本發(fā)明屬于功能基因組學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于基因?qū)脖磉_(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)解析玉米籽粒類胡蘿卜代謝調(diào)控機(jī)制的方法。

背景技術(shù)：

玉米是一種類胡蘿卜素含量豐富的作物，在主要的糧食作物中只有玉米含有維生素a源和對(duì)人體有益的葉黃素類的類胡蘿素，動(dòng)物自身無法合成類胡蘿卜素，須從食物中獲取。玉米籽粒中主要包括五種類胡蘿素：葉黃素，玉米黃素，β-隱黃質(zhì)，α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，約95%存儲(chǔ)在胚乳中，2-4%存儲(chǔ)在玉米麩皮中，胚中總類胡蘿卜素的含量?jī)H占1%。玉米中類胡蘿卜素的累積從授粉后10-15天開始，黃色籽粒玉米類胡蘿卜素含量豐富并且遺傳力廣泛，是開發(fā)高維生素a源的良好材料。長(zhǎng)期以來類胡蘿素含量等品質(zhì)性狀在育種中并未被受到重視。據(jù)west統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：全球110多個(gè)國(guó)家，約有1億多兒童和700萬左右的孕婦受到維生素a缺乏的影響，每年有超過25萬的兒童因?yàn)榫S生素a缺乏失明，其中一半的失明兒童在1年內(nèi)死亡。維生素a對(duì)視力和細(xì)胞的分化是必要的，嚴(yán)重的缺乏會(huì)導(dǎo)致夜盲以至于失明，發(fā)育緩慢，損害黏膜組織以及生殖紊亂。發(fā)展中國(guó)家是維生素a缺乏較為嚴(yán)重的地區(qū)之一。解決營(yíng)養(yǎng)不良帶來的影響，對(duì)廣大發(fā)展中國(guó)家來仍是一大挑戰(zhàn)。

因此，解析類胡蘿卜代謝途徑中關(guān)鍵基因之間的調(diào)控關(guān)系，結(jié)合關(guān)鍵基因?qū)︻惡}卜素含量的表型貢獻(xiàn)，為分子標(biāo)記輔助育種提供最佳的基因組合，對(duì)提高玉米中類胡羅素的含量對(duì)解決以玉米為主食的人群維生素a缺乏的現(xiàn)象有著重要的意義。

玉米籽粒類胡蘿卜合成是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，且具有較高的遺傳力。連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析是目前較為常見的用來解析玉米類胡蘿卜素合成和累積遺傳機(jī)理的方法，這兩種分析方法企在通過建立表型與基因型之間的聯(lián)系，挖掘控制類胡蘿卜表型性狀的遺傳位點(diǎn)，而這些遺傳位點(diǎn)之間相對(duì)獨(dú)立，它們之間的調(diào)控關(guān)系未知，并且傳統(tǒng)分析方法需要多年多點(diǎn)的表型鑒定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。我們將創(chuàng)新性的利用基因?qū)脖磉_(dá)模式的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析這一在酵母和人類中發(fā)展出來的新方法，挖掘類胡蘿卜代謝途徑中上下游基因之間的調(diào)控關(guān)系，解析籽粒類胡蘿卜合成和累積的調(diào)控機(jī)制，為分子標(biāo)記輔助育種提供最佳的基因組合。該研究思路創(chuàng)新，在植物學(xué)領(lǐng)域該項(xiàng)研究尚無報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有問題中存在的類胡蘿卜素累積的分子機(jī)制的研究的空白等問題，本發(fā)明提供了一種基于基因?qū)脖磉_(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)解析玉米籽粒類胡蘿卜代謝調(diào)控機(jī)制的方法，該方法通過動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析，以已知的玉米籽粒類胡蘿卜代謝途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)槟繕?biāo)基因，鑒定關(guān)鍵基因之間的相互調(diào)控關(guān)系，從而解析玉米籽粒類胡蘿卜代謝的調(diào)控機(jī)制，對(duì)玉米籽粒類胡蘿卜生化強(qiáng)化提供優(yōu)質(zhì)的基因組合，以及為玉米其它農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因之間的調(diào)控關(guān)系研究提供思路和方法。

本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種基于基因?qū)脖磉_(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)解析玉米籽粒類胡蘿卜代謝調(diào)控機(jī)制的方法，包括以下步驟：

（1）通過玉米基因組數(shù)據(jù)庫maizegdb下載類胡蘿卜素代謝通路中的關(guān)鍵基因13個(gè)；

（2）收集玉米自交系授粉后15天的籽粒轉(zhuǎn)錄本測(cè)序獲得基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，提取上述13個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)；

