專利名稱：具有減少的結(jié)合賴氨酸能力的血纖維蛋白溶酶原激活劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血纖維蛋白溶酶原激活劑的有利用途并申明德國(guó)專利申請(qǐng)103 42 518.7的優(yōu)先權(quán)，所述專利的內(nèi)容在這里通過引用作為參考。
確立溶栓法作為與多種血栓性疾病相關(guān)的治療選擇被認(rèn)為是已經(jīng)基本得出了結(jié)論的。因此溶栓法研究中的主要目的是瞄準(zhǔn)于進(jìn)一步發(fā)展和修飾已知的血栓溶解劑和/或改進(jìn)并用療法。
對(duì)作為發(fā)展新的血栓溶解劑的起點(diǎn)重要的一種血栓溶解劑是組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)，其具有更高的纖維蛋白選擇性并且與鏈激酶或尿激酶相比具有高活性。缺失型突變體瑞替普酶(Reteplase)和拉諾替普酶(Lanoteplase)以及替奈普酶(Tenecteplase)是這種血纖維蛋白溶酶原激活劑的進(jìn)一步開發(fā)的藥物。
組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rt-PA)是由527個(gè)氨基酸組成的單鏈糖蛋白。最初為單鏈(sct-PA)的該分子經(jīng)蛋白質(zhì)水解切割為雙鏈形式(tct-PA)。t-PA具有明確的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。因此，N-端組成鏈包含指形結(jié)構(gòu)域(F，Ser1-Lys49)、表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域(E，Ser50-Asp87)和兩個(gè)環(huán)餅結(jié)構(gòu)域(kringle domains)(K1，Thr88-Gly176；和K2，Asn177-Cys261)。包括絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(P)的C-端鏈包含Ser262至Pro527氨基酸。通過氨基酸His322、Asp371和Ser478，C-端鏈形成活性區(qū)。
t-PA及其重組突變體，以及它們的制備是例如美國(guó)專利4,766,075及大量出版物(例如Bode和RenatusTissue-type plasminogenactivatorvariants and crystal/solution structures demarcatestructural determinants of function，Current Opinion inStructural Biology 1997，7865-872)的主題。

圖1是t-PA結(jié)構(gòu)的圖示。
如多數(shù)其它類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，通過切割將sct-PA轉(zhuǎn)化為tct-PA。切割在Arg275和Ile276之間的鍵進(jìn)行。此后，雙鏈僅通過264號(hào)絲氨酸和395絲氨酸之間的單二硫橋的方式聯(lián)系在一起。
t-PA切割位點(diǎn)的編號(hào)方式與Bode和Renatus(如上文引用)選擇的編號(hào)方式一致。然而，其它的作者使用一種不同的編號(hào)方式作為根據(jù)并定義切割點(diǎn)或活性位點(diǎn)為R15-I16或R310-I311。然而，以這種方式定義的位點(diǎn)在功能或結(jié)構(gòu)上沒有不同。
組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA；阿替普酶)能夠激活血纖維蛋白溶酶原，使其轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶。然而，從動(dòng)力學(xué)常數(shù)看顯然t-PA只能夠微弱地激活血纖維蛋白溶酶原的循環(huán)。t-PA的這兩種形式，即單鏈分子和雙鏈分子，表現(xiàn)出那些是大體上相同的藥理學(xué)特性。然而，纖維蛋白結(jié)合的血纖維蛋白溶酶原以高的催化力被活化，這種催化力是用以激活自由狀態(tài)的血纖維蛋白溶酶的催化力的103。因此，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑的溶解血栓的特性由于纖維蛋白的存在而增強(qiáng)很多。
從500到1000倍的t-PA的相對(duì)纖維蛋白選擇性都有報(bào)道。催化效果也能通過血纖維蛋白溶酶原激活劑與β-淀粉樣蛋白或纖維蛋白原的相互作用而增強(qiáng)。t-PA由纖維蛋白原激活的能力與它由β-淀粉樣蛋白激活的能力相當(dāng)。
血纖維蛋白溶酶原激活劑的效果通過抑制劑在生理學(xué)上受到控制，其中血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑I(PAI-1)是重要的拮抗劑。PAI-1結(jié)合至t-PA分子的輕組成鏈上改變了催化中心的結(jié)構(gòu)因而激活血纖維蛋白溶酶原的反應(yīng)不再發(fā)生(Bennet WF、Paoni NF、Keyt BA、Botstein D、Jones AJS、Presta L、Wurm FM、Zoller M的Highresolution analysis of functional determinants in humantissue-type plasminogen activator.Journal of BiologicalChemistry 1991；2665191-5201)。
