專利名稱：改進的抑制劑核酸的制作方法
背景技術：
在給定時間一個細胞的結構和生物學行為由該細胞內的基因表達模式來決定。長時間以來基因表達的混亂被認為引發(fā)大量疾病包括多種形式的癌癥、血管疾病、神經和內分泌疾病?，F在認識到非正常的表達模式，諸如基因擴增、刪除、重排，和失去或獲得功能的突變，均可導致疾病細胞的異常行為。異常的基因表達也被認識到是某些生物抵御病原體威脅的防御機制。
藥物面臨的主要挑戰(zhàn)之一是調節(jié)靶基因的表達，這些靶基因牽涉到許多生理反應。雖然在真核細胞中過量表達一個轉入的外源基因相對容易，但靶向抑制特異基因卻更加困難。傳統(tǒng)的抑制基因表達的方法，包括基因定位破壞、反義RNA或共抑制或微注射，需要復雜的基因操作或大劑量的抑制物，而這經常會超過宿主細胞的毒性耐受水平。
RNA干擾(RNAi)現象描述了依賴雙鏈RNA(dsRNA)的基因特異性轉錄后沉默。最初利用這個現象實驗性操縱哺乳動物細胞的嘗試被由長dsRNA分子應答活化的強大非特異性病毒防御機制所挫敗(Gil等Apoptosis 2000，5107-114)。人工合成的雙螺旋21核苷酸RNA能夠在哺乳動物細胞中介導基因特異性RNAi，而不引起一般的抗病毒防御機制，這一發(fā)現大大促進了該領域的發(fā)展(Elbashir等，Nature2001，411494-498；Caplen等Proc Natl Acad Sci2001，989742-9747)。因而，小干擾RNA(small-interfering RNAs，siRNA)已經成為詳細研究基因功能的一個有力工具。化學合成小RNA已是產生期望結果的方法之一。
體內給予RNAi核酸的方法很難開發(fā)。需要有改進的方法和組合物以在臨床設置中給予RNAi分子。更具體的，需要有改進的siRNA分子，它不會引起非期望的非特異副作用，并且也需要具備改善的血清中穩(wěn)定性和被動物細胞攝取性能的siRNA分子。
發(fā)明概述本發(fā)明部分的提供了新型RNAi構建體分子。某些方面本發(fā)明提供了DNA:RNA構建體，任選包含一個或多個修飾部分。某些方面本文公開的新型構建體相對于傳統(tǒng)的RNA:RNA RNAi構建體具有一種或多種的改善性能。本文公開的某些構建體具有改善的血清穩(wěn)定性，某些構建體具有改善的被細胞攝取性能。進一步，本文公開的DNA:RNA構建體可以包括一些如錯配或變性部分的成分，它們可降低雙螺旋的熔解溫度本發(fā)明部分的提供了包含一個或多個化學修飾部分的RNAi構建體，這些修飾部分提高了RNAi構建體的血清穩(wěn)定性和被細胞攝取的性能。在某些實施方案中，本文公開的RNAi構建體相對未經修飾的RNAi構建體具有改善的被細胞攝取的性能。在某些實施方案中，本文公開的RNAi構建體相對未經修飾的RNAi構建體具有更長的血清半衰期。在某些方面，可對化學修飾部分進行選擇以提高RNAi構建體與一個或多個蛋白質的非共價結合作用?？傮w上，可降低一個RNAi構建體整體負電荷和/或提高疏水性的修飾部分傾向于提高該構建體與蛋白的非共價結合。在一個優(yōu)選的實施方案中，這種修飾部分被包含在一個雙鏈RNAi構建體的有義鏈中，例如包含在一個雙鏈DNA:RNA雜交RNAi構建體的DNA有義鏈中。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了具有指定序列的雙鏈核酸構建體，用于利用RNAi機制抑制靶基因表達，該雙鏈核酸包含一個含有一個或多個修飾部分的DNA有義多核苷酸鏈；和一個具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，該鏈與至少部分靶基因轉錄物雜交，并且足以使該靶基因沉默。這種一個或多個的有義鏈修飾部分使得該雙鏈核酸與含有同樣的指定序列但未經修飾的雙鏈核酸相比具有更高的與一種或多種蛋白結合的能力。修飾可以位于磷酸戊糖骨架上，也可以位于核苷部分上。有義鏈任選為DNA或RNA鏈，包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的修飾核苷。優(yōu)選有義多核苷酸是DNA鏈，含有一個或多個修飾的脫氧核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是RNA鏈，包含多個修飾核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是XNA鏈，例如肽核酸鏈(PNA)或鎖定核酸(locked nucleic acids，LNA)鏈。RNA反義鏈任選包含一個或多個修飾部分。例如，RNA反義鏈可包含不超過10％、20％、30％、40％、50％或75％的修飾核苷。這種一個或多個的修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸有提高的疏水性。在某些實施方案中，這種含有一個或多個修飾部分的RNAi構建體的logP值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的logP值低至少0.5個單位，優(yōu)選至少低1、2、3或甚至4個logP單位。這種一個或多個修飾部分可加以選擇，以使得該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸有提高的正電荷(或提高的負電荷)。在某些實施方案中，這種包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體的等電點(pI)比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的等電點高至少0.25個單位，優(yōu)選高至少0.5、1或甚至2個單位。有義多核苷酸任選包含對磷酸戊糖骨架的修飾部分，該修飾選自硫代磷酸酯基團、氨基磷酸酯基團、二硫代磷酸酯基團、PNA部分、LNA部分、2’-O-甲基基團和2’-脫氧-2’-氟化物基團。在某些實施方案中，RNAi構建體是發(fā)夾核酸，在細胞中加工為siRNA。每個雙鏈核酸長度任選為19-100bp，優(yōu)選為19-50或19-30bp。
在某些實施方案中，本文公開的雙鏈RNAi構建體被在10％血清存在下培養(yǎng)的細胞內化并在胞內的含量達到穩(wěn)定水平，至少是具有相同指定序列但未經修飾的RNAi構建體含量水平的2倍，內化的修飾RNAi構建體的水平優(yōu)選高于未修飾形式至少3、5或約10倍。
在某些實施方案中，本文公開的雙鏈RNAi構建體在人或小鼠體內的血清半衰期，至少是具有相同指定序列但未經修飾的RNAi構建體的2倍，任選高至少3或5倍。
在某些實施方案中，包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體對一個選定蛋白的KD值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體對同一蛋白的KD值，低至少0.2個對數單位，優(yōu)選低至少0.5或1.0個對數單位。也就是說，可以以提高與選定蛋白的結合能力為目的來設計RNAi構建體。
在某些實施方案中，包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體產生臨床反應的ED50值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的ED50值，低至少2倍，更優(yōu)選低至少5或10倍。也就是說，這種含有一個或多個修飾部分的RNAi構建體可在更小劑量下產生治療效果。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈核酸RNAi構建體，其中有義鏈為含有一個或多個修飾部分的DNA鏈，反義鏈是RNA鏈。DNA鏈的修飾部分可加以選擇，以提高RNAi構建體的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取性能。在某些實施方案中，DNA:RNA雙鏈核酸包含錯配堿基對。在某些實施方案中，DNA:RNA雜交RNAi核酸的Tm值，低于含有相同反義RNA鏈，但其與有義DNA精確配對的雙鏈核酸的Tm值。Tm值的比較在相同離子強度下進行，優(yōu)選在生理離子強度下進行。錯配雙鏈的Tm值可低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、15℃或20℃。
在某些方面，本發(fā)明提供了為將含有一個或多個修飾核酸的RNAi構建體給予受試者的藥物制劑。在一些實施方案中，藥物制劑包含具有指定序列雙鏈核酸，以RNAi機制抑制靶基因表達，這個雙鏈核酸包含含有一個或多個修飾部分的DNA有義鏈；和具有指定序列的RNA反義鏈，與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以使靶基因沉默。該有義鏈含有的一個或多個修飾部分使得該雙鏈結構與一種或多種蛋白的非共價結合能力，比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸的相應能力提高。修飾可以位于磷酸戊糖骨架上，也可位于核苷部分上。有義鏈任選為DNA或RNA鏈，包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的修飾核苷。優(yōu)選有義多核苷酸是DNA鏈，含有一個或多個修飾的脫氧核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是RNA鏈，包含多個修飾核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是XNA鏈，例如肽核酸鏈(PNA)或鎖定核酸(LNA)鏈。RNA反義鏈任選包含一個或多個修飾部分。例如，RNA反義鏈可包含不超過10％、20％、30％、40％、50％或75％的修飾核苷。這種一個或多個的修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸有提高的疏水性。在某些實施方案中，這種含有一個或多個修飾部分的RNAi構建體的logP值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的logP值低至少0.5個單位，優(yōu)選低至少1、2、3或甚至4個logP單位。這種一個或多個修飾部分可加以選擇，以使得該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸有提高的正電荷(或提高的負電荷)。在某些實施方案中，這種包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體的等電點(pI)比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的等電點高至少0.25個單位，優(yōu)選高至少0.5、1或甚至2個單位。有義多核苷酸任選包含的磷酸戊糖骨架修飾部分選自硫代磷酸酯基團、氨基磷酸酯基團、二硫代磷酸酯基團、PNA部分、LNA部分、2’-O-甲基基團。在某些實施方案中，RNAi構建體是發(fā)夾核酸，在細胞中被加工成siRNA。每個雙鏈核酸長度任選為19-100bp，優(yōu)選為19-50或19-30bp。
在某些實施方案中，藥物制劑進一步包含多肽，例如選自血清多肽的多肽、細胞靶定位多肽和內化多肽。細胞靶定位多肽的實例包括包含多個半乳糖部分以定位至肝細胞的多肽，轉鐵定位至瘤細胞的轉鐵蛋白多肽和選擇性結合至目的細胞的抗體。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物制劑包含雙鏈核酸RNAi構建體，其中有義鏈為含有一個或多個修飾部分的DNA鏈，反義鏈為RNA鏈。DNA鏈的修飾部分可加以選擇，以提高RNAi構建體的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取性能。在某些實施方案中，DNA:RNA雙鏈核酸包含錯配堿基對。在某些實施方案中，DNA:RNA雜交RNAi核酸生理離子強度下的Tm值，低于含有相同反義RNA鏈，但其與有義DNA精確配對的雙鏈核酸的生理離子強度Tm值。
在某些實施方案中，給予受試者的藥物制劑可包含本發(fā)明的RNAi構建體和藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體任選選自藥學上可接受的鹽、酯和這些酯的鹽。藥物制劑可以與人或其它動物患者的使用說明書包裝在一起。
在某些實施方案中，本文提供了降低胞內靶基因表達的方法，該方法包括使細胞與含有雙鏈核酸的組合物相接觸，該雙鏈核酸包含含有一個或多個修飾部分的DNA有義鏈；和具有指定序列的RNA反義鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以使靶基因沉默。其中一個或多個的修飾部分使該雙鏈核酸相對于具有相同指定序列但未經修飾的核酸，有更高的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取性能。
細胞與雙鏈核酸的接觸任選在至少0.1mg/ml蛋白存在下進行，優(yōu)選在至少0.5、1、2或3mg/ml蛋白存在下進行。接觸也任選在血清存在下進行，例如在至少1％、5％、10％或15％血清存在下進行。接觸也任選在模擬生理濃度的蛋白存在下進行。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了降低受試者一個或多個細胞內靶基因表達的方法，包括給予受試者含有雙鏈核酸的組合物，該雙鏈核酸包含含有一個或多個修飾部分的DNA有義多核苷酸鏈；和具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以使靶基因沉默，其中一個或多個的修飾部分使該雙鏈核酸相對于具有相同指定序列但未經修飾的核酸，有更高的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取性能。在某些實施方案中，雙鏈DNA:RNA核酸生理離子強度下的Tm值，低于反義RNA鏈相同但與有義DNA精確配對的雙鏈核酸的生理離子強度Tm值。
在一些實施方案中，本文公開的方法使用了具有指定序列的雙鏈核苷酸，它以RNAi機制抑制靶基因表達，包含含有一個或多個修飾部分的DNA有義多核苷酸鏈；和具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以使靶基因沉默。這種有義鏈的一個或多個修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，有更高的與一種或多種蛋白的非共價結合能力。修飾可根據經驗或按其它方法來加以選擇，以提高被細胞攝取的性能和/或血清穩(wěn)定性。修飾可位于磷酸戊糖骨架上，也可位于核苷部分上。有義鏈任選為DNA或RNA鏈，包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的修飾核苷。優(yōu)選有義多核苷酸是DNA鏈，含有一個或多個修飾的脫氧核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是RNA鏈，包含多個修飾核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是XNA鏈，例如肽核酸鏈(PNA)或鎖定核酸(LNA)鏈。RNA反義鏈任選包含一個或多個修飾部分。例如，RNA反義鏈可包含不超過10％、20％、30％、40％、50％或75％的修飾核苷。這種一個或多個的修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸有提高的疏水性。在某些實施方案中，這種含有一個或多個修飾部分的RNAi構建體的logP值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的logP值低至少0.5個單位，優(yōu)選低至少1、2、3或甚至4個logP單位。這種一個或多個的修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸正電荷增加(或負電荷增加)。在某些實施方案中，這種包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體的等電點(pI)比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的等電點高至少0.25個單位，優(yōu)選高至少0.5、1或甚至2個單位。有義多核苷酸任選包含的磷酸戊糖骨架的修飾選自硫代磷酸酯基團、氨基磷酸酯基團、二硫代磷酸酯基團、PNA部分、LNA部分、2′-O-甲基基團。在某些實施方案中，RNAi構建體是發(fā)夾核酸，在細胞中被加工成siRNA。每個雙鏈核酸長度任選為19-100bp，優(yōu)選為19-50或19-30bp。