（3）動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析la模型的建立；

（4）利用動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析鑒定通路中關(guān)鍵基因之間的調(diào)控關(guān)系。

進(jìn)一步的，所述玉米籽粒類胡蘿卜素代謝通路中的關(guān)鍵基因?yàn)?i>zds1，pds1，psy1，lcyb，lcye，hyd1，hyd4，cyp97a，crtrb1，cyp97c，zep2，zep1，vde。

進(jìn)一步的，所述玉米自交系分成了2組：熱帶和亞熱帶、溫帶，小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行。所有材料均進(jìn)行自交，收獲未成熟的授粉后15天的籽粒，每個(gè)自交系的兩個(gè)重復(fù)各取3-4穗，每穗取1-2粒籽粒，混合提取籽粒總rna，隨機(jī)選擇368個(gè)樣品用于rna-seq。

上述rna-seq具體包括以下步驟：首先，用ploy（t）寡聚核苷酸從總rna中抽取全部帶ploy（a）尾的rna，主要為mrna，然后將截獲的mrna隨機(jī)打斷成片段，用六堿基隨機(jī)引物合成cdna第一鏈，并加入逆轉(zhuǎn)錄酶合成cdna第二鏈，經(jīng)過試劑盒純化并對(duì)cdna片段進(jìn)行末端修飾，連接測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫構(gòu)建工作，構(gòu)建好的文庫用illuminagaⅱ基因分析系統(tǒng)進(jìn)行序列測(cè)定及分析，獲得基因表達(dá)量數(shù)據(jù)集。

本發(fā)明所得到的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)集需要進(jìn)行缺失值預(yù)處理：對(duì)于數(shù)據(jù)集中的每個(gè)基因，如果其表達(dá)值在高于30%的樣本中缺失，則在后續(xù)的分析中舍棄該基因。

進(jìn)一步的，所述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析方法為建立動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型，所述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型la的數(shù)學(xué)定義如下：

la(x,y|z)=eg'(z)公式1

所述x,y和z表示玉米籽?；虻谋磉_(dá)量；

其中，所述x，y和z均為類胡蘿卜代謝通路里13個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量。假設(shè)x，y，z是均值為0，方差為1的連續(xù)隨機(jī)變量，則x，y的相關(guān)性表示為e(xy)；la描述條件期望時(shí)，即當(dāng)z=z，g(z)=e(xy|z=z)，g(z)檢測(cè)的是當(dāng)z=z時(shí)，xy基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式；g(z)的導(dǎo)數(shù)表示為g'(z)，用于共表達(dá)模式變化的期望測(cè)定；la的數(shù)學(xué)定義如下：

當(dāng)z符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布時(shí)，la值可簡(jiǎn)單的表示為la(x,y|z)=e(xyz)；

則la(x,y|z)表示為：e(xyz)=(x1y1z1+x2y2z2+...+xmymzm)/m公式2。

la用來反應(yīng)基因?qū)脖磉_(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化，即當(dāng)z基因表達(dá)量較高時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈正相關(guān)（co-regulated），e(xy|z=1)為正數(shù)；當(dāng)z基因表達(dá)量較低時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈負(fù)相關(guān)（contra-regulated，），e(xy|z=0)為負(fù)數(shù)，因此基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由正相關(guān)（co-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān)（contra-regulated），la值記為正；相反，基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由負(fù)相關(guān)（contra-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)檎嚓P(guān)（co-regulated），la值記為負(fù)。

進(jìn)一步的，所述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型通過隨機(jī)模擬的方法生成la值的參考分布，具體評(píng)估方法如下：混合所有基因的表達(dá)量值；在每次模擬中，用放回隨機(jī)抽樣法隨機(jī)抽取一對(duì)基因（x，y）的表達(dá)量值,z基因取全基因組所有基因，計(jì)算xy基因?qū)υ谌蚪M的la值，可分別得到la的正極大值和負(fù)極小值；重復(fù)模擬一百萬次，分別得到la的正值參考分布和負(fù)值參考分布。用la正負(fù)參考分布的99%分位數(shù)作為la正負(fù)顯著性閾值。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析,挖掘類胡蘿卜素代謝途徑中的13個(gè)關(guān)鍵基因的調(diào)控關(guān)系，解析籽粒類胡蘿卜合成和累積的調(diào)控機(jī)制，為分子標(biāo)記輔助育種提供最佳的基因組合,對(duì)提高玉米中胡蘿卜素以及改善玉米品質(zhì)有重要的意義。

