29acgttggatgtaaaggtgcttctggcaagg30<210>30<211>18<212>dna<213>人工引物序列<400>30gaagccaagtcttttgcc18<210>31<211>28<212>dna<213>人工引物序列<400>31acgttggatggtggtgtctccaggtcaa28<210>32<211>28<212>dna<213>人工引物序列<400>32acgttggatggttcgaggttcaagcgta28<210>33<211>25<212>dna<213>人工引物序列<400>33ggtgttacaatcctcccataaaaat25<210>34<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>34acgttggatgggccctgaagctactgtgaa30<210>35<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>35acgttggatgaggagcctctctcaggaaag30<210>36<211>19<212>dna<213>人工引物序列<400>36aagctactgtgaatgccca19當(dāng)前第1頁12