組織血纖維蛋白溶酶原激活劑經(jīng)由肝臟快速地代謝。因此患者的肝功能不全延長(zhǎng)了這些物質(zhì)的血漿半衰期(Emeis JJ、van den HoogenCM、Jense D等人的Hepatic clearance of tissue-type plasminogenactivator in rats，Thomb Haemostas 1985；54661-664；Tiefenbrunn AJ、Robison AK、Kurnik PB、Ludbrook PA、Sobel BE.的Clinical pharmacology in patients with evolving myocardialinfarction of tissue plasminogen activator produced byrecombinant DNA technology Circulation 1985；71110-116)。
血纖維蛋白溶酶原激活劑被開發(fā)用于治療血栓形成病如心肌梗塞和中風(fēng)。t-PA目前是僅有的并由美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用以治療中風(fēng)的血栓溶解劑。
然而，在過去一段時(shí)期懷疑已經(jīng)增加，就是t-PA一方面表現(xiàn)出所期望的與治療中風(fēng)相關(guān)的積極的溶解血栓效果的同時(shí)，另一方面也引起不理想的組織破壞。因而，將t-PA灌注至t-PA-缺陷的小鼠內(nèi)引起更大梗塞出現(xiàn)(Wang YF、Tsirka SE、Strickland S、Stieg PE、Soriano SG、Lipton SA等人的Tissue plasminogen activator(tPA)increases neuronal damage after focal cerebral ischemia inwild-type and tPA-deficient mice.Nat Med 1998；4(2)228-231)。懷疑這種擴(kuò)大的損傷是由于刺激了NMDA-依賴的谷氨酸受體(Liberatore GT、Samson A、Bladin C、Schleuning WD、Medcalf RL等人的Vampire bat salivary plasminogen activator(desmoteplase)a unique fibrinolytic enzyme that does notpromote neurodegeneration.Stroke 2003；34(2)537-543)。由t-PA進(jìn)行的NMDA受體的蛋白水解切割應(yīng)該是產(chǎn)生這種效果的原因(Nicole O、Docagne F、Ali C、Margaill I、Carmeliet P、MacKenzieET等人的The proteolytic activity of tissue plasminogenactivator enhances NMDA receptor-mediated signaling.Nat Med2001；7(1)59-64)。
因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供新穎的治療劑治療血栓形成疾病，特別是中風(fēng)。
通過使用血纖維蛋白溶酶原激活因子達(dá)到了該目標(biāo)，其中所述的血纖維蛋白溶酶原激活因子表現(xiàn)出比天然的血纖維蛋白溶酶原激活劑要弱的與賴氨酸結(jié)合的能力。在一特別有利的實(shí)施方案中，血纖維蛋白溶酶原激活劑顯示一個(gè)經(jīng)修飾的環(huán)餅結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選與天然的t-PA相比經(jīng)過修飾的環(huán)餅2(K2)結(jié)構(gòu)域。后面的這個(gè)結(jié)構(gòu)域能全部或部分刪除掉，因而減少了結(jié)合賴氨酸的能力。
可將K2結(jié)構(gòu)域，或功能上或結(jié)構(gòu)上基本與它同源的區(qū)域有利地進(jìn)行修飾，這樣賴氨酸殘基不再與其結(jié)合或僅以低的親和性結(jié)合。
在一特別有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明可采用的血纖維蛋白溶酶原激活劑是經(jīng)修飾的t-PA。
K2結(jié)構(gòu)域的重要性，包括t-PA K2缺失型突變體的制備在Horrevoets AJ、Smilde A、de Vries C、Pannekoek H(The specificroles of finger and kringle 2 domains of tissue-type plasminogenactivator during in vitro fibrinolysisJournal of BiologicalChemistry，269，17，12639-12644，1994)中詳細(xì)描述。