（2）本發(fā)明基于同一個(gè)代謝途徑中的基因，表達(dá)模式相近這一科學(xué)假設(shè)，以類胡蘿卜代謝途徑中關(guān)鍵基因的共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)為突破口，可快速有效的解析類胡蘿卜代謝途徑的調(diào)控機(jī)制；

（3）通過基因?qū)脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，可鑒定上下游基因的調(diào)控關(guān)系；根據(jù)關(guān)鍵基因的調(diào)控關(guān)系，比如高表達(dá)的psy1以及低表達(dá)的lcye和crtrb1組合，為用于類胡蘿卜的分子標(biāo)記輔助育種中，可相較于傳統(tǒng)的單基因分子標(biāo)記輔助育種，多基因組合可顯著提高育種效率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1類胡蘿卜素代謝通路圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1lcye調(diào)控基因?qū)?i>zep1和vde共表達(dá)模式

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1vde調(diào)控基因?qū)?i>lcyb和cyp97a共表達(dá)模式。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1vde調(diào)控基因?qū)?i>lcyb和zep1共表達(dá)模式。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，下述說明僅是實(shí)例性的，不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種本發(fā)明所述基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析挖掘玉米籽粒油脂代謝調(diào)控機(jī)制的方法，主要包括三步，類胡蘿卜代謝通路中關(guān)鍵基因的收集、基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集、關(guān)鍵基因之間調(diào)控關(guān)系的鑒定。

（1）類胡蘿卜代謝通路中關(guān)鍵基因的收集：

通過maizegdb查找類胡蘿卜素代謝通路中基因，分別為zds1，pds1，psy1，lcyb，lcye，hyd1，hyd4，cyp97a，crtrb1，cyp97c，zep2，zep1，vde。類胡蘿素代謝過程圖（1）。

（2）基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集：

368份自交系（本發(fā)明所使用的玉米可為任意品種，本發(fā)明所使用的為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)宋同明教授培育的35份高油玉米自交系（yang等，2010b））于2010年在湖北荊州種植，根據(jù)系譜信息分成了2組（熱帶和亞熱帶、溫帶），小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行。所有材料均進(jìn)行自交，收獲未成熟的授粉后15天（15dap）的籽粒，每個(gè)自交系的兩個(gè)重復(fù)各取3-4穗，每穗取1-2粒籽粒，混合提取籽?？俽na，隨機(jī)選擇368個(gè)樣品用于rna-seq。樣品的rna-seq工作是由深圳華大基因研究院（beijinggenomicsinstitute，bgi）完成，測(cè)序方法簡(jiǎn)要描述如下：首先，用ploy（t）寡聚核苷酸從總rna中抽取全部帶ploy（a）尾的rna，主要為mrna，然后將截獲的mrna隨機(jī)打斷成片段，用六堿基隨機(jī)引物（randomhexamers）合成cdna第一鏈，并加入逆轉(zhuǎn)錄酶等合成cdna第二鏈，經(jīng)過試劑盒（ampurexpbeads）純化并對(duì)cdna片段進(jìn)行末端修飾，連接測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫構(gòu)建工作，構(gòu)建好的文庫用illuminagaⅱ基因分析系統(tǒng)進(jìn)行序列測(cè)定及分析。轉(zhuǎn)錄本測(cè)序獲得的368個(gè)玉米自交系中28769個(gè)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，對(duì)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)集進(jìn)行的缺失值預(yù)處理如下：基因表達(dá)數(shù)據(jù)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中的噪聲、檢測(cè)技術(shù)等原因而存在缺失。對(duì)于數(shù)據(jù)集中的每個(gè)基因，如果其表達(dá)值在高于30%的樣本中缺失，則在后續(xù)的分析中舍棄該基因，獲取的13個(gè)基因的基因表達(dá)量見表1。

表1

（3）動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型的建立：

所述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析方法為建立動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型，所述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型la的數(shù)學(xué)定義如下：

la(x,y|z)=eg'(z)公式1

所述x,y和z表示玉米籽粒基因的表達(dá)量；

其中，所述x，y和z均為類胡蘿卜代謝通路里13個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量（表1,單位：rpkm），假設(shè)x，y，z是均值為0，方差為1的連續(xù)隨機(jī)變量，則x，y的相關(guān)性表示為e(xy)；la描述條件期望時(shí)，即當(dāng)z=z，g(z)=e(xy|z=z)，g(z)檢測(cè)的是當(dāng)z=z時(shí)，xy基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式；g(z)的導(dǎo)數(shù)表示為g'(z)，用于共表達(dá)模式變化的期望測(cè)定；la的數(shù)學(xué)定義如下：

