本發(fā)明屬于分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種專用于乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因的核酸序列的檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，全球每年約有120萬(wàn)名婦女患乳腺癌，50萬(wàn)人死于乳腺癌。在我國(guó)乳腺癌的平均死亡率為2.61/10萬(wàn)，以沿海幾個(gè)城市的死亡率顯著偏高，城市的死亡率比農(nóng)村高出1.4倍。我國(guó)近幾年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，盡管臨床研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)步，但是其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然很高。近20年來，以手術(shù)為中心，化療、放療、內(nèi)分泌治療為輔助的多學(xué)科綜合治療模式得到長(zhǎng)足的發(fā)展，使乳腺癌的復(fù)發(fā)和死亡率顯著降低，但仍然缺乏有效的方法能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)并給予相應(yīng)的治療。

21基因復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是一種根據(jù)21個(gè)基因聯(lián)合檢測(cè)，通過一定公式計(jì)算復(fù)發(fā)分?jǐn)?shù)來判斷乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法。其由16個(gè)癌癥相關(guān)基因和5個(gè)參考基因組成。癌癥相關(guān)基因大體分為5類，分別為增殖相關(guān)基因(ki67、stk15、survivin、ccnb1和mybl2)、表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)基因(grb7和her2)、激素相關(guān)基因(er、pgr、bcl2和scube2)、浸潤(rùn)相關(guān)基因(mmp11和ctsl2)和3個(gè)未分類基因(gstm1、cd68和bag1)。5個(gè)參考基因分別為actb、gapdh、rplpo、gus和tfrc。上述基因的選擇是根據(jù)癌癥相關(guān)文獻(xiàn)、微陣列數(shù)據(jù)資料、基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分子生物學(xué)資料選定250個(gè)基因作為候選基因。根據(jù)3個(gè)獨(dú)立的臨床試驗(yàn)共447例患者的研究結(jié)果，選取與遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)顯著相關(guān)的基因，對(duì)250個(gè)候選基因進(jìn)一步篩選，最終確定了上述16個(gè)癌癥相關(guān)基因，并確定了5個(gè)管家基因作為參考基因。該項(xiàng)檢測(cè)適用于淋巴結(jié)陰性、雌激素受體陽(yáng)性且將來可能接受三苯氧胺治療的臨床i、ⅱ期乳腺癌患者。通過分析21個(gè)基因的表達(dá)來確定rs分值(0～100分)，rs<18、18≤rs≤30、rs≥31分別為低、中、高?；颊?。2008年，《美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(nccn)乳腺癌臨床實(shí)踐指南》指出，對(duì)于er陽(yáng)性、her2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性、腫瘤大小為0.6～1.0cm的中低分化或伴不良預(yù)后因素者，或腫瘤>1cm者，考慮應(yīng)用rs對(duì)患者行進(jìn)一步分析，對(duì)高危者予以術(shù)后輔助化療(2b類)。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)(real-timequantitativepolymerasechainreaction簡(jiǎn)稱realtimepcr)是在定性pcr技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的dna(或cdna)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)dna/rna模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、成本低廉等特點(diǎn)。目前已有多種運(yùn)用定量pcr技術(shù)的試劑盒應(yīng)用于臨床疾病相關(guān)的病原體檢測(cè)、基因分型、突變研究等。

本發(fā)明利用熒光定量的優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)同時(shí)對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，從而考慮是否需要輔助化療等臨床治療措施。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開發(fā)一種靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的新型檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因快速檢測(cè)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足。

一種乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因檢測(cè)引物，包括seqidno.：1～42所示的核苷酸序列。

具體的引物擴(kuò)增信息如下：

(1)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ki67基因的特異性引物，如seqidno：1和seqidno：2所示；

(2)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因stk15基因的特異性引物，如seqidno：3和seqidno：4所示；

(3)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因survivin基因的特異性引物，如seqidno：5和seqidno：6所示；

(4)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ccnb1基因的特異性引物，如seqidno：7和seqidno：8所示；

(5)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因mybl2基因的特異性引物，如seqidno：9和seqidno：10所示；