由于它們結(jié)合賴氨酸的能力缺乏或降低，根據(jù)本發(fā)明能使用的血纖維蛋白溶酶原激活因子表現(xiàn)出提高的纖維蛋白選擇性和降低的被纖維蛋白原或β-淀粉樣蛋白激活的能力。這種降低的被纖維蛋白原激活的能力可能是由于所述纖維蛋白選擇性。擁有高的纖維蛋白選擇性的血纖維蛋白溶酶原激活因子對(duì)治療中風(fēng)相當(dāng)重要，特別是因?yàn)?，例如，天然的t-PA能由纖維蛋白原激活，纖維蛋白原越過受損的血-腦屏障并且之后通過隨后激活NMDA受體而刺激谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性。因此，根據(jù)本發(fā)明，血纖維蛋白溶酶原激活因子受纖維蛋白原激活的能力的降低也導(dǎo)致神經(jīng)毒性的減少。
特別是根據(jù)通過對(duì)t-PA與DSPA的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的比較研究的結(jié)果，在t-PA環(huán)餅2上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)的重要性變得明顯。DSPA是最初從吸血蝙蝠(Vampire bat)唾液中分離的血纖維蛋白溶酶原激活劑(就這一點(diǎn)，參見美國(guó)專利6,008,019；EP 0 383 417)。DSPA分離出四類異構(gòu)體，其中DSPAα1能用CHO細(xì)胞通過重組方法制備。
與t-PA相比，DSPA僅有環(huán)餅結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域在功能和結(jié)構(gòu)上更接近于t-PA K1結(jié)構(gòu)域而不是K2結(jié)構(gòu)域，并且不具有任何賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)(Bringmann P、Gruber D、Liese A、Toschi L、Kr_tzschmar J、Schleuning WD、Donner P的Structural features mediating fibrinselectivity of vampire bat plasminogen activators；Journal ofBiological Chemistry 1995；270(43)25596-25603)。因此在文獻(xiàn)中有一些聲明表明DSPA不具有任何環(huán)餅2結(jié)構(gòu)域。
而且，因?yàn)榕ct-PA一樣缺少血纖維蛋白溶酶活化位點(diǎn)，DSPA總是表現(xiàn)為單鏈分子。與t-PA比較，DSPA的活性在纖維蛋白存在時(shí)受的刺激提高約45 000倍，然而根據(jù)Gardell SJ、Duong LT、Diehl、York JD、Hare TR、Register RB、Jacobs JW、Dixon RA、FriedmanPA(Isolation，characterization and c-DNA cloning of a vampirebat salivary plasminogen activatorJournal of BiologicalChemistry 1989；264(30)17947-17952)，該值是205。
圖2是DSPA結(jié)構(gòu)的圖示。圖2b顯示t-PA與DSPA(SEQ ID Nos.1+2)的氨基酸序列的比較。
過去，t-PA結(jié)合纖維蛋白的能力在功能上歸因于指形結(jié)構(gòu)域和環(huán)餅2(van Zonnenfeld AJ、Veerman H、Pannekoek H(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，834670-4674)。然而，更多最近的出版物也認(rèn)為蛋白酶結(jié)構(gòu)域P在這一點(diǎn)上可能有某種關(guān)聯(lián)(Bennett，如上引用)。各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能也由Bakker AHF、Jacoline E.、Weening-Verhoeffet D.、Verheijen JH(The role of Lysyl-Bindingsite of tissue type plasminogen activator in the interactionwith a forming fibrin clodJournal of Biological Chemistry 270，21，12355-12360，1995)做了研究。
Bakker等制備了不同的t-PA修飾體，例如兩種缺失型突變體，其缺少環(huán)餅2、指形結(jié)構(gòu)域或表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域。也可將這些突變體進(jìn)行組合并且它們中的一些額外在環(huán)餅2中具有點(diǎn)突變，即涉及取代D236N。這種選擇性氨基酸取代導(dǎo)致在位置236用天冬酰胺酸替代Asp并因此刪掉了賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)(K2結(jié)構(gòu)域中的LBS)。對(duì)于突變體的制備，讀者應(yīng)特別參考上述的Bakker等的出版物，包括這里引用的參考文獻(xiàn)。