在某些實施方案中，公開的方法所使用的組合物進一步含有多肽，例如選自血清多肽、細胞定位多肽和內化多肽的多肽。細胞定向多肽的實例包括包含多個半乳糖部分以定位至肝細胞的多肽，轉鐵定位至瘤細胞的轉鐵蛋白多肽和選擇性結合至目的細胞的抗體。
在某些實施方案中，提供了用在醫(yī)療器械表面的涂層材料。涂層材料可包括一個聚合物基質，RNAi構建體分布在其中。當涂了該材料的裝置被移植到病人體內適當位置時，RNAi構建體從基質上被洗脫下來并改變移植裝置鄰近細胞的生長、存活或分化。在某些實施方案中，這些RNAi構建體中至少有一種是雙鏈核酸，包含含有一個或多個修飾部分的DNA有義鏈；和具有指定序列的RNA反義鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以使靶基因沉默。這種有義鏈的一個或多個修飾部分使該雙鏈核酸比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，有更高的被細胞攝取的性能和/或血清穩(wěn)定性。涂層可進一步包含多肽。涂層可置于多種醫(yī)療器械的表面，例如螺絲、板、墊圈、縫合線、修復術抗基、平頭釘、肘釘、電導線、瓣膜、膜、導管、可移植的脈管進入端口、血袋、導血管、中央靜脈導管、動脈導管、脈管移植物、大動脈球泵、心臟瓣膜、心臟血管縫合線、人工心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析單位、血灌流單位、血漿去除單位和適于用在血管中的濾器。優(yōu)選的涂層材料涂于斯滕特固定模(stent)表面。
在一些實施方案中，本文公開的涂層材料包含具有指定序列的雙鏈核酸，它個以RNAi機制抑制靶基因表達，包含含有一個或多個修飾部分的DNA有義鏈；和具有指定序列的RNA反義鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以使靶基因沉默。這種有義鏈的一個或多個修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，有更高的與一種或多種蛋白的非共價結合能力。修飾部分可加以選擇，以提高雙鏈核酸的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取的性能。修飾部分可以位于磷酸戊糖骨架上，也可以位于核苷部分上。有義鏈任選為DNA或RNA鏈，包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的修飾核苷。優(yōu)選有義多核苷酸是DNA鏈，含有一個或多個修飾的脫氧核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是RNA鏈，包含多個修飾核糖核苷酸。有義多核苷酸也可任選是XNA鏈，例如肽核酸鏈(PNA)或鎖定核酸(LNA)鏈。RNA反義鏈任選包含一個或多個修飾部分。例如，RNA反義鏈可包含不超過10％、20％、30％、40％、50％或75％的修飾核苷。這種一個或多個的修飾部分可加以選擇，以使該雙鏈核酸在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸有提高的疏水性。在某些實施方案中，這種含有一個或多個修飾部分的RNAi構建體的logP值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的logP值低至少0.5個單位，優(yōu)選低至少1、2、3或甚至4個logP單位。這種一個或多個修飾部分可加以選擇，以使得該雙鏈結構在生理條件下比具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈結構有提高的正電荷(或負電荷)。在某些實施方案中，這種包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體的等電點(pI)比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的等電點高至少0.25個單位，優(yōu)選高至少0.5、1或甚至2個單位。有義多核苷酸任選包含的磷酸戊糖骨架的修飾選自硫代磷酸酯基團、氨基磷酸酯基團、二硫代磷酸酯基團、PNA部分、LNA部分、2′-O-甲基基團。在某些實施方案中，RNAi構建體是發(fā)夾核酸，在細胞中被加工成siRNA。每個雙鏈核酸長度任選為19-100bp，優(yōu)選為19-50或19-30bp。
在某些實施方案中，本文公開的涂層材料可包含與RNAi構建體結合的多肽，例如選自血清多肽、細胞定位多肽和內化多肽。細胞定向多肽的實例包括包含多個半乳糖部分以定位至肝細胞的多肽，轉鐵定位至瘤細胞的轉鐵蛋白多肽和選擇性結合至目的細胞的抗體。
在某些方面，本文提供了優(yōu)化制藥上使用的RNAi構建體的方法，包括評估包含一個或多個修飾核酸的RNAi構建體的被細胞攝取性能和/或藥物動力學性質(如血清半衰期)。在某些實施方案中，優(yōu)化制藥上使用的RNAi構建體的方法包括鑒別具有指定序列能抑制靶基因表達并減少疾病影響的RNAi構建體；設計一個或多個具有指定序列并包含一個或多個修飾核酸的修飾RNAi構建體；測試一個或多個修飾RNAi構建體的被細胞攝取性能和/或血清半衰期；為動物體內療效和毒性描繪修飾和/未經修飾RNAi構建體的治療譜；選擇一個或多個具有所需被攝取性能和所需治療性能的RNAi構建體。在某些實施方案中，該方法包括將一個已鑒定的RNAi構建體的有義鏈取代為另一DNA有義鏈，它包含一個或多個修飾部分或修飾核苷酸。在某些實施方案中，優(yōu)化制藥上使用的RNAi構建體的方法包括，制備多個包含DNA:RNA雜交雙鏈核酸的試驗RNAi構建體，并測試這些試驗構建體的基因沉默效果。雜交核酸的DNA有義鏈可包含一個或多個修飾或修飾核苷酸。雙鏈核酸可包含一個或多個錯配堿基對。該方法可進一步包括確定試驗RNAi構建體的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取性能，和描繪其治療譜。
優(yōu)化制藥使用的RNAi構建體的方法可進一步包括配制包含一個或多個選定的RNAi構建體的藥物制劑。該方法可進一步任選包括以下內容建立分配系統(tǒng)以分配用來銷售的藥物制劑，與其它實體合作以推進分配，建立銷售群體以開拓該藥物制劑市場，以及與一個或多個私營或政府健康保險公司合作建立一個可盈利的賠償系統(tǒng)。
附圖的簡要描述

圖1為凝膠照片，顯示如下條件中的核酸含量
泳道1 siFAS2，H2O泳道2 siFAS2，血清(t＝0)泳道3 siFAS2，血清(t＝4h)泳道4 CDP/siFAS2 5+/-，血清(t＝4h)，無硫酸乙酰肝素泳道5 CDP/siFAS2 5+/-，血清(t＝4h)，硫酸乙酰肝素泳道6 [雜交物]，H2O泳道7 [雜交物]，血清(t＝4h)泳道8 [雜交物]，血清(t＝4h)泳道9 CDP/[雜交物]5+/-，血清(t＝4h)，無硫酸乙酰肝素泳道10 CDP/[雜交物]5+/-，血清(t＝4h)，硫酸乙酰肝素其中[雜交物]＝JH-1:EGFPb-anti＝DNA(PS)-3’TAMRAs:RNAa圖2為凝膠照片，顯示如下條件中的核酸含量泳道1 10bp DNA標準梯泳道2 siFAS2，血清，H2O泳道3 siFAS2，血清(t＝0)泳道4 siFAS2，血清(t＝4h)泳道5 CDP/siFAS2 5+/-，血清(t＝4h)，無硫酸乙酰肝素泳道6 CDP/siFAS2 5+/-，血清(t＝4h)，硫酸乙酰肝素泳道7 CDP/siFAS2 10+/-，血清(t＝4h)，無硫酸乙酰肝素泳道8 CDP/siFAS2 10+/-，血清(t＝4h)，硫酸乙酰肝素泳道9 CDP/siFAS2 20+/-，血清(t＝4h)，無硫酸乙酰肝素泳道10 CDP/siFAS2 20+/-，血清(t＝4h)，硫酸乙酰肝素圖3A-3D為體內細胞攝取核酸結構的共聚焦顯微照片。
發(fā)明詳述I總述在某些方面，本發(fā)明涉及到發(fā)現對RNAi構建體的某些修飾可改善其血清穩(wěn)定性并有利于細胞對它的攝取。本發(fā)明的另一方面涉及優(yōu)化RNAi構建體以避免非特異性，“脫靶(off-target)”作用，例如由RNA:RNA siRNA分子的RNA有義鏈引起的作用，或者可能與RNA-活化蛋白激酶(“PKA”)和干擾素反應相關的作用。因此，在某些方面本發(fā)明提供了用以在胞內特別是在體內降低靶基因表達的修飾雙鏈RNAi構建體。傳統(tǒng)的裸反義分子可有效給予動物和人體內。但是，典型的RNAi構建體，例如短雙鏈RNA，不能如此簡單的給予。另外，已經觀察到在體內和體外實驗中將RNAi給予細胞的有效性的差異。如本文所證明，對RNAi構建體進行的化學或生物修飾可提高它的血清穩(wěn)定性，并可進一步改善它的被細胞攝取的性能。部分的，本文論述了未經修飾的RNAi構建體表現出血清穩(wěn)定性差和不易被攝取的趨向。如同附例所示，本發(fā)明的DNA:RNA雜交構建體表現出有更高的血清穩(wěn)定性和改善的體內被細胞攝取的性能。雖然不希望被任何特定理論限制，但一個沒有雙鏈RNA:RNAsiRNA的改進RNAi構建體可避免雙鏈RNA:RNA siRNA引起的非特異性作用，例如由RNA:RNA siRNA分子的有義鏈RNA引起的脫靶作用。因此，本發(fā)明提供了雙鏈核酸RNAi構建體，它包含DNA:RNA雜交核酸并含有錯配堿基對。
因而，本發(fā)明部分上提供了包含修飾核酸的RNAi構建體，進行修飾的的目的是提高它的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取性能。該核酸可進一步進行改進以避免非特異性作用。
II概念定義方便起見，在詳述、實施例和附加權利要求書中使用的某些概念收集在此。
一個待用本文公開的方法處理的“患者”或“受試者”可指一個人或一個動物。
關于基因序列的術語“表達”，指這個基因的轉錄和mRNA轉錄物翻譯成蛋白。因而如上下文所示，一個蛋白編碼序列的表達源自該編碼序列的轉錄和翻譯。降低一個基因表達的方法可通過多種途徑達到目的(這些途徑均不互相排斥)，包括如，抑制基因的轉錄，降低mRNA的穩(wěn)定性，減弱mRNA的翻譯作用。雖然不希望被一個特定機制限制，但總體上認為siRNA技術降低基因表達是通過刺激靶mRNA的降解來進行的。
本文的“沉默”一個靶基因是指降低或減弱該靶基因的表達。
本文所用的術語“核酸”指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。這個術語也應理解為包括單鏈(如有義和反義鏈)和雙鏈多核苷酸，如同在待述實施方案中所應用的那樣。“規(guī)范”核苷酸是腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)，并包括一個核糖-磷酸骨架，但是術語核酸用以包括僅含規(guī)范核苷的多核苷酸，和在磷酸戊糖骨架上或核苷上進行一處或多處修飾的多核苷酸。因為在核糖2′位點上無或有一個羥基，DNA和RNA的化學性質不同。經修飾不宜稱為DNA或RNA的核酸(例如在2′位上的基團完全不同)和不含核糖骨架的核酸可稱為XNA。例如肽核酸(PNA)，它的骨架是肽骨架，和鎖定核酸(LNA)，它的核糖2′位點和4′位由一個亞甲基連接起來。一個“未經修飾”核酸指一個僅含規(guī)范核苷酸和DNA或RNA骨架的核酸。
術語“藥學上可接受的鹽”指本發(fā)明的生理學上和藥學上均可接受的本發(fā)明化合物的鹽，也就是保持了母化合物的所需生物學活性但沒有非所需毒性的鹽。
術語“肺部給予”和“呼吸給予”指通過從嘴巴吸入RNAi構建體并到達肺來系統(tǒng)給予患者RNAi構建體。
本文所用的術語“RNAi構建體”是在整個詳述中普遍使用的術語，包括小干擾RNA(siRNAs)，發(fā)夾結構RNA和其它種類的可在體內被切割形成siRNA的RNA。siRNA任選為單鏈或雙鏈，包括DNA:RNA，RNA:RNA，XNA:RNA雙鏈核酸。
術語“小干擾RNA”或“siRNA”指長度范圍在19-30核苷酸間的核酸，更優(yōu)選為21-23個核苷酸。siRNA為雙鏈，可在每個末端包含短突出端。雖然siRNA的反義鏈優(yōu)選為RNA，但有義鏈可以是RNA、DNA或XNA，也可以是它們的修飾產物和混合物。突出端優(yōu)選位于3′端，長1-6個核苷。本領域中已知siRNA可通過化學方法合成，或者由一個較長雙鏈RNA或發(fā)夾結構RNA制備。siRNA與靶RNA間有顯著的序列相似性，從而siRNA可以與靶RNA配對并通過RNA干擾機制導致靶RNA發(fā)生序列特異性降解。siRNA分子可任選包含一個3′羥基。
III示例RNAi構建體在某些實施方案中，本文提供的RNAi構建體包含一個或多個修飾部分以改善它的被細胞攝取的性能。本文公開的RNAi構建體可具有所需藥代動力學特性，例如降低的清除率和更長的血清半衰期。這些修飾可加以選擇以提高RNAi構建體的血清穩(wěn)定性和/或被細胞攝取的性能。這些修飾可加以選擇以提高RNAi構建體與蛋白的非共價結合能力。例如，降低RNAi構建體整體負電荷和/或提高其疏水性的修飾往往可提高RNAi構建體與蛋白的非共價結合能力。
可通過設計使RNAi構建體包含一段核苷酸序列，它在細胞生理條件下能至少與待抑制基因(也就是靶基因)的mRNA轉錄物一部分雜交，并足以使靶基因沉默。RNAi構建體僅需要與天然RNA足夠相似即可具有介導RNAi的能力。因此，可以容忍可能預期由基因突變、鏈多態(tài)性或進化趨異引起的序列變異。靶序列和RNAi構建體序列間的可容忍的核苷酸錯配數任選為5堿基對中不超過1個，或10堿基對中不超過1個，或者20堿基對中不超過1個，或者50堿基對中不超過1個。位于siRNA雙鏈區(qū)中央部分的錯配最為關鍵，本質上可導致靶RNA不被切開。與之對比，位于siRNA 3′末端并與靶RNA互補的核苷酸對識別靶RNA的特異性并無顯著貢獻。
序列同一性可通過本領域已知的序列對照和對位排列算法來進行優(yōu)化(參見Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，StocktonPress，1991，和其中引用的參考文獻)，并通過例如Smith-Waterman算法(如BESTFIT軟件即為此算法，使用默認參數，例如University ofWisconsin Genetic Comupting Group)來計算核苷序列的差異百分比。優(yōu)選的抑制RNA和靶基因部分間有90％以上同一性，或者甚至有100％的同一性。另一選擇是，將RNA雙鏈區(qū)域確定為能與靶基因轉錄物一部分進行雜交(條件例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃雜交12-16h；然后洗滌)的功能核苷酸序列。
在某些實施方案中，雙鏈RNAi構建體可包含錯配堿基對。在某些實施方案中，DNA:RNA雜交RNAi核酸的Tm值低于反義RNA鏈相同但有義鏈與其完全互補的雙鏈核酸的Tm值。在相同離子強度下比較Tm值，優(yōu)選在生理離子強度下進行(例如約等于150mMNaCl)。Tm值可低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、15℃或20℃。生理鹽溶液的實例包括Frog Riner、Krebs、Tyode、Ringer-Locke、Dw Jalen和人工腦脊髓液(參見GlaxoWellcome PharmacologyGuide)。Tm可通過公認公式計算，例如Tm計算公式Tm＝81.5+16.6×Log10[Na+]+0.41(％GC)-600/長度[Na+]設置為100mM，[Na+]最高至0.4M.