(6)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因grb7基因的特異性引物，如seqidno：11和seqidno：12所示；

(7)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因her2基因的特異性引物，如seqidno：13和seqidno：14所示；

(8)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因er基因的特異性引物，如seqidno：15和seqidno：16所示；

(9)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因pgr基因的特異性引物，如seqidno：17和seqidno：18所示；

(10)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因bcl2基因的特異性引物，如seqidno：19和seqidno：20所示；

(11)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因scube2基因的特異性引物，如seqidno：21和seqidno：22所示引物對(duì)；

(12)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因mmp11基因的特異性引物，如seqidno：23和seqidno：24所示；

(13)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ctsl2基因的特異性引物，如seqidno：25和seqidno：26所示引物對(duì)；

(14)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因gstm1基因的特異性引物，如seqidno：27和seqidno：28所示引物對(duì)；

(15)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因cd68基因的特異性引物，如seqidno：29和seqidno：30所示；

(16)擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因bag1基因的特異性引物，如seqidno：31和seqidno：32所示；

(17)擴(kuò)增參考基因actb基因的特異性引物，如seqidno：33和seqidno：34所示；

(18)擴(kuò)增參考基因gapdh基因的特異性引物，如seqidno：35和seqidno：36所示；

(19)擴(kuò)增參考基因rplpo基因的特異性引物，如seqidno：37和seqidno：38所示；

(20)擴(kuò)增參考基因gus基因的特異性引物，如seqidno：39和seqidno：40所示；

(21)擴(kuò)增參考基因tfrc基因的特異性引物，如seqidno：41和seqidno：42所示。

一種乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中包括seqidno.：1～42所示的引物。

上述乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因檢測(cè)引物在乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)石蠟組織rna提??；

(2)逆轉(zhuǎn)錄；

(3)熒光定量pcr擴(kuò)增；

(4)結(jié)果分析：判斷復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)具體按照如下標(biāo)準(zhǔn)：低風(fēng)險(xiǎn)：rs≤18；中風(fēng)險(xiǎn)：18＜rs＜31；高風(fēng)險(xiǎn)：rs≥31。

步驟(2)中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μl，其中，模板rna11μl，rt酶1μl，ri酶1μl，dntp2μl，5×buffer4μl，隨機(jī)引物1μl；

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃30min，95℃5min。

步驟(3)中，熒光定量pcr擴(kuò)增體系為：pcr反應(yīng)體系為20μl，其中2×mix10μl，上游與下游混合引物(10μmol/l)0.4μl，模板rna2μl，焦碳酸二乙酯(depc)處理水7.6μl；

熒光定量pcr反應(yīng)條件為：94℃20s，60℃15s，延伸72度15s，熒光采集點(diǎn)在60℃，反應(yīng)體積設(shè)置為20μl。

所述核酸序列由對(duì)16個(gè)癌癥相關(guān)基因和5個(gè)參考基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)的21對(duì)引物組成。所述癌癥相關(guān)基因大體分為5類，分別為增殖相關(guān)基因(ki67、stk15、survivin、ccnb1和mybl2)、表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)基因(grb7和her2)、激素相關(guān)基因(er、pgr、bcl2和scube2)、浸潤(rùn)相關(guān)基因(mmp11和ctsl2)和3個(gè)未分類基因(gstm1、cd68和bag1)。所述5個(gè)參考基因分別為actb、gapdh、rplpo、gus和tfrc。

有益效果：

(1)本發(fā)明利用熒光定量的優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明所涉及的21對(duì)引物產(chǎn)出片段都在150bp以內(nèi)，大大提高了石蠟標(biāo)本提取mrna逆轉(zhuǎn)錄后pcr的效率。

(3)本發(fā)明所涉及的21對(duì)引物在進(jìn)行pcr時(shí)其擴(kuò)增條件一致，將大大縮短了檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)同時(shí)對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，從而考慮是否需要輔助化療等臨床治療措施。該試劑盒及技術(shù)方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，通過熒光定量能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因，為臨床治療提供參考。

附圖說明

圖1為2例乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因檢測(cè)電泳圖，在同一條件下均能擴(kuò)增出，且均沒有引物二聚體的形成。