在他們的研究中，Bakker等證明由EACA(ε-氨基己酸)占據(jù)在K2結(jié)構(gòu)域中的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)明顯地削弱了天然t-PA對(duì)纖維蛋白的結(jié)合。通過D236N取代對(duì)LBS同樣進(jìn)行了修飾，只是削弱程度要小。甚至所述僅由K2結(jié)構(gòu)域和蛋白水解C端組成的缺失型突變體仍然與纖維蛋白結(jié)合，即使只有輕微的程度。只有其中刪除了LBS的K2P突變體不再表現(xiàn)出任何纖維蛋白結(jié)合。
雖然這些結(jié)果一方面表明F和K2結(jié)構(gòu)域及K2中的LBS的重要性，它們也表明t-PA與纖維蛋白的相互作用不是僅由F和K2結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)。而是，K2結(jié)構(gòu)域中的LBS也有其功能，就是LBS大概是負(fù)責(zé)穩(wěn)定有利于結(jié)合纖維蛋白的t-PA的構(gòu)象。
K2結(jié)構(gòu)域，包括其賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)的重要性通過Stewart RJ、Fredenburgh JG和Witz JI(Characterization of the interactionsof plasminogen and tissue and vampire bat plasminogenactivators with fibrinogen，fibrin，and the complex of D-dimernoncovalently linked to fragment EJournal of BiologicalChemistry 273，29，18292-18299，1998)完成的研究也已變得清楚。
在結(jié)合研究中，Stewart等尤其研究了t-PA和DSPA對(duì)纖維蛋白和纖維蛋白原的親和性。在該研究中，在存在或不存在賴氨酸類似物EACA時(shí)研究親和力以便分析環(huán)餅結(jié)構(gòu)域-依賴的相互作用的重要性。他們從其研究中斷定，由于環(huán)餅結(jié)構(gòu)域中缺少賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)DSPA不能結(jié)合纖維蛋白原。因此他們將t-PA結(jié)合纖維蛋白的能力所必需的功能歸因于與t-PA環(huán)餅結(jié)構(gòu)域2中的LBS與指形結(jié)構(gòu)域的聯(lián)合。
實(shí)施例1中報(bào)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了DSPα1和重組人t-PA對(duì)輔因子β-淀粉樣蛋白(1-42)、纖維蛋白原及纖維蛋白的不同的親和力。為獲得這些數(shù)據(jù)，測(cè)定了每種血纖維蛋白溶酶原激活劑/輔因子聯(lián)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat和Km，以及kcat/Km比率。輔因子不存在時(shí)，DSPAα1比t-PA激活血纖維蛋白溶酶原的效率低約100倍，而在纖維蛋白存在時(shí)這兩種化合物效率相等。在存在纖維蛋白原或β-淀粉樣蛋白輔因子時(shí)DSPAα1比t-PA的效率低約30倍。在2μM的生理學(xué)血纖維蛋白溶酶原濃度時(shí)，這些數(shù)據(jù)給出纖維蛋白作為輔因子的效率相比纖維蛋白原或β-淀粉樣蛋白作為輔因子時(shí)的效率的比率，在DSPAα1的情況下是480而在人t-PA的情況下是16。
與上面已經(jīng)說明的一樣，根據(jù)本發(fā)明采用的血纖維蛋白溶酶原激活因子的特征在于其環(huán)餅結(jié)構(gòu)域2賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)缺少或經(jīng)修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，刪除了環(huán)餅2。然而，在另一個(gè)實(shí)施方案中也可能保留環(huán)餅2并在位置236用天冬酰胺代替天冬氨酸。因此，經(jīng)修飾的t-PA根據(jù)本發(fā)明缺少環(huán)餅結(jié)構(gòu)不是至關(guān)重要的，而僅需修飾賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)而使之與輔因子之間的增強(qiáng)t-PA活性的相互作用不再可能發(fā)生。