當(dāng)z符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布時(shí)，la值可簡(jiǎn)單的表示為la(x,y|z)=e(xyz)；

則la(x,y|z)表示為：e(xyz)=(x1y1z1+x2y2z2+...+xmymzm)/m公式2。

la用來反應(yīng)基因?qū)脖磉_(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化，即當(dāng)z基因表達(dá)量較高時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈正相關(guān)（co-regulated），e(xy|z=1)為正數(shù)；當(dāng)z基因表達(dá)量較低時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈負(fù)相關(guān)（contra-regulated，），e(xy|z=0)為負(fù)數(shù)，因此基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由正相關(guān)（co-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān)（contra-regulated），la值記為正；相反，基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由負(fù)相關(guān)（contra-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)檎嚓P(guān)（co-regulated），la值記為負(fù)。

所述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型通過隨機(jī)模擬的方法生成la值的參考分布，具體評(píng)估方法如下：混合所有基因的表達(dá)量值；在每次模擬中，用放回隨機(jī)抽樣法隨機(jī)抽取一對(duì)基因（x，y）的表達(dá)量值,z基因取全基因組所有基因，計(jì)算xy基因?qū)υ谌蚪M的la值，可分別得到la的正極大值和負(fù)極小值；重復(fù)模擬一百萬次，分別得到la的正值參考分布和負(fù)值參考分布。用la正負(fù)參考分布的99%分位數(shù)作為la正負(fù)顯著性閾值。

（3）關(guān)鍵基因之間調(diào)控關(guān)系的鑒定

以x&y&z=13個(gè)類胡蘿卜素代謝途徑中的13個(gè)關(guān)鍵基因，結(jié)果按照p<0.01過濾后，具體調(diào)控關(guān)系如下：當(dāng)lcye的表達(dá)量較高的時(shí)候，zep1和vde共表達(dá)模式呈正相關(guān)，當(dāng)lcye表達(dá)量較低的時(shí)候zep1和vde表達(dá)模式不相關(guān)（圖2）。lcye編碼番茄紅素環(huán)化酶，zep1和vde都屬于β-胡蘿卜素合成分支的基因。另外，紫黃質(zhì)合成途徑主要有5個(gè)基因參與，分別是lcyb、cyp97a、zep1、crtrb1和vde。傳統(tǒng)的兩兩基因之間的共表達(dá)分析未發(fā)現(xiàn)任意兩個(gè)基因之間的表達(dá)相關(guān)性，但是動(dòng)態(tài)共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，lcyb和cyp97a以及lcyb和zep1兩個(gè)基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式受到第三個(gè)基因vde的調(diào)控（圖3，4）。當(dāng)vde表達(dá)量較高時(shí)，lcyb和cyp97a以及lcyb和zep1表達(dá)模式正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該途徑中，vde基因的反饋抑制作用。類似地，我們還分析了psy1、lcye和crtrb1三個(gè)基因之間的動(dòng)態(tài)共表達(dá)模式，la結(jié)果顯示，當(dāng)psy1表達(dá)量較高時(shí)，lcye和crtrb1共表達(dá)模式正相關(guān)，當(dāng)lcye表達(dá)量較低時(shí)，psy1和crtrb1共表達(dá)模式負(fù)相關(guān)，當(dāng)crtrb1表達(dá)量較低時(shí)，psy1和lcye共表達(dá)模式負(fù)相關(guān)，具體見表2。這些結(jié)果與先前的報(bào)道一致，即上調(diào)psy1基因表達(dá)量以及下調(diào)lcye和crtrb1基因表達(dá)量可提高維生素a的含量。

表2psy1、lcye和crtrb1基因之間的動(dòng)態(tài)共表達(dá)模式

以上的這些結(jié)果證明了本發(fā)明的有效性，通過鑒定13個(gè)類胡蘿素代謝通路中關(guān)鍵基因的調(diào)控關(guān)系，從而解析玉米籽粒類胡蘿卜素代謝的調(diào)控機(jī)制，為類胡蘿卜的分子標(biāo)記輔助育種提供了最優(yōu)基因組合，顯著提高了育種效率，同時(shí)也為玉米其它數(shù)量性狀的調(diào)控機(jī)制研究提供了新的思路和方法。