例如5′-ATGCATGCATGCATGCATG3′20mer；GC＝50％；AT＝50％Tm＝81.5+16.6×Log10
+0.41×50-600/20Tm＝81.5-16.6+0.41×50-600/20＝55.4℃相同寡核苷酸Tm用2(A+T)+4(C+G)計算為60℃(短于25bp的寡核苷酸，Tm＝2(A+T)+4(C+G))本領域中已知錯配會降低雙鏈核酸雙鏈區(qū)的穩(wěn)定性。錯配可通過多種方法探測，包括測量雙鏈區(qū)對某種化學修飾的敏感性(例如需要每條鏈的空間和柔韌性)(參見例如John和Weeks，Biochemistry(2002)416866-74)。也可通過使用RNase A分析來確定DNA:RNA雜交雙鏈的錯配，因為RNase A在DNA:RNA雜交雙鏈中單個堿基對錯配位點降解RNA。
雖然不希望被任何特定理論限制，但雙鏈RNAi構建體中的錯配可引起雙鏈的解離以至類似于兩條單鏈多核苷酸，如此結構不會如雙鏈RNAi構建體可能的那樣會引起非特異性作用。
在某些實施方案中，RNAi構建體可以是DNA:RNA構建體、RNA:RNA構建體或XNA:RNA構建體。DNA:RNA構建體的有義鏈含至少50％的脫氧核糖核酸或修飾的脫氧核糖核酸，而反義鏈含至少50％的核糖核酸或修飾的核糖核酸。RNA:RNA構建體的有義鏈和反義鏈均含至少50％的核糖核酸或修飾的核糖核酸。如本文所述，雙鏈核酸可由單鏈核酸形成，單鏈核酸形成發(fā)夾結構或其它折疊形式從而單鏈核酸的兩個部分雜交并構成了一個雙螺旋的有義鏈和反義鏈。DNA:RNA構建體和RNA:RNA構建體均可形成發(fā)夾結構或其它折疊的單鏈形式。術語脫氧核糖核酸和核糖核酸均為化學名稱，意味著某個特定核糖骨架。某種修飾的核酸，例如肽核酸(PNAs)，沒有核糖基礎。其它修飾核酸的修飾發(fā)生在核糖的2′位，因此不可能劃分為RNA或DNA。這些種類的核酸可稱為“XNA”。在某些實施方案中，本文特意使用了XNA:RNA構建體，這里的“XNA”指有義鏈的主要核苷沒有DNA或RNA骨架。例如，如果有義鏈包含50％以上的肽核酸或修飾肽核酸，這個雙鏈構建體可稱為PNA:RNA構建體?？煽紤]使用RNA、DNA和XNA的混合物，也就是說根據上文定義，這個混合物不屬于RNA、DNA或XNA的任一個(例如，一個核酸含30％DNA，30％RNA和40％XNA)。這樣的混合核酸鏈明確包含在術語“核酸”中，它可以理解為一個核酸可含有0、5、10、20、25、30、40、50％或更多的DNA；0、5、10、20、25、30、40、50％或更多的RNA；0、5、10、20、25、30、40、50％或更多的XNA。一個含有50％RNA和50％DNA(或XNA)的核酸應被視為RNA鏈，一個含有50％DNA和50％XNA的核酸應被視為DNA鏈。
可通過化學合成或者核酸重組技術來生產RNAi構建體。處理過的細胞內源性RNA聚合酶可在體內介導轉錄，或者克隆的RNA聚合酶可在體外用以轉錄。
RNAi構建體的一條或兩條鏈可在磷酸戊糖骨架和/或核苷部分發(fā)生修飾?？傮w上，有義鏈對可能引進的修飾的數量和種類幾乎沒有限制。有義鏈應保持與反義鏈雜交的能力，同時較長核酸的有義鏈不應妨礙RNase的活力，RNase例如Dicer酶，它參與將較長雙鏈結構切開以產生較短的活性siRNA。反義鏈應保持與有義鏈和靶轉錄物進行雜交的能力，以及形成一個RNAi引起的沉默復合體(RNAi induced silencing complex，RISC)的能力。在某些優(yōu)選的實施方案中，有義鏈全部為修飾核酸，而反義鏈RNA包含的修飾核酸則不超過0％、10％、20％、30％、40％或50％。在一個優(yōu)選的實施方案中，RNAi構建體為DNA(有義鏈):RNA(反義鏈)，其中DNA部分包含一個或多個的修飾部分。RNA也任選包含一個或多個修飾部分。修飾有利于改善RNAi構建體的被攝取性能和/或提高其血清半衰期。另外，相同的修飾或附加修飾可帶來額外的好處，例如降低RNAi構建體對細胞核酸酶的敏感性，提高生物利用度，改善制劑特性和/或改變藥代動力學性質。
通過本詳述，可以明確很多有關于修飾降低RNAi構建體的負電荷和/或提高其疏水性的例子。例如，天然RNA的磷酸二酯鍵可被修飾為至少含一個N或S雜原子。在體內應用前，可在體外評估修飾對細胞的毒性作用。例如，在有義或反義鏈中硫代磷酸酯修飾超過50％可產生毒性作用。RNA構建體的修飾可仔細設計以產生特異的基因抑制而避免對dsRNA的非特異反應。同樣的，可修飾堿基以抵御腺苷脫氨酶的作用。RNAi構建體可通過酶促反應產生或通過部分/全部有機合成，任何修飾的核糖核酸均可在體外由酶或有機合成而引入?？赏ㄟ^分析logP值來評估疏水性?！發(fā)ogP”指P(分配系數)的對數值。P代表一種物質在脂(油)和水間的分配情況。P本身是一個常數。它定義為一種化合物在水相中的濃度與該化合物在與水不互溶溶劑(如中性分子)中濃度的比值。
分配系數，P＝[有機相]/[水相]，這里[ ]代表濃度logP＝log10(分配系數)＝log10P實際上，logP值將根據測量條件和所選分配溶劑而變化。logP值為1意味著化合物在有機相中的濃度是水相中濃度的10倍。logP值提高1意味著化合物在有機相中的濃度與水相中濃度的比值提高了10倍。因此，一個logP值為3的化合物在水中的溶解能力是loPgG值為4的化合物的10倍，是logP值為5的化合物的100倍。一般上，認為logP值在7-10的化合物有低水溶性。
在某些實施方案中，這種含有一個或多個修飾部分的RNAi構建體的logP值比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的logP值低至少1個單位，優(yōu)選低至少2、3或甚至4個logP單位。
可通過測量RNAi構建體的等電點(pI)來確定其電荷，如通過等電點聚焦分析進行。在某些實施方案中，這種包含一個或多個修飾部分的RNAi構建體的等電點(pI)比其它相同但未經修飾的RNAi構建體的等電點高至少0.25個單位，優(yōu)選高至少0.5、1或甚至2個單位。
可對化學修飾RNA的方法加以改進來修飾RNAi構建體(如參見Heidenreich等(1997)Nucleic Acids Res25776-780；Wilson等(1994))JMol Recog789-98；Chen等(1995)Nucleic Acids Res232661-2668；Hirschbein等(1997)Antisense Nucleic Acid DrugDev 755-61)。RNAi構建體的骨架可使用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基磷酸酯-磷酸二酯、肽核酸、含低聚物或糖修飾(例如，2’-取代核糖核苷，a-構型)5-丙炔基嘧啶修飾(以上列舉僅為說明而不是僅限于這些)。另外的修飾核苷如下(此列舉包括的修飾可發(fā)生在骨架或核苷上或同時發(fā)生于兩者上，但不僅限于這些)2’-O-甲基-2’-氨基腺苷、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鳥苷、2’-O-甲基尿苷、2-氨基-2’-脫氧腺苷、2’-氨基腺苷、2-氨基嘌呤-2’-脫氧核糖核苷、4’-硫代胸苷、4’-硫代尿苷、5-甲基-2’-脫氧胞苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、5-丙炔基-2’-脫氧胞苷、5-丙炔基-2’-脫氧尿苷、N1-甲基腺苷、N1-甲基鳥苷、N2-甲基-2’-脫氧鳥苷、N6-甲基-2’脫氧腺苷、N6-甲基腺苷、O6-甲基-2’-脫氧鳥苷和O6-甲基鳥苷。
雙鏈結構可以通過一個自身互補的單鏈形成或通過兩條可互補的單鏈形成。雙鏈形成的起始可在胞內或胞外發(fā)生。RNAi構建體的導入量可為至少提供每個細胞一個拷貝。更高劑量(如每個細胞至少5、10、100、500或1000拷貝)的雙鏈原料可產生更有效的抑制作用，但是較低劑量也可有利于特異性應用?？紤]到本文公開的修飾RNAi構建體有更好的被攝取性能，可以使用比傳統(tǒng)RNAi構建體一般用量更低的劑量。抑制是序列特異性的，原因在于目的RNA中相應于RNAi構建體雙鏈區(qū)的核苷酸序列以基因抑制為目標。
在某些實施方案中，試驗RNAi構建體是“小干擾RNA”或“siRNA”。這些核酸含有的反義鏈RNA長約19-30核苷酸，更優(yōu)選甚至為21-23核苷酸，例如長度相當于長雙鏈RNA的核酸酶切產物片斷。siRNA可包含RNA、DNA或XNA有義鏈。這種siRNA可理解為募集核酸酶復合體并通過與特異序列配對引導復合體至靶mRNA。靶mRNA從而在蛋白復合體中被核酸酶降解。在特別的實施方案中，21-23核苷酸長度的siRNA反義分子包含一個3′羥基。任選的，有義鏈包含10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的修飾核苷，而反義鏈是未經修飾的RNA。任選的，有義鏈包含100％的修飾核酸(例如是每個可能位置均被硫代磷酸修飾的DNA或RNA)，而反義鏈RNA不包含修飾核酸或修飾核酸不超過10％、20％、30％、40％或50％。
可通過使用許多種該領域技術人員了解的方法來制備本發(fā)明的siRNA。例如，可通過該領域技術人員了解的化學合成法或重組技術來制備siRNA。例如，可合成短有義和反義RNA、DNA或XNA低聚物并發(fā)生退火以形成在每個末端均有2個核苷突出端雙鏈結構(參見Caplen，等(2001)Proc Nati Acad Sci USA，989742-9747；Elbashir，等(2001)EMBO J，206877-88)。然后這些雙鏈siRNA結構可被導入細胞，通過被動攝取或選擇的給藥系統(tǒng)，例如下文將要描述的方法。
在某些實施方案中，siRNA構建體可通過加工長雙鏈RNA來得到，例如在Dicer酶的存在下。在一個實施方案中使用體外果蠅系統(tǒng)。這個實施方案中，dsRNA與源自果蠅胚胎的可溶性提取物結合，從而產生一個結合物。這個結合物保持在某種條件下，使得dsDNA被加工成為長約21-23核苷酸的RNA分子。在這個實施方案中，修飾應加以選擇以使其不干擾RNase的活力。
siRNA分子可通過許多種該領域技術人員了解的方法來純化。例如，凝膠電泳可用以純化siRNA。另一選擇是非變性方法，非變性柱層析可用以純化siRNA。另外，層析(例如分子排阻層析)、甘油梯度離心、抗體親和純化均可用以純化siRNA。
在某些優(yōu)選實施方案中，siRNA的至少一條鏈有3′端長約1-6核苷的突出端，盡管長度可能是2到4核苷。更優(yōu)選的突出端長1-3核苷。在某些實施方案中，一條鏈有3′突出端而另一鏈為平末端或者也為突出端。每條鏈的突出端可相同也可不同。為了進一步提高siRNA的穩(wěn)定性，可穩(wěn)定3′突出端使其不降解。在一個實施方案中，RNA反義鏈通過包含嘌呤核苷酸而穩(wěn)定，例如腺苷或鳥苷核苷酸。另一選擇是用修飾類似物取代嘧啶核苷酸，例如2′-脫氧胸腺嘧啶對3′突出端尿苷的取代可以容忍而且并不影響RNAi的功效。在組織培養(yǎng)基中2′羥基的缺乏顯著提高了突出端對核酸酶的抗性，并且這一點在體內可能是有用的。
在其它實施方案中，RNAi構建體為長雙鏈RNA:RNA或DNA:RNA雜交體或XNA:RNA。在某些實施方案中，RNAi構建體至少長25、50、100、200、300或400堿基。在某些實施方案中，RNAi構建體長400-800堿基。這種雙鏈核酸在細胞內被消化，例如產生胞內siRNA序列。但是在體內雙鏈核酸并不總是有效的，推測是因為非序列依賴的dsRNA反應引起的毒性作用。在這種實施方案中，優(yōu)選使用局部給藥系統(tǒng)和/或能降低干擾素或PKR作用的藥物。
在某些實施方案中，RNAi構建體是一個發(fā)夾結構。這種發(fā)夾可通過外源合成或可通過體內RNA聚合酶III啟動子轉錄形成。在哺乳動物細胞內制造和使用這樣的發(fā)夾RNA以使基因沉默的例子在以下文獻中描述，Paddison等，Genes Dev，2002，16948-58；McCaffrey等，Nature2002，41838-9；McManus等，RNA，2002，8842-50；Yu等，Proc Natl Acad Sci USA，2002，996047-52。優(yōu)選的在細胞或一個動物體內操作這樣的發(fā)夾RNA以確保對所需基因的持續(xù)穩(wěn)定抑制。在該領域中已知在細胞中可通過加工發(fā)夾RNA來產生siRNA。可化學合成發(fā)夾以使有義鏈包含RNA、DNA或XNA而反義鏈包含RNA。在這樣一個實施方案中，應將有義和反義部分的連接單鏈部分設計為能在體內被核酸酶切開，并且所有雙鏈部分均應對核酸酶加工敏感，例如Dicer。
IV示例性制劑本發(fā)明的RNAi構建體也可與其它分子、分子構件(structure)或化合物的混合物混合、裝成膠囊、綴合或其它形式的結合以輔助其被攝取、分布和/或吸收，例如與脂質體、聚合物、受體靶分子、口、直腸、局部或其它制劑。試驗RNAi構建體可以以制劑形式提供，也包括滲透性提高劑、載體化合物和/或轉染劑。