圖2為1例乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因檢測(cè)的熒光定量pcr圖，其ct值在25-40之間，圖中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)為熒光值。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：檢測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因檢測(cè)的基因的核酸序列。

21對(duì)特異性引物委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成：

seqidno：15′-cggactttgggtgcgactt-3′

seqidno：25′-ttacaactcttccactgggacgat-3′

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實(shí)施例2：檢測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因檢測(cè)的方法。

儀器：roche480熒光定量pcr檢測(cè)儀，beckman22r臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)，eppendorf5810r臺(tái)式冷凍離心機(jī)，太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司wh-866型渦旋振蕩器。

(1)石蠟組織rna提取試劑

石蠟組織rna的抽提按照qiagen生物公司生產(chǎn)的石蠟組織rna抽提試劑盒說明書提取，得到組織rna備用。

(2)逆轉(zhuǎn)錄，試劑購(gòu)自thermo公司

反應(yīng)體系為20μl體系，其中模板rna11μl，rt酶1μl，ri酶1μl，dntp2μl，5×buffer4μl，隨機(jī)引物1μl；反應(yīng)條件：42℃30min，95℃5min。

一個(gè)標(biāo)本制備3管。

(3)熒光定量pcr，試劑購(gòu)自thermo公司。

反應(yīng)體系為20μl，其中2×mix10μl，上游與下游混合引物(20μmol/l)0.4μl，模板rna2μl，焦碳酸二乙酯(depc)處理水7.6μl。

(a)配置反應(yīng)液：從-20℃冰箱取出試劑盒的各組分，室溫融化，放冰盒上備用。加樣前10分鐘之內(nèi)，按檢測(cè)樣本數(shù)配置pcr反應(yīng)液xμl：

x＝(10μl2×mix+0.4μl上下游引物+7.6μldepc水)×(n份樣本+1份空白對(duì)照)×2。

一對(duì)引物配制一管總反應(yīng)體系，振蕩混勻后，2000rpm離心5s，按每人份18μl分裝到96孔pcr反應(yīng)板中，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)2次，傳至樣本制備區(qū)備用。

(b)加樣：向分裝好試劑的反應(yīng)孔中，分別加入模板2μl，空白對(duì)照孔加入2μl雙蒸水，加樣過程要求冰上操作。貼好封口膜，3000rpm離心30s，放入儀器進(jìn)樣槽。

(c)rt-pcr擴(kuò)增：roche480熒光定量pcr儀同時(shí)進(jìn)行乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因檢測(cè)，反應(yīng)條件如下：94℃5s，55℃35s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熒光采集點(diǎn)在55℃，反應(yīng)體積設(shè)置為20μl。保存文件，運(yùn)行。

(d)結(jié)果分析，具體包括如下步驟：

roche480熒光pcr檢測(cè)儀點(diǎn)擊分析，本產(chǎn)品屬于熒光檢測(cè)，熒光信號(hào)收集時(shí)設(shè)在55℃。選取定量模式，進(jìn)入分析窗口，選定噪音線項(xiàng)，閾值設(shè)定為剛好超過無規(guī)則的噪音線的最高點(diǎn)(可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整)，且陽(yáng)性曲線無拐點(diǎn)，保證噪音線項(xiàng)下的數(shù)值和分析項(xiàng)下的域值一致。每次實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照孔無ct值，結(jié)果合格。點(diǎn)擊計(jì)算，自動(dòng)計(jì)算得到每個(gè)測(cè)試的ct值。

(3)根據(jù)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估公式，將步驟(2)所得的樣本的ct值代入公式并加以計(jì)算得出一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值rs(復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，從0至100范圍。)，判斷復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)具體按照如下標(biāo)準(zhǔn)：

低風(fēng)險(xiǎn)：rs≤18；中風(fēng)險(xiǎn)：18＜rs＜31；高風(fēng)險(xiǎn)：rs≥31

以下是10個(gè)標(biāo)本的檢測(cè)數(shù)據(jù)，同時(shí)采用乳腺癌21基因檢測(cè)pcr芯片(購(gòu)自上海杏園生物科技有限公司？)做比較：