在某些實施方案中，可使用提高的本文公開的RNAi構建體結合物以產生預先結合的混合物，包含一個RNAi構建體和一個蛋白。例如，一種用以給予至受試者的組合物可包含一個或多個血清蛋白，例如白蛋白(優(yōu)選用與受試者相配的種類，例如給予人人血清白蛋白)和RNAi構建體。因此當給予受試者時，相當比例的RNAi構建體和蛋白結合?？蛇x擇一個適合于給予模式的蛋白。血清蛋白特別適合與血液一起運送到身體的任何部分，也特別適合于靜脈內給藥。黏蛋白或蛋白聚糖可最好于黏膜表面給藥，例如于呼吸道、直腸、眼睛或生殖器黏膜表面給藥。
可選擇一個蛋白以將RNAi構建體靶向定位至一個特定組織或細胞型。例如，可使用一個轉鐵蛋白來將RNAi構建體靶定位至一個腫瘤的細胞(瘤細胞)。另一個例子如，可使用一個包含一個或多個半乳糖部分的蛋白來將RNAi構建體靶定位至肝細胞?？蓪⒁粋€RNAi構建體和一個抗體預先混合，這個抗體與靶細胞或組織有親和力。在該領域對制備定位抗體的方法有充分認識。這里所說的抗體可以是如單克隆或多克隆抗體、含單鏈抗體的多肽、Fv片段、Fc片段(如用以定位至Fc結合細胞)、嵌合或人源化抗體、全長人抗體，可以是任何類型的抗體，例如IgG、IgM、IgE或IgD，或其部分。其它定位多肽的實例列在下表。
多肽也可以是一個選出用以特異促進細胞攝取RNAi構建體的內化蛋白。在一個實施方案中，內化肽來自果蠅觸角(antepennepedia)蛋白或其同源蛋白。已經證實果蠅觸角(antepennepedia)同源蛋白的60氨基酸殘基長同源域可穿越生物膜運動，并且可以促進與其偶聯的異種蛋白的運動。參見Derossi等(1994)J Biol Chem 26910444-10450；and Perez等(1992)J Cell Sci102717-722。最近已證實這個蛋白的16氨基酸殘基長度的小片段足以驅動內化。參見Derossi等(1996)J Biol Chem27118188-18193。另一個內化肽的例子是HIV反式激活(TAT)蛋白。這個蛋白顯示出可被劃分為4個結構域(Kuppuswamy等(1989)Nucl.Acids Res.173551-3561)。純化的TAT蛋白在組織培養(yǎng)物中被細胞攝取(Frankel and Pabo，(1989)Cell551189-1193)，并且肽例如相應于TAT的37-62殘基的部分，在體外被細胞快速攝取(Green and Loewenstein，(1989)Cell551179-1188)。高堿性區(qū)域介導內化和內化部分靶定位至核(Ruben等，(1989)J.Virol.631-8)。包含高堿性區(qū)域內序列(例如CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS)的肽或類似蛋白與多聚物結合，以幫助內化和靶定位那些復合物到胞內(milleau)。另一穿細胞多肽范例可被制備以包含足夠的肥大脫粒肽部分(T.Higashijima等，(1990)J.Biol.Chem.26514176)，以提高RNAi構建體的跨膜給予。
其它適合的內化肽可用下例的全部或一個部分來制備，組蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、堿性清蛋白、泌乳刺激素和胰島素樣生長因子I(IGF-I)、胰島素樣生長因子II(IGF-II)或其它生長因子。例如，已經發(fā)現胰島素的一個片段表現出對纖毛細胞上的胰島素受體的親和力，在降血糖作用上不如胰島素有效，因此可以用作受試者穿細胞多肽的一個內化肽。優(yōu)選的生長因子起源的內化肽包括EGF(表皮生長因子)來源的肽，例如CMHIESLDSYTC和CMYIEALDKYAC；β-TGF(轉化β-生長因子)來源的肽；起源自PDGF(血小板生長因子)或PDGF-2的肽；源自IGF-I(胰島素樣生長因子)或IGF-II的肽；和源自FGF(纖維原細胞生長因子)的肽。
其它優(yōu)選的內化肽包括脫輔基脂蛋白A-1和B；肽毒素，例如蜂毒肽、bombolittin、δ-溶血素和pardaxin；抗生素蛋白，例如丙甲甘肽；激素肽，例如降鈣素、促腎上腺皮質激素釋放因子、β-內啡肽、胰高血糖素、甲狀旁腺素、胰腺蛋白；和相應于多種分泌蛋白信號序列的肽。另外，內化肽范例可被取代修飾，如此可增強α螺旋在酸性pH下作為內化肽的性質。
多肽也可以是一個融合蛋白，包含的第一個結構域為選出或設計以與RNAi構建體作用，第二個結構域為選出或設計以賦予多肽靶定位、內化或其它所需功能。
一個RNAi構建體可以與多個種類的多肽預先混合，任選使用幾種不同類型的多肽(例如一個血清蛋白和一個靶定位蛋白)。也可另外包括其它物質，例如以下所述的。
一些美國專利講述了制備輔助攝取、分配和/或吸收物質的方法，其中代表性的并可改進用在RNAi構建體給予上的專利包括但不限于5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,1543,15；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；5,595,756。
本發(fā)明的RNAi構建體也可使用任何藥學上可接受的鹽、酯或這些酯的鹽，或其它任何能夠提供(直接或間接)有生物學活力的代謝物或其殘基的化合物，將它們給予動物體內，包括人體內。因此例如，本文也涉及到RNAi構建體和適合制藥siRNA的鹽，這種RNAi構建體的藥學上可接受的鹽，和其它生物等價物。
藥學上可接受的堿加成鹽通過使用金屬或胺，例如堿和堿土金屬或有機胺來制得。用作陽離子的金屬例如鈉、鉀、鎂、鈣和類似金屬。合適的胺例如N，N1-二芐基乙烯基二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己基胺、乙二胺、N-甲基葡萄胺和普魯卡因(參見Berge等，“Pharmaceutical Salts，″J.of Pharma Sci1977，66，1-19)。所述的酸性化合物的堿加成鹽通過以常規(guī)方式使游離酸形式與足夠量的所需堿接觸來產生。游離酸形式可通過以常規(guī)方式使鹽與一種酸接觸并分離該游離酸來重新得到。游離酸形式與它們各自的鹽在某些物理特性上稍有不同，例如在極性溶劑中的溶解性，但另外，在本發(fā)明里這些鹽與它們各自的游離酸是等價的。如本文所用的，一個“藥用加成鹽”包括本發(fā)明組合物的一種成分的酸形式的藥學上可接受的鹽。這些鹽包括有機或無機酸的銨鹽。優(yōu)選的酸鹽為鹽酸鹽、醋酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽。該領域技術人員熟知的其它合適的藥物學可接受的鹽包括多種無機和有機酸的堿性鹽。
對siRNA寡核苷酸來說，優(yōu)選的藥學可接受的鹽的例子包括(a)與陽離子形成的鹽，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺(例如精胺和亞精胺)等；(b)與無機酸形成的酸加成鹽，例如鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(c)與有機酸形成的鹽，例如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、安息香酸、單寧酸、棕櫚酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸以及類似酸；(d)從元素陰離子形成的鹽，例如氯、溴和碘。
另一方面本發(fā)明提供了氣霧劑用以呼吸道給予RNAi構建體。呼吸道依次包括上呼吸道(包括口咽和喉)和下呼吸道(包括氣管、支氣管和細支氣管)。上呼吸道和下呼吸道被稱為傳導路徑。細支氣管的末端再分成呼吸細支氣管，呼吸細支氣管再連接到終末呼吸帶、氣泡或肺臟深處。
這里，吸入給予RNAi構建體可通過口腔和/或鼻腔進行。氣霧給藥的藥學裝置例如計量吸入器(metered dose inhalers，MDIs)、干粉吸入器(DPIs)和噴氣噴霧器。以下例子所描述的吸入給予核酸的系統(tǒng)可被方便的改進用以給予RNAi構建體，美國專利5,756,353；5,858,784和PCT申請WO98/31346；W098/10796；WO00/27359；WO01/54664；WO02/060412。描述了其它可用以給予雙鏈RNA的氣霧劑的文獻有美國專利6,294,153；6,344,194；6,071,497和PCT申請WO02/066078；WO02/053190；WO01/60420；WO00/66206。此外，可改進吸入給予其它寡核苷酸(例如一個反義寡核苷酸)的方法來給予RNAi構建體。例如Templin等，Anfisense Nucleic Acid DrugDev2000，10359-68；Sandrasagra等，Expert Opin Biol Ther，2001，1979-83；Sandrasagra等Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2002，12177-81所述。
人肺可在在數分鐘到數小時的時間內，除去或快速降解掉可被水解切開的氣霧劑沉積。在上呼吸道，有纖毛的上皮細胞有“黏纖毛清道夫”作用，如此微粒被從呼吸道掃向口腔。Pavia，D.，″LungMucociliary Clearance，″inAerosols and the LungClinical andExperimental Aspects，Clarke，S.W.and Pavia，D.，Eds.，Butterworths，London，1984。在肺深部，肺泡巨噬細胞能在微粒堆積后不久吞噬掉它們。Warheit等Microscopy Res.Tech.，26412-422(1993)；andBrain，J.D.，″Physiology and Pathophysiology of PulmonaryMacrophages，″inThe Reticuloendothelial System，S.M.Reichard andJ.Filkins，Eds.，Plenum，New.York.，pp.315-327，1985。深肺或肺泡，是以吸入治療氣霧劑形式系統(tǒng)給予RNAi構建體的第一位的靶子。
在優(yōu)選的實施方案中，特別是在需要系統(tǒng)定量給予RNAi構建體藥物的情況下，氣霧劑RNAi構建體被配制成微粒形式。直徑在0.5到10微米間的微?？纱┰酱蟛糠痔烊黄琳蠞B入肺部。繞過喉部需要直徑小于10微米；避免被呼出需要的直徑為0.5微米或大一些。
本發(fā)明另一方面涉及到帶有涂層的治療裝置。例如在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種至少其一個表面有涂層的治療裝置，該涂層材料包含試驗聚合物基質和本文公開的含有修飾部分的RNAi構建體。涂層材料可還任選包含非共價連接在RNAi構建體上的蛋白(或者是選出的蛋白，當它從涂層材料上釋放下來后能與RNAi構建體發(fā)生作用)。這種涂層材料可用在手術器械上，例如螺絲、板、墊圈、縫合線、修復術抗基、平頭釘、肘釘、電導線、瓣膜、膜。治療裝置可以是導管、可移植的脈管進入端口、血袋、導血管、中央靜脈導管、動脈導管、脈管移植物、大動脈球泵、心臟瓣膜、心臟血管縫合線、人工心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析單位、血灌流單位、血漿去除單位和適于用在血管中的濾器。
在本發(fā)明的一些實施方案中，用以形成聚合物的單體與一種RNAi構建體結合并混合，以在單體溶液中制造RNAi構建體的均一分散體。然后根據常規(guī)涂層材料處理程序，將該分散體應用于斯滕特固定模或其它裝置，隨后用常規(guī)引發(fā)劑例如UV射線來進行交聯反應。在本發(fā)明的其它實施方案中，一種聚合物成分與一種RNAi構建體結合以形成分散體。這個分散體隨后涂于一個治療裝置的表面然后聚合物交聯以形成固體涂層。在本發(fā)明的其它實施方案中，一種聚合物和一種RNAi構建體與一種合適的溶劑結合以形成分散體，然后根據常規(guī)方式將其應用于斯滕特固定模。隨后用常規(guī)方法除去溶劑(例如加熱蒸發(fā))，隨之聚合物和RNAi構建體(一起形成一種持續(xù)釋放的藥物輸送系統(tǒng))保留在斯滕特固定模上形成涂層?？捎靡环N相似方法，將RNAi構建體溶解在聚合物組合物中。這里RNAi要與一種蛋白預先混合，溶劑進行優(yōu)選以保持蛋白的三級結構。
在本發(fā)明的一些實施方案中，這種系統(tǒng)包含一種相對剛性的聚合物。在另一些實施方案中，這種系統(tǒng)包含一種柔軟和有延展性的聚合物。其它一些實施方案中，這種系統(tǒng)包含一種具有粘性特征的聚合物。聚合物的硬度、彈性、粘性和其它特性根據特定系統(tǒng)的最后物理形態(tài)可在寬范圍里變化，下文將更加詳細的討論。
本發(fā)明的這種系統(tǒng)實施方案有多種形式。在一些實施方案中，系統(tǒng)使用的RNAi構建體懸浮于或分散于聚合物中。在某些實施方案中，系統(tǒng)使用RNAi構建體和一種半固體或凝膠聚合物，它經適于經注射器注射入體內。在本發(fā)明的其它實施方案中，使用RNAi構建體和一種柔軟有韌性的聚合物，它適于使用一種合適的手術方法插入或移植入體內。進一步的，本發(fā)明的一些實施方案使用一種硬固體聚合物，它適于使用一種合適的手術方法插入或移植入體內。仍進一步的，系統(tǒng)使用的RNAi構建體懸浮于聚合物中，這里RNAi構建體和聚合物在一個手術器械上形成涂層，例如螺絲、斯滕特固定模、起搏器等。在本發(fā)明的特殊實施方案中，使用一種硬固體聚合物，它被加工成為手術器械，例如手術螺絲、板、斯滕特固定模等或它們的部分結構。在本發(fā)明的其它實施方案中，系統(tǒng)是使用的聚合物材料的縫合線，RNAi構建體分散或懸浮于其中。
本發(fā)明的一些實施方案提供了一種治療裝置，它有一個基質，基質有一個表面(例如一個外表面)有涂層。涂層材料包含聚合物和分布于其中的RNAi構建體，該聚合物對RNAi構建體有滲透性或可生物降解以釋放RNAi構建體。涂層材料任選進一步包含一種結合于RNAi構建體的蛋白。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用懸浮于或分布于合適聚合物中的RNAi構建體，其中RNAi構建體和聚合物涂層在整個基質上，例如一個手術器械。這種涂層形式可通過噴霧或浸蘸達到。
在本發(fā)明的其它實施方案中，使用的RNAi構建體懸浮于或分布于聚合物內，其中聚合物是剛性的并作為一個裝置的組成部分，以被插入或移植如體內。進一步的，聚合物可包含一個與RNAi構建體非共價作用的多肽。例如本發(fā)明的特別實施方案中，治療裝置為涂了RNAi構建體懸浮于或分散于其中的聚合物的手術螺絲、斯滕特固定模、起搏器等。在本發(fā)明的其它特別實施方案中，RNAi構建體懸浮或分散于其中的聚合物構成一個手術螺絲的尖端或頭部或其部分。在本發(fā)明的其它實施方案中，RNAi構建體懸浮于或分布于其中的聚合物涂層在一個手術器械的表面上，例如手術管道(例如結腸造口術、腹腔灌洗、導尿管和靜脈內管道)。在本發(fā)明的仍然進一步實施方案中，治療裝置為涂層了聚合物和RNAi構建體的靜脈內針。
如上文討論，本發(fā)明的涂層材料包含一種可生物侵蝕或不可生物侵蝕的聚合物。根據系統(tǒng)或裝置最終目的用途來選擇可生物侵蝕或不可生物侵蝕的聚合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用可生物侵蝕的聚合物有利。例如，當使用有涂層的可手術移植的裝置例如螺絲、斯滕特固定模、起搏器等時，使用可生物侵蝕的聚合物有利。本發(fā)明的其它使用可生物侵蝕的聚合物更有利的實施方案包括可移植、可吸入或可注射的RNAi構建體懸浮于或分布于其中的聚合物，其中沒有使用次級元件(例如螺絲或固定錨)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，聚合物的滲透性和生物可蝕性差，聚合物的生物侵蝕速率與RNAi構建體釋放速率相比足夠低，以使聚合物在RNAi釋放后在原位保持相當長時期，但最終聚合物被生物侵蝕并被周圍組織再吸收。例如當使用含有RNAi構建體懸浮于或分布于其中的聚合物的生物可蝕縫合線時，有利做法是聚合物的生物侵蝕速率足夠慢，使得RNAi構建體在約14d的時期內以線性方式釋放，但縫合線保持時間為約3周到6周。本發(fā)明的類似治療裝置包括包含了RNAi構建體懸浮于或分布于其中的生物可蝕聚合物的手術釘。
在本發(fā)明的其它實施方案中，有利做法是聚合物的生物侵蝕速率與RNAi構建體釋放速率相同。例如，當使用RNAi構建體懸浮于或分布于其中的聚合物涂層在一個手術器械(例如一個整形螺絲、斯滕特固定模、起搏器或非生物可蝕縫合線)上時，有利做法是聚合物的生物侵蝕速率可使得直接暴露于周圍體組織的RNAi構建體的表面積在一個時期內保持顯著穩(wěn)定。
在本發(fā)明的其它實施方案中，聚合物載體在周圍組織中例如血漿，可被水滲透。在這種情況下，水溶液可滲過聚合物，由此接觸RNAi構建體?？赏ㄟ^復合設置變量來控制溶解速率，例如聚合物的滲透性、RNAi構建體的溶解性、生理液的pH值、離子強度和蛋白組合物等。
在本發(fā)明的一些實施方案中，聚合物是非生物可蝕的。在使用聚合物涂布或構成手術器械的組成部分，而該器械適于永久或半永久插入或移植到體內的情況下，非生物可蝕聚合物尤其有效。聚合物有益構成手術器械的永久涂層的范例包括整形螺絲、斯滕特固定模、修復術關節(jié)、人工瓣膜、永久縫合線、起搏器等。
在經皮穿刺腔內冠狀動脈血管成形術后可使用多種不同斯滕特固定模。盡管根據本發(fā)明可使用任何數目的斯滕特固定模，但為簡單起見，在本發(fā)明的范例實施中將描述有限數目的斯滕特固定模。技術人員將意識到關于本發(fā)明可使用任何數目的斯滕特固定模。另外如上文所述，也可使用其它治療裝置。
通常將一個斯滕特固定模留在一個輸送管內腔內作為管狀結構以減輕阻塞。通常以非膨脹方式將斯滕特固定模插入到內腔，然后在原位自膨脹或者在第二種裝置的輔助下膨脹。一種典型的膨脹方法是通過使用在變窄的脈管或體內通道中膨脹的導管固定的血管成形術氣囊，以剪切或裂解結合在脈管壁成分上的栓塞并獲得擴大的內腔。本發(fā)明的斯滕特固定模可用多種方法制造。例如，可用激光、放電磨、化學蝕刻或其它方法制得空腔或不銹鋼管，再用以制得斯滕特固定模。將其以非膨脹形式插入到體內所需位置。在一個范例實施方案中，可通過氣囊導管在血管中進行膨脹，而斯滕特固定模的最終直徑是所用氣囊導管直徑的函數。
本發(fā)明的斯滕特固定模也可使用一種形狀記憶材料，包括如合適的鎳鈦合金或不銹鋼。
不銹鋼結構可預先設置形狀并發(fā)生自膨脹，例如將其扭成辮子狀。在這個實施方案中，斯滕特固定模在成型后可壓縮到足夠小以允許其被插入到血管或其它組織中，這里插入方法包括合適的導管或柔韌性棒。
通過導尿管導入后，斯滕特固定模可被設置膨脹到所需形狀，膨脹為自發(fā)的或被壓力、溫度或電刺激的變化引發(fā)。
不管如何設計斯滕特固定模，它優(yōu)選包含具有足夠特異性和濃度的RNAi構建體和蛋白(當使用時)以在損害部位提供有效劑量。在這方面，涂層的“庫容量”優(yōu)選適于足以在所需部位按所需量應用RNAi構建體。
在另一范例實施方案中，斯滕特固定模的整個外表面和內表面被治療劑量的RNAi構建體和蛋白(任選使用)所涂布。然而需要注意的是，涂布方法可根據RNAi構建體和任何所用蛋白來進行變化，也可根據包括斯滕特固定?；蚱渌粌戎委熝b置的物料進行變化。
腔內治療裝置包括緩釋遞藥涂層。RNAi構建體涂層可用于斯滕特固定模，通過使用常規(guī)涂布方法，例如灌注涂布、噴霧涂布和浸蘸涂布。
在一個實施方案中，腔內治療裝置包含拉長的徑向膨脹的管狀斯滕特固定模，它有一個網眼狀內表面，而相對的外表面沿斯滕特固定模的一個軸縱向擴展。這種斯滕特固定模可包括一個可移植的永久性斯滕特固定模，一個可移植的移植的斯滕特固定?；蛞粋€臨時性斯滕特固定模，這里臨時性斯滕特固定模定義為一個可在脈管內膨脹并隨后被重新抽出的斯滕特固定模。斯滕特固定模構型可包括盤繞斯滕特固定模、盤繞的有記憶作用的斯滕特固定模、鎳鈦諾斯滕特固定模、網眼狀斯滕特固定模、支架斯滕特固定模、袖狀斯滕特固定模、可滲透斯滕特固定模、有溫度傳感器的斯滕特固定模、多孔斯滕特固定模，以及類似裝置。斯滕特固定模可按常規(guī)方式展開，例如通過一個膨脹的氣囊導管，通過自展開機制(在從導尿管上釋放后)，或者通過其它適合方式。拉長的徑向性膨脹的管狀斯滕特固定?？梢詾橐浦驳乃闺毓潭＃@里移植的斯滕特固定模是一個復合裝置，在移植片的內部或外部有一個斯滕特固定模。這種移植片可以是脈管移植片，例如ePTFE移植片、生物學斯滕特固定?；蚓幙椧浦财?br> 可通過許多方法來使RNAi構建體和任何結合蛋白包含到斯滕特固定模上或附著于斯滕特固定模上。在該范例實施方案中，RNAi構建體直接加入到聚合物基質中并噴于斯滕特固定模的外表面上。RNAi構建體在一段時間內從聚合物基質上洗脫下來并進入周圍組織。優(yōu)選使RNAi構建體保留在斯滕特固定模至少3d，最高到約6個月，更優(yōu)選時間為7-30d。
在某些實施方案中，本發(fā)明的聚合物包括任何生物學上可容忍的聚合物，它們對RNAi構建體有滲透性，因為具有滲透性所以它們不是RNAi構建體從聚合物釋放的速率的主要速率決定因子。
在本發(fā)明的一些實施方案中，聚合物是非生物可蝕的。本發(fā)明中有效的非生物可蝕聚合物包括如聚(乙烯-共-醋酸乙烯)(EVA)、聚乙烯醇和聚氨基甲酸酯(例如基于聚甲酸甲酯的聚氨基甲酸酯)。在本發(fā)明的其它實施方案中，聚合物是生物可蝕的。本發(fā)明中有效的生物可蝕聚合物的實例包括如聚酐、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚原酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯或它們的衍生物和共聚物。本領域的技術人員會意識到聚合物的生物可蝕性或非生物可蝕性要根據系統(tǒng)的最終物理形式來選擇，下文將更加詳細的描述。其它聚合物范例包括聚硅樹脂和來自透明質酸的聚合物。本領域的技術人員將理解本發(fā)明的聚合物在適合賦予其滲透性的條件下制備，這樣聚合物就不是RNAi構建體從聚合物釋放的速率的主要速率決定因子。
而且，合適的聚合物包括自然聚合(膠原質、透明質酸等)或合成材料，它們與體液和哺乳動物組織是生物相容的，同時本質上不溶于將要接觸的體液。此外，合適的聚合物能本質上防止分布/懸浮于其中的RNAi構建體與體液蛋白成分的相互作用。在某些實施方案中，避免使用快速溶解的聚合物或高度溶于體液的聚合物或允許RNAi構建體與內源性蛋白成分作用的聚合物，因為聚合物的溶解或RNAi構建體與內源性蛋白成分的作用會影響藥物釋放的持續(xù)性。當RNAi構建體預先在涂層材料中與蛋白結合時，聚合物選擇發(fā)生變化。
其它合適的聚合物包括聚丙烯、聚酯、聚乙烯-醋酸乙烯(PVA或EVA)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚環(huán)氧丙烷、聚羧酸、聚烷基丙烯酸酯、纖維素酯、硅樹脂、聚(d1-丙交酯-共-乙交酯)、各種Eudragrits(例如NE30D、RS PO和RL PO)、聚烷基-烷?；┧狨ス簿畚铩⒕埘?聚氨基甲酸酯嵌段共聚物、聚乙醚-聚氨基甲酸酯嵌段共聚物、聚二氧六環(huán)酮、聚-(β-羥基丁酸酯)、聚乳酸(PLA)、聚己內酯、聚羥基乙酸和PEO-PLA共聚物。
制備本發(fā)明的涂層材料可混合一種或多種單體與一種合適RNAi構建體，隨后單體多聚化以形成聚合物系統(tǒng)。在這種方法中，RNAi構建體和任何結合蛋白都溶解或散布于聚合物中。在其它實施方案中，RNAi構建體和任何結合蛋白在液體聚合物中或聚合物分散體中混合，隨后聚合物被進一步處理以形成本發(fā)明的涂層材料。合適的后續(xù)處理可包括與合適的交聯RNAi構建體進行交聯，液體聚合物或聚合物分散體的進一步聚合，與合適的單體共聚合，與合適嵌段多聚物進行嵌段多聚化等。后續(xù)處理在聚合物中束縛了RNAi構建體因此RNAi構建體懸浮于或分散于聚合物載體中。
可使用任何數目的非生物可蝕聚合物與RNAi構建體結合。在本文中可用的薄層聚合物可以為可吸收或不可吸收，同時必須生物可容以最大程度降低對脈管壁的刺激。根據所需釋放速率或所需穩(wěn)定性，聚合物可為體內穩(wěn)定或生物可吸收，但優(yōu)選使用生物可吸收聚合物，因為它不同于體內穩(wěn)定聚合物，不會在移植后長期存在因而不會引起任何不利、慢性局部反應。而且，生物可吸收聚合物不會引起以下風險，即經過長時間后，生物環(huán)境壓力可能會引起斯滕特固定模和涂層材料間的附著力喪失，這樣涂層材料會離開原位，同時甚至在斯滕特固定模被包在組織中的情況下也會引起后續(xù)問題。
合適的可用成膜生物可吸收的聚合物包括選自脂肪族聚酯、聚(氨基酸)、乙醚-酯共聚物、聚亞烴基草酸酯、聚酰胺、聚亞氨甲酸酯、聚原酸酯、聚草酸酯、聚氨基酯、含氨基基團的聚草酸酯、聚酐、含磷氮鏈聚合物、生物分子和它們的混合物。用于本發(fā)明的脂肪族聚酯包括丙交酯的同聚物和共聚物(包括乳酸d-，1-和內消旋交酯)、ε-己內酯、乙交酯(包括羥基乙酸)、羥基丁酸酯、羥基戊酸酯、對二氧六環(huán)酮(para-dioxaone)、三亞甲基甲酸酯(和它的烷基衍生物)、1，4-二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、1，5-二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、6，6-二甲基-1，4-二氧雜環(huán)己烷-2-酮和它們聚合物混和物。用于本發(fā)明的聚亞氨基甲酸酯可見Kemnitzer and Kohn，Handbook of Biodegradable Polymer，edited by Domb，Kost and Wisemen，Hardwood AcademicPress，1997，pages 251-272。用于本發(fā)明的醚-酯共聚物包括Journal ofBiomaterials Researsh，Vol.22，pages 993-1009，1988，by Cohn andYounes.Cohn，Polymer Preprints(ACS Division of Polymer Chemistry)Vol.30(1)，page 498，1989(e.g.PEO/PLA)所述醚-酯共聚物。用于本發(fā)明的聚亞烴基草酸酯例子可見美國專利4,208,511；4,141,087；4,130,639；4,410,678；4,105,034；4,205,399(通過引用結合到本文)。由L-丙交酯、D，L-丙交酯、乳酸、乙交酯、羥基乙酸、對二氧六環(huán)酮、三亞甲基甲酸酯和ε-己內酯制備的含磷氮鏈聚合物、共-、三-和更多種單體為基礎的聚合物，可見Allcock in The Encyclopedia ofPolymer Science，Vol.13，pages 31-41，Wiley Intersciences，John Wiley& Sons，1988 and by Vandorpe，Schacht，Dejardin and Lemmouchi inthe Handbook of Biodegradable Polymers，edited by Domb，Kost andWisemen，Hardwood Academic Press，1997，pages 161-182(通過引用結合到本文)。由HOOC-C6H4-O-(CH2)m-O-C6H4-COOH(其中m為2到8的整數)形式的二羧酸以及它們與一到十二碳的α-Ω脂肪二酸共聚物制備聚酐。聚草酸酯、聚草酰胺和含胺基和/或氨基基團的聚草酸酯的例子可見以下文獻的一篇或更多，美國專利NOS.5,464,929；5,595,751；5,597,579；5,607,687；5,618,552；5,620,698；5,645,850；5,648,088；5,698,213；5,700,583；(通過引用結合到本文)。聚原酸酯的例子可見Heller in Handbook of Biodegradable Polymers，editedby Domb，Kost and Wisemen，Hardwood Academic Press，1997，pages99-118(通過引用結合到本文)。用于本發(fā)明的形成薄層的多聚生物分子包括可在人體內酶解或可水解的天然聚合物，例如纖維蛋白、纖維蛋白原、膠原質、彈性蛋白，和可吸收的生物可容的聚糖，例如殼聚糖、淀粉、脂肪酸(和它們的酯)、葡萄糖-聚糖和透明質酸。