根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，就可預(yù)測(cè)出乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)程度，其中有3個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)，7個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)。且與基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致。

綜上所述，本發(fā)明利用熒光定量的優(yōu)點(diǎn)，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)同時(shí)對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的21基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；本試劑盒具有操作簡(jiǎn)便快捷、靈敏度和特異性高、穩(wěn)定、及時(shí)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，能較好滿足乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的臨床應(yīng)用，能降低無效用藥，提高用藥準(zhǔn)確率，減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，延長(zhǎng)患者生命作出一份貢獻(xiàn)。

sequencelisting

<110>溫州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

<120>一種乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估21基因檢測(cè)引物及其應(yīng)用

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<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因stk15基因的下游引物

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<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ccnb1基因的上游引物

<400>7

ttcaggttgttgcaggagac20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ccnb1基因的下游引物

<400>8

catcttcttgggcacacaat20

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因mybl2基因的上游引物

<400>9

gccgagatcgccaagatg18

<210>10

<211>27

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因mybl2基因的下游引物

<400>10

cttttgatggtagagttccagtgattc27

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因grb7基因的引物

<400>11

ccatctgcatccatcttgtt20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因grb7基因的引物

<400>12

ggccaccagggtattatctg20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因her2基因的上游引物

<400>13

cggtgtgagaagtgcagcaa20

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因her2基因的下游引物

<400>14

cctctcgcaagtgctccat19

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tgtccagccaccaaccagtg

<400>15

tgtccagccaccaaccagtg20

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因er基因的下游引物

<400>16

ccctcctcttcggtcttttcg21

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因pgr基因的上游引物

<400>17

gcatcaggctgtcattatgg20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因pgr基因的下游引物

<400>18

agtagttgtgctgcccttcc20

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因bcl2基因的的上游引物

<400>19

atcgccctgtggatgactgag21

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因bcl2基因的下游引物

<400>20

atgctggggccgtacagttc20

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因scube2基因的上游引物

<400>21

tgacaatcagcacacctgcat21

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因scube2基因的下游引物

<400>22

tgtgactacagccgtgatcctta23

<210>23

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因mmp11基因的上游引物

<400>23

cccagggccacatttggtt19

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因mmp11基因的下游引物

<400>24

ggactggcttttcaccgtcgt21

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ctsl2基因的上游引物

<400>25

tgaaagcagtcgcaactgtgg21

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因ctsl2基因的下游引物

<400>26

cgaatttgctccttcaaagcc21

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因gstm1基因的上游引物

<400>27

gggacgctcctgattatgac20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因gstm1基因的下游引物

<400>28

gtgagccccatcaatcaagt20

<210>29

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因cd68基因的上游引物

<400>29

gcagcacagtggacattctcg21

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因cd68基因的下游引物

<400>30

aactgaagctctgccccagg20

<210>31

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因bag1基因的上游引物

<400>31

cgttgtcagcacttggaatacaa23

<210>32

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增癌癥相關(guān)基因bag1基因的下游引物

<400>32

gttcaacctcttcctgtggactgt24

<210>33

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因actb基因的上游引物

<400>33

ttccttcctgggcatggagtc21

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因actb基因的下游引物

<400>34

ggtctttgcggatgtccacg20

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因gapdh基因的上游引物

<400>35

acagtcagccgcatcttctt20

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因gapdh基因的下游引物

<400>36

acgaccaaatccgttgactc20

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因rplpo基因的上游引物

<400>37

gtgaggtcctccttggtgaa20

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因rplpo基因的下游引物

<400>38

gtgaggtcctccttggtgaa20

<210>39

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因gus基因的上游引物

<400>39

tcccacctagaatctgctggc21

<210>40

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因gus基因的下游引物

<400>40

cacatacggagcccccttgt20

<210>41

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因tfrc基因的上游引物

<400>41

gccaactgctttcatttgtg20

<210>42

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴(kuò)增參考基因tfrc基因的下游引物

<400>42

actcaggcccatttccttta20