具有相對低慢性組織反應的合適形成薄層的生物穩(wěn)定聚合物，例如聚氨基甲酸酯、硅樹脂、聚(甲基)丙烯酸酯、聚酯、聚環(huán)氧烷(聚環(huán)氧乙烷)、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，也可用水凝膠，例如來自交聯聚乙烯吡咯烷酮和聚酯。如果可在斯滕特固定模上溶解、固化(cured)或聚合，也可以使用其它聚合物。這些聚合物包括聚烯烴、聚異丁烯和乙烯-α烯烴共聚物；丙烯酸聚合物(包括甲基丙烯酸酯)和共聚體，乙烯基鹵聚合物和共聚體(例如聚乙烯氯化物)；聚乙烯酯(例如聚乙烯甲酯)；聚偏二鹵乙烯(例如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯)；聚丙烯腈、聚乙烯酮；聚乙烯芳香化合物例如聚苯乙烯；聚乙烯酯例如聚乙烯醋酸酯；乙烯基單體共聚物和乙烯石蠟共聚物，例如乙烯-甲基甲基丙烯酸酯共聚物，丙烯腈-苯乙烯共聚物，ABS樹脂和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；聚酰胺化合物，例如Nylon66和聚己內酰胺；醇酸樹脂；聚甲酸酯；聚甲醛；聚酰亞胺；聚酯；環(huán)氧樹脂、聚氨基甲酸樹脂；人造纖維；三醋酸基人造纖維、纖維素、醋酸纖維素、醋酸丁酸纖維素；玻璃紙；硝酸纖維素；丙酸纖維素；纖維素酯(也就是羧甲基纖維素和羥烷基纖維素)；和它們的組合。用于本發(fā)明的聚酰胺化合物也可包括以下形式的化合物，-NH-(CH2)n-CO-和NH-(CH2)x-NH-CO-(CH2)y-CO，其中n優(yōu)選為6到13的整數，x為6到12的整數，y為4到16的整數。上文列舉僅為說明而不是限定。
用以涂布的聚合物可為成膜聚合物，其分子量足夠高以不表現蠟質或微粘性。聚合物也應黏著到斯滕特固定模上，并且在斯滕特固定模沉積后不應容易變形致使能夠被血液動力學壓力驅動轉移。聚合物分子量應足夠高以提供足夠的韌性從而使聚合物不會在斯滕特固定模的處理和展開過程中被摩擦掉下，同時其不應在膨脹過程中破裂。在某些實施方案中，聚合物的熔融溫度高于40℃，優(yōu)選約高于45℃，更優(yōu)選高于50℃，最優(yōu)選高于55℃。
涂層材料可通過在涂層混合物中將一種或多種治療RNAi構建體和涂層聚合物混合來制得。RNAi構建體可以以液體形式、細碎的固體形式或其它合適的物理形式出現?；旌衔锟扇芜x包含一種或多種與RNAi構建體結合的蛋白，也可任選包含一種或多種添加劑，例如非毒性輔助物，如稀釋劑、載體、賦形劑、穩(wěn)定劑或類似物質。其它合適的添加劑可與聚合物和RNAi構建體一起形成。例如選自上文所列的生物可容性成膜聚合物的親水性聚合物可被添加到一種生物可容的疏水性涂層材料中，以改進后者的釋放性能(或者一種疏水性聚合物可被添加到一種親水性涂層材料中以改進釋放性能)。又例如將選自聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素以及它們的組合的親水性聚合物添加到脂肪族聚酯涂層材料中以改進釋放性能?？赏ㄟ^體外和/或體內探測治療RNAi構建體的釋放性能來確定合適的相對量。
涂層的厚度決定了RNAi構建體從基質上的洗脫速率。本質上RNAi構建體通過在聚合物基質中擴散從基質上洗脫。聚合物是可滲透的，因此允許固體、液體和氣體從其中脫離。聚合物基質的總厚度范圍從約1微米到約20微米或更厚。需要指出的是在聚合物基質被黏著到治療裝置上以前可以使用底漆層和金屬表面處理方法。例如，酸清洗、堿(堿基)清洗、鹽化和聚對二甲苯沉積可用作全部所述程序的組成部分。
為了進一步闡明，聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚丁基甲基丙烯酸酯和RNAi構建體可以多種方式加入到斯滕特固定模的內部或外部。例如可將溶液噴到斯滕特固定模上或者用斯滕特固定模浸蘸溶液。其它方法包括旋轉涂布和RF等離子聚合作用。在一個實施范例中，溶液被噴到斯滕特固定模上并使之干燥。在另一實施范例中，使溶液帶一種電荷而斯滕特固定模帶相反電荷。按這種方式，溶液和斯滕特固定模會互相吸引。使用這種噴霧方法可以減少浪費并可以對涂層的厚度進行更精確的控制。
在另一實施范例中可將RNAi構建體加入成膜聚氟基共聚體中，它包含一定量的第一組分，選自亞乙烯氟化物聚合物和四氟乙烯聚合物，并包含一定量的不同于第一組分的第二組分，兩者發(fā)生共聚合，從而產生聚氟基共聚體。第二組分為共聚體提供韌性或彈性，這里兩者的比例應可為涂層材料和產生的薄層有效提供可用以有效處理可移植治療裝置的特性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，腔內治療裝置的可膨脹管狀斯滕特固定模的外表面涂層了本發(fā)明的涂層材料。有涂層的斯滕特固定模的外表面是接觸組織的表面并是生物可容的。“持續(xù)釋放RNAi構建體的給予系統(tǒng)的涂層表面”的同義于“涂層表面”，即被本發(fā)明的持續(xù)釋放RNAi構建體的遞藥系統(tǒng)所涂布、覆蓋或浸滲的表面。
在另一實施方案中，本發(fā)明腔內治療裝置拉長的徑向膨脹的管狀斯滕特固定模的內腔表面或整個表面(也就是內表面和外表面)有涂層。被本發(fā)明持續(xù)釋放RNAi構建體的給予系統(tǒng)所涂布的內腔表面也是流體接觸面，并且也是生物可容和血液可容的。
V應用范例總體上RNAi已被證實為一種可有效操縱任何必需基因表達的技術，它適合于絕大多數生物包括人。因此本文公開的RNAi構建體和制劑可被用以降低任何必需靶基因的表達，期望這種表達降低能提供所需結果，例如一種疾病的緩解(包括偶然因子和癥狀)或者預防危險人群個體患某種病。只需要根據本詳述提供的和本領域的一般方法選擇所需靶基因和設計合適的RNAi構建體。在對活體受試者給藥以前，這種RNAi構建體可在體外細胞培養(yǎng)物和組織培養(yǎng)物上進行試驗。也可在與受試者種類密切相關的生物物種進行試驗(例如在對人體應用前可在猴子模型上試驗)。
一方面，試驗方法用以抑制或至少降低體內不希望的細胞生長，尤其是轉化細胞的生長。在某些實施方案中，試驗方法使用RNAi構建體以選擇性抑制編碼增殖調節(jié)蛋白的基因表達。例如，試驗方法可用以抑制靶細胞內有絲分裂所必需的基因產物的表達，和/或防止靶細胞凋亡的基因產物的表達。本發(fā)明的RNAi構建體可根據靶增殖調節(jié)蛋白編碼mRNA的編碼序列或其它部分進行設計。用該RNAi構建體處理靶細胞引起表型表達丟失，從而使得細胞不生長或發(fā)生凋亡。
在某些實施方案中，選擇試驗RNAi構建體以抑制刺激細胞生長和有絲分裂的基因產物的表達。一類可作為本發(fā)明方法靶子的基因是癌基因。這里使用的“癌基因”術語指這樣一個基因，它刺激細胞生長，并且當它的胞內表達水平被減少時，細胞生長速率也減少或細胞變?yōu)椴簧L。本文中癌基因包括胞內蛋白的基因，也包括胞外生長因子的基因，這些生長因子可通過自分泌或旁分泌作用刺激細胞增殖。RNAi構建體可根據其設計的人癌基因包括c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I(蛋白激酶A種類I)、Ab1-1、Bcl2、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、細胞周期蛋白、依賴細胞周期蛋白的激酶(cdks)、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos和src，還有許多未命名的。本發(fā)明中的癌基因也包括源自染色體易位的融合基因，例如Bcr/Ab1融合癌基因。
在某些優(yōu)選的實施方案中，根據其抑制轉化細胞(尤其是瘤細胞)的增殖必需基因表達的能力選擇試驗RNAi構建體。這種RNAi構建體可用作對體內瘤細胞、退行發(fā)育細胞和/或畸形生長細胞生長的治療和預防措施的一部分，也可用作對腫瘤治療措施的一部分。c-myc蛋白在許多種癌癥中被解除控制，從而引起表達提高。體外降低c-mycRNA水平引起凋亡。一個與c-myc蛋白RNA互補的siRNA由此可用作癌癥治療。優(yōu)選的，試驗RNAi構建體用以治療慢性淋巴白血病。慢性淋巴白血病經常由于9號和12號染色體的易位而引起。易位產生了Bcr/Ab1融合產物，其融合蛋白產物有致癌物作用。因此特異的除去Bcr/Ab1融合mRNA可引起白血病細胞的死亡。事實上，將特異于Bcr/Ab1融合mRNA的siRNA轉染入培養(yǎng)的白血病細胞，不僅減少了融合mRNA和相應蛋白致癌產物，也誘導了這些細胞的凋亡(參見Wilda等，Oncogene，2002，215716-5724)。
在其它實施方案中，根據其抑制淋巴細胞活化(例如B細胞或T細胞的增殖)尤其是抗原介導的淋巴活化的必需基因的能力來選擇RNAi構建體。這種RNAi構建體可用作免疫抑制劑，例如作為對免疫介導的炎癥的治療和預防措施的一部分。
在某些實施方案中，本文描述的方法可用以治療自體免疫失調。例如，根據其抑制細胞因子編碼或調節(jié)基因表達的能力來選擇試驗RNAi構建體。因此能抑制或降低細胞因子(例如THFα、IL-1α、IL-6或IL-12，或它們的組合)表達的RNAi構建體可用作對風濕性關節(jié)炎的治療和預防措施的一部分。與此相似，能抑制或降低炎癥相關細胞因子表達的RNAi構建體可用以治療或預防炎癥或炎癥相關疾病，例如多發(fā)性硬化癥。
在其它實施方案中，根據其抑制糖尿病發(fā)作或發(fā)展相關基因表達的能力來選擇試驗RNAi構建體。例如實驗糖尿病已被發(fā)現與p21WAF1/CIP1(p21)的表達提高有關，TGFβ1也涉及到腎小球肥大(參見Al-Douahji，等Kidney Int.561691-1699)。因此，抑制或降低這些蛋白表達的RNAi構建體可用以治療或預防糖尿病。
在其它實施方案中，根據其抑制ICAM-1(胞內粘著分子)基因表達的能力來選擇試驗RNAi構建體。Isis pharmaceutic公司開發(fā)了一種可抑制ICAM-1表達的反義核酸來治療牛皮癬。另外，一種抑制ICAM-1基因表達的反義核酸被建議用來預防急性腎衰竭和再灌注損傷以及延長異體腎移植的存活(如HaUer等(1996)Kidney Int.50473-80；Dragun等(1998)Kidney Int.54590-602；Dragun等(1998)Kidney Int.542113-22)。因此，本發(fā)明的RNAi構建體預期可用以治療上述疾病。
在其它實施方案中，根據其抑制平滑肌細胞或其它血管內皮細胞增殖必需基因表達的能力來選擇試驗RNAi構建體。例如涉及新血管內膜形成的增殖細胞。在這種實施方案中，試驗方法可用作對血管再狹窄的治療和預防措施的一部分。
在血管成形術后針對血管內皮細胞使用RNAi構建體可減少這些細胞在操作后的增殖(此例僅為說明)。具體例子如與c-myc(一個癌基因)互補的siRNA(此例僅為說明)。c-myc的減量調節(jié)抑制細胞生長。因此，可通過合成以下寡核苷酸來制備siRNA5′-UCCCGCGACGAUGCCCCUCATT-3′3′-TTAGGGCGCUGCUACGGGGAGU-5′除了粗體顯示的胸腺嘧啶核苷為脫氧核糖核酸(為了更加穩(wěn)定)外，其它所有堿基均為核糖核酸核苷。雙鏈RNA可通過如下方法制備，在10mM Tris-HCl(pH7.0)和20mM NaCl中等摩爾濃度混合上述寡核苷酸，再加熱至95℃，然后緩慢降溫到37℃。所得siRNA可通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并以游離形式或與給予系統(tǒng)(如環(huán)糊精聚合物)結合給予細胞。就體外實驗而言，該siRNA的作用可通過生長曲線分析、RT-PCR或c-myc蛋白的westerrn blot分析來監(jiān)測。
已闡明直接針對c-myc基因的反義寡脫氧核苷酸在冠狀動脈斯滕特固定模移植后通過局部給藥立即抑制了血管再狹窄(參見Kutryk等(2002)J Am Coll Cardiol.39281-287；Kipshidze等(2002)J ArnColl Cardiol.391686-1691)。因此，本發(fā)明關注通過滲透給予系統(tǒng)(Interventional Techmologies，San Diego，California))將針對c-Myc基因的RNAi構建體(也就是c-Myc RNAi構建體)給予至斯滕特固定模移植位點。優(yōu)選的，c-Myc RNAi構建體直接涂在斯滕特固定模上以抑制再狹窄。與此相似，c-Myc RNAi構建體可通過局部給予以在經皮穿刺內腔冠狀動脈成形術(PTCA)后抑制小葉間動脈肌層增生，這種局部導入方法可參見Kipshidze等(2001)Catheter CardiovascInterv.54247-56。優(yōu)選的，這種RNAi構建體可被化學修飾，例如用硫代磷酸酯或氨基磷酸酯修飾。
早期生長反應因子-1(也就是Egr-1)是一種轉錄因子，它在機械損傷機制中被激活并調控許多細胞增殖和遷移相關基因的轉錄。因此，減量調節(jié)這個蛋白也可是一個防止再狹窄的途徑?？赏ㄟ^合成以下寡核苷酸來制備直接針對Egr-1基因的siRNA5′-UCGUCCAGGAUGGCCGCGGTT-3′3′-TTAGCAGGUCCUACCGGCGCC-5′同樣，除了粗體顯示的胸腺嘧啶核苷為脫氧核糖核酸外，其它所有堿基均為核糖核酸核苷。如本文所述siRNA可通過這些寡核苷酸來制備，并導入細胞。
實施例現在已從總體上描述了本發(fā)明，通過以下實施例將能更好的理解本發(fā)明。這些實施例僅為說明本發(fā)明的某些方面和實施方案，并不是為了限制本發(fā)明。
實施例1.提高修飾DNA:RNA構建體的血清穩(wěn)定性原料預合成雙鏈(均來自Dharmacon)
siFAS[MW 13317.2g/mol]5′GUGCAAGUGCCAACCAGACTT3′3′TTCACGUUCACGUUUGGUGUG5′siFAS2[MW 13475.1g/mol]5′PGUGCAAGUGCAAACCAGACTT 3′3′TTCACGUUCACGUUUGGUCUGP 5′其中P＝磷酸基團siEGFPb[MW 13323.1g/mol]5′GACGUAAACGGCCACAAGUUC 3′3′CGCUGCAUUUGCCGGUGUUCA5′FL-pGL2[MW 13838.55g/mol]5′XCGUACGCGGAAUACUUCGATT3′3′TTGCAUGCGCCUUAUGAAGCU5′其中X＝熒光素(fluorescein)單鏈EGFPb-ss-有義(Dhannacon)[MW 6719.2g/mol]RNA，磷酸二酯5′GACGUAAACGGCCACAAGUUC3′EGFPb-ss-反義(Dhannacon)RNA，磷酸二酯5′ACUUGUGGCCGUUUACGUCGC3′JH-1(Caltech Oligo Synthesis Facility)DNA，硫代磷酸酯5′GACGTAAACGGCCACAAGTTCX 3′其中X＝TAMRAjhDNAs-1(Caltech Oligo Synthesis Facility)DNA，磷酸二酯5′GACGTAAACGGCCACAAGTTC3′jhDNAs-2(Caltech Oligo Synthesis Facility)
DNA，磷酸二酯5′GACGTAAACGGCCACAAGTTCX 3′其中X＝TAMRA雙鏈形成(退火)根據Dharmacon推薦方法制得雙鏈。簡單的說，一體積的有義鏈(50μM μM)和一體積的反義鏈(50μM)在一半體積的5×反應緩沖液(100mM KCl，30mM HEPES-KOH pH7.5，1.0mM MgCl2)里反應。反應混合物加熱至90℃保持1min使雙鏈變性，然后在37℃孵化1h以退火，再保存于-20℃。退火后雙鏈用凝膠電泳確認(15％TBE凝膠)。
體外小鼠血清穩(wěn)定性結果用凝膠電泳檢測暴露于小鼠血清(非熱失活)中的雙鏈穩(wěn)定性。取5μM雙鏈溶液10μl，加到相同體積的無DNase、RNase水或活性小鼠血清(Sigma)中37℃孵化4h。然后取一半體積(10μl)反應液加到相同體積的5mg/mL的硫酸乙酰肝素液(Sigma，水溶液)中，并在室溫下孵化5min。每20μL反應液中加4μL上樣緩沖液，所得24μL溶液加入到10孔，15％TBE凝膠中電泳，100V進行75min。完畢后，凝膠在50mL 0.5μg/mL的溴化乙錠(在1×TBE緩沖液中)室溫孵化30min，然后拍照。
我們得到的結果顯示在與90％小鼠血清接觸4h后，siFAS2幾乎完全降解，而JH-1EFGPb-ss-反義雜交體則基本無降解。見圖1和圖2。
實施例2.改善的DNA:RNA構建體體內被攝取性能四只小鼠均按2.5mg/kg通過HPTV注射雙鏈核酸，注射種類詳細如下IDDuplexFl siFAS2(未標記)，裸Gi FL-pGL2(5′熒光素)，裸
Ml JH-1EGFPb-anti(3′TAMRA)，裸Ni JH-1EGFPb-anti(3′TAMRA)，CDP4mid，2080AdPEGLacAdPEG注射24h后，處死小鼠并收集肝臟，然后浸于O.C.T低溫保藏化合物中，保藏于-80℃。煩請Morgan(Triche lab)制備了薄切片(未添加固定劑或復染劑)，立即共聚焦顯微檢查。
注射24h后，注射F1和G1的鼠肝臟均未見熒光，而注射M1的鼠肝臟有明顯熒光。見圖3A-3D。
序列表<110>加州理工學院(California Institute of TechnologyDavis，Mark E.)<120>改進的抑制劑核酸<130>CTCH-PW0-020<140>PCT/US04/22683<141>2004-07-15<150>US 60/487,570<151>2003-07-15<150>US 60/528,143<151>2003-12-08<160>21<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>1
atgcatgcat gcatgcatg 19<210>2<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>2Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg1 5 10 15Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser20 25<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>3Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>4Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys1 5 10<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>化學合成<400>5ucccgcgacg augccccuca tt 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>6ugaggggcau cgucgcggga tt 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>7ucguccagga uggccgcggt t 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>8ccgcggccau ccuggacgat t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>9
gugcaagugc caaccagact t 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>10gugugguuug cacuugcact t 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<221>misc_feature<222>1<223>磷酸基團位于5’端<400>11gugcaagugc aaaccagact t 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<221>misc_feature<222>1<223>磷酸基團位于5’端<400>12gucugguuug cacuugcact t 21<210>13<211>21<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>化學合成<400>13gacguaaacg gccacaaguu c 21<210>14<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>14acuuguggcc guuuacgucg c 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<221>misc_feature<222>1<223>熒光素位于5’端<400>15cguacgcgga auacuucgat t 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>16ucgaaguauu ccgcguacgt t 21<210>17<211>21<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>化學合成<400>17gacguaaacg gccacaaguu c 21<210>18<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>18acuuguggcc guuuacgucg c 21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<221>misc_feature<222>21<223>TAMRA位于3’端<400>19gacgtaaacg gccacaagtt c 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>化學合成<400>20gacgtaaacg gccacaagtt c 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>化學合成<221>misc_feature<222>21<223>TAMRA位于3’端<400>21gacgtaaacg gccacaagtt c 2權利要求
1.一種通過RNA干擾機制抑制靶基因表達的雙鏈核酸，該雙鏈核酸包含a)含有一個或多個修飾部分或修飾核苷酸的DNA有義多核苷酸鏈；和b)具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以抑制靶基因的表達。
2.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述DNA有義多核苷酸含有硫代磷酸酯部分。
3.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其等電點pH值(pI)提高至少0.5個單位。
4.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述DNA鏈含有至少50％的修飾核苷酸。
5.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述DNA鏈含有100％的修飾核苷酸。
6.權利要求1的雙鏈核酸，所述雙鏈核酸含有一個或多個錯配堿基對。
7.權利要求6的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值，低于RNA反義多核苷酸鏈相同但DNA有義多核苷酸鏈與其完全匹配互補的雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值。
8.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述反義多核苷酸中的50％或更少的核苷酸為修飾核苷酸。
9.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高。
10.權利要求9的雙鏈核酸，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高至少1個logP單位。
11.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸是發(fā)夾結構核酸，其在細胞中被加工成siRNA。
12.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸長為19-100bp。
13.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸在10％血清存在下被培養(yǎng)的細胞內化達到穩(wěn)態(tài)水平，該水平至少是具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸水平的2倍。
14.權利要求1的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸在人或小鼠體內的血清半衰期，至少是具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸血清半衰期的2倍。
15.一種給予生物體RNAi核酸的藥物制劑，所述組合物包括藥學上可接受的載體和雙鏈核酸，該雙鏈核酸包含a)含有一個或多個修飾部分或修飾核苷酸的DNA有義多核苷酸鏈；和b)具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以抑制靶基因的表達。
16.權利要求15的制劑，所述制劑進一步包含多肽。
17.權利要求16的制劑，其中所述多肽是血清多肽。
18.權利要求16的制劑，其中所述多肽是細胞靶定位多肽。
19.權利要求18的制劑，其中所述細胞靶定位多肽是含有多個半乳糖部分的多肽，用以靶定位到肝細胞。
20.權利要求18的制劑，其中所述細胞靶定位多肽是轉鐵蛋白多肽，用以靶定位到瘤細胞。
21.權利要求18的制劑，其中所述細胞靶定位多肽是抗體，用以選擇性結合目的細胞。
22.權利要求15的制劑，其中所述雙鏈核酸含有一個或多個錯配堿基對。
23.權利要求23的制劑，其中所述雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值，低于RNA反義多核苷酸鏈相同但DNA有義多核苷酸鏈與其完全匹配互補的雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值。
24.權利要求15的制劑，其中所述DNA鏈含有至少50％的修飾核苷酸。
25.權利要求15的制劑，其中所述DNA鏈含有100％的修飾核苷酸。
26.權利要求15的制劑，其中所述DNA有義多核苷酸含有硫代磷酸酯部分。
27.權利要求15的制劑，其中所述反義多核苷酸中的50％或更少的核苷酸為修飾核苷酸。
28.權利要求15的制劑，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高。
29.權利要求15的制劑，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高至少1個logP單位。
30.權利要求15的制劑，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其等電點pH值(pI)提高至少0.5個單位。
31.權利要求15的制劑，其中所述雙鏈核酸是發(fā)夾結構核酸，其在細胞中被加工成siRNA。
32.權利要求15的制劑，其中所述雙鏈核酸長為19-100bp。
33.權利要求15的制劑，其中所述雙鏈核酸在10％血清存在下被培養(yǎng)的細胞內化達到穩(wěn)態(tài)水平，該水平至少是具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸水平的2倍。
34.權利要求15的制劑，其中所述雙鏈核酸在人或小鼠體內的血清半衰期，至少是具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸血清半衰期的2倍。
35.權利要求15的制劑，其中所述藥學上可接受的載體選自藥學上可接受的鹽、酯和這類酯的鹽。
36.一種藥物包裝，所述包裝包含權利要求15的藥物制劑和病人用藥說明書。
37.一種降低細胞內靶基因表達的方法，所述方法包括使細胞與含雙鏈核酸的組合物接觸，所述雙鏈核酸包含a)含有一個或多個修飾部分或修飾核苷酸的DNA有義多核苷酸鏈；和b)具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以抑制靶基因的表達。
38.一種降低受試者的一個或多個細胞內靶基因表達的方法，所述方法包括給予受試者包含雙鏈核酸的組合物，所述雙鏈核酸包含a)含有一個或多個修飾部分或修飾核苷酸的DNA有義多核苷酸鏈；和b)具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以抑制靶基因的表達。
39.權利要求37或38的方法，其中所述DNA有義多核苷酸包含硫代磷酸酯部分。
40.權利要求37或38的方法，其中所述DNA鏈含有至少50％的修飾核苷酸。
41.權利要求37或38的方法，其中所述DNA鏈含有100％的修飾核苷酸。
42.權利要求37或38的方法，其中所述雙鏈核酸含有一個或多個錯配堿基對。
43.權利要求42的方法，其中所述雙鏈核酸的Tm值，低于RNA反義多核苷酸鏈相同但DNA有義多核苷酸鏈與其完全匹配互補的雙鏈核酸的Tm值。
44.權利要求37或38的方法，其中所述反義多核苷酸中的50％或更少的核苷酸為修飾核苷酸。
45.權利要求37或38的方法，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高。
46.權利要求37或38的方法，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高至少1個logP單位。
47.權利要求37或38的方法，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其等電點pH值(pI)提高至少0.5個單位。
48.權利要求37或38的方法，其中所述雙鏈核酸是發(fā)夾結構核酸，其在細胞中被加工成siRNA。
49.權利要求37或38的方法，其中所述雙鏈核酸長為19-100bp。
50.權利要求37或38的方法，其中所述雙鏈核酸在10％血清存在下被培養(yǎng)的細胞內化達到穩(wěn)態(tài)水平，該水平至少是具有相同指定序列但未經修飾的雙鏈核酸水平的2倍。
51.權利要求37或38的方法，其中所述雙鏈核酸在人或小鼠體內的血清半衰期，至少是具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸血清半衰期的2倍。
52.權利要求37的方法，其中所述細胞與所述雙鏈核酸在至少0.1mg/mL的蛋白存在下接觸。
53.權利要求37的方法，其中所述細胞與所述雙鏈核酸在至少10％的血清存在下接觸。
54.權利要求37的方法，其中所述細胞與所述雙鏈核酸在生理濃度蛋白存在下接觸。
55.權利要求37或38的方法，其中所述組合物進一步包含蛋白。
56.權利要求55的方法，其中所述蛋白是血清蛋白。
57.權利要求55的方法，其中所述蛋白是內化蛋白和/或細胞靶定位蛋白。
58.一種用在醫(yī)療器械表面的涂層，所述涂層包含聚合物基質和分散于其中的RNAi構建體，在移植到人體適當位點后該RNAi構建體從基質上洗脫，并改變移植器械附近細胞的生長、存活或分化，其中至少一種RNAi構建體為包含以下的雙鏈核酸a)含有一個或多個修飾部分或修飾核苷酸的DNA有義多核苷酸鏈；和b)具有指定序列的RNA反義多核苷酸鏈，其與至少部分靶基因轉錄物雜交，并足以抑制靶基因的表達。
59.權利要求58的涂層，其中所述醫(yī)療器械選自螺絲、板、墊圈、縫合線、修復術抗基、平頭釘、肘釘、電導線、瓣膜、膜、導管、可移植的脈管進入端口、血袋、導血管、中央靜脈導管、動脈導管、脈管移植物、大動脈球泵、心臟瓣膜、心臟血管縫合線、人工心臟、起搏器、心室輔助泵、體外器械、血液濾器、血液透析單位、血灌流單位、血漿去除單位和適于用在血管中的濾器。
60.權利要求58的涂層，其中所述醫(yī)療器械是斯滕特固定模。
61.權利要求58的涂層，所述涂層進一步包含與雙鏈核酸結合的蛋白。
62.權利要求58的涂層，其中所述DNA有義多核苷酸包含硫代磷酸酯部分。
63.權利要求58的涂層，其中所述DNA有義多核苷酸含有至少50％的修飾核苷酸。
64.權利要求58的涂層，其中所述DNA有義多核苷酸含有100％的修飾核苷酸。
65.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸包含一個或多個錯配堿基對。
66.權利要求65的涂層，其中所述雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值，低于RNA反義多核苷酸鏈相同但DNA有義多核苷酸鏈與其完全匹配互補的雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值。
67.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸的反義多核苷酸中的50％或更少的核苷酸為修飾核苷酸。
68.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸的一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性提高。
69.權利要求58的涂層，其中所述一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其疏水性高至少1個logP單位。
70.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸的一個或多個修飾部分使雙鏈核酸相對于具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸，其等電點pH值(pI)提高至少0.5個單位。
71.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸是發(fā)夾結構核酸，其在細胞中被加工成siRNA。
72.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸長為19-100bp。
73.權利要求58的涂層，其中所述雙鏈核酸在人或小鼠體內的血清半衰期至少是具有所述指定序列但未經修飾的雙鏈核酸血清半衰期的2倍。
74.一種優(yōu)化用于藥物的RNAi構建體的方法，所述方法包括a)鑒別具有指定序列的在體內抑制靶基因表達的RNAi構建體；b)設計一個或多個具有所述指定序列并包含一個或多個修飾核酸的RNAi構建體；c)測試(b)的一個或多個修飾RNAi構建體的被細胞攝取性能和/或血清半衰期；d)繪制(a)和(b)的RNAi構建體的動物體內有效性和毒性治療譜；e)選擇一個或多個具有所需被攝取性質和所需治療性質的修飾RNAi構建體；并f)配制包含步驟(e)中選出的一個或多個RNAi構建體的藥物制劑。
75.一種優(yōu)化用于藥物的RNAi構建體的方法，所述方法包括a)鑒別具有指定序列的在體內抑制靶基因表達的siRNA構建體；b)通過用與a)的反義RNA鏈雜交的有義DNA多核苷酸鏈置換a)的siRNA構建體有義RNA多核苷酸鏈，制得RNAi構建體；c)測試b)的RNAi構建體的被細胞攝取性能和/或血清半衰期；d)繪制a)和b)的RNAi構建體的動物體內有效性和毒性治療譜；e)通過重復步驟a)-d)，選擇一個或多個具有所需被攝取性質和所需治療性質的修飾RNAi構建體；并f)配制包含步驟(e)中選出的一個或多個RNAi構建體的藥物制劑。
76.權利要求74或75的方法，所述方法包括建立分配系統(tǒng)以分配用于銷售的藥物制劑的附加步驟，并(任選)建立銷售群體以開拓該藥物制劑市場。
77.一種優(yōu)化RNAi構建體的方法，所述方法包括a)產生多個待測RNAi構建體，每個構建體包含雙鏈核酸，該雙鏈核酸包含i)含有一個或多個修飾部分或修飾核苷酸的DNA有義多核苷酸鏈；ii)RNA反義多核苷酸鏈；b)確定待測RNAi構建體的基因沉默效果。
78.權利要求77的方法，其中所述雙鏈核酸包含錯配堿基對。
79.權利要求77的方法，其中所述雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值，低于RNA反義多核苷酸鏈相同但DNA有義多核苷酸鏈與其完全匹配互補的雙鏈核酸在生理離子強度下的Tm值。
79.權利要求77的方法，所述方法進一步包括確定待測RNAi構建體的血清穩(wěn)定性并選擇一個或多個具有所需基因沉默效果和血清穩(wěn)定性的待測RNAi構建體。
80.權利要求76的方法，所述方法進一步包括確定待測RNAi構建體的被細胞攝取性能并選擇一個或多個具有所需基因沉默效果和被細胞攝取性能的待測RNAi構建體。
81.權利要求79或80的方法，所述方法進一步包括配制包含所選待測RNAi構建體的藥物制劑。
82.權利要求80的方法，所述方法包括建立分配系統(tǒng)以分配用于銷售的藥物制劑的附加步驟，并(任選)建立銷售群體以開拓該藥物制劑市場。
全文摘要
本發(fā)明提供了在體內減弱靶基因表達的方法和組合物。總體上，這種方法包括給予RNAi構建體(例如靶定位到特定mRNA序列的小干擾RNA(也就是siRNA)，或者可以在胞內產生siRNA的核酸原料)，其量足以通過RNA干擾機制減弱靶基因表達。具體的，這種RNAi構建體包含一個或多個修飾部分以改善血清穩(wěn)定性和被細胞攝取性能，同時避免非特異作用。
文檔編號A61K48/00GK1849396SQ200480026218
公開日2006年10月18日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權日2003年7月15日
發(fā)明者M·E·達維斯 申請人:加州理工學院