在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，使用的血纖維蛋白溶酶原激活劑特別是經(jīng)修飾的t-PA能通過刪除環(huán)餅1進(jìn)行修飾，這樣t-PA就不再能夠結(jié)合受體。因此，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑不再以原來的方式經(jīng)由肝臟代謝，使得體內(nèi)半衰期得以延長(zhǎng)(Rijken DC、Otter M、KuiperJ、von Berkel TJC的Receptor-mediated endocytosis oftissue-type plasminogen activator(t-PA)by liver cells.Thromb.Res.1990；Supel.X63-71)。已知從瑞替普酶中刪除環(huán)餅1并且由例如Martin U、Bader R、B_hm E、Kohnert U、von M_llendorf E、Fischer S、Sponder G(BM 06.022A Novel recombinant plasminogenactivator.Cardiovascular drug reviews 1993；11299-311)描述。為此，使用刪除了氨基酸4-176的突變體。延長(zhǎng)半衰期使得能夠?qū)⒀w維蛋白溶酶原激活劑一次性推注(Bolusapplication)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明能使用的血纖維蛋白溶酶原激活劑基于在圖3、11或13中顯示的氨基酸序列之一。每種這些氨基酸序列構(gòu)成經(jīng)修飾的t-PA，該t-PA中刪除了環(huán)餅2并且改變了t-PA激活切割位點(diǎn)的序列區(qū)的結(jié)構(gòu)。這種變化可僅在于活性切割位點(diǎn)中氨基酸R和I的替代(如用HS替代；見圖3中序列SEQ ID No.3)或額外影響鄰近的氨基酸(如用圖11中的序列SEQ ID No.4的LHST替代FRIK)。后面的修飾在這一點(diǎn)上對(duì)應(yīng)天然DSPA的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選為治療中風(fēng)生產(chǎn)和采用一種血纖維蛋白溶酶原激活劑，所述血纖維蛋白溶酶原激活劑特別恰當(dāng)?shù)芈?lián)合了天然t-PA和DSPA的優(yōu)勢(shì)，即天然t-PA的特別是當(dāng)用于人類患者時(shí)的低免疫原性和即DSPA的缺少神經(jīng)毒性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，因此選擇刪除t-PA環(huán)餅2，這樣使得產(chǎn)生下游結(jié)構(gòu)的過渡區(qū)，所述過渡區(qū)對(duì)應(yīng)于DSPA中的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。在經(jīng)修飾的t-PA的保留的環(huán)餅1結(jié)構(gòu)域和下游半胱氨酸橋之間的過渡區(qū)從而有利地由序列SKAT形成。在DSPA中，序列SKAT位于環(huán)餅結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸橋之間。例如，如圖11顯示的序列SEQ ID No.4中實(shí)現(xiàn)了這種有利的結(jié)構(gòu)。
圖12(多序列比對(duì))顯示t-PA和根據(jù)本發(fā)明的兩個(gè)描述的實(shí)施方案之間的比較。
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，使用如圖13(SEQ ID No.5)描述的血纖維蛋白溶酶原激活劑。
根據(jù)本發(fā)明使用具有與圖3、11和13中描述的氨基酸序列同源或部分地一致的序列的蛋白質(zhì)自然也是可能的。優(yōu)選至少有70％，優(yōu)選地在80％和95％之間的同源性或一致性。這些同源的或相同的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出血纖維蛋白溶酶原激活因子的活性(優(yōu)選地表現(xiàn)為pNA的釋放)并且在體外引起血塊溶解(見實(shí)施例3)。
根據(jù)本發(fā)明可使用的血纖維蛋白溶酶原激活劑的特征在于缺少指形結(jié)構(gòu)域和表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域。這種刪除實(shí)質(zhì)性地減少了其與肝臟受體結(jié)合并再次延長(zhǎng)了半衰期(Larson GR、Timony GA、Horgan PG、Barone KM、Henson KS、Angus LB、Stoudemire JB的Proteinengineering of novel plasminogen activators with increasedthrombolytic potency in rabbits relative to activase.Journalof biological Chemistry 1991；2668156-8161；Smalling RW的Molecular biology of plasminogen activatorswhat are theclinical implications of drug design？Am J Cardiol.1996；78(suppl.12)2-7)。
除缺失型突變體之外，根據(jù)本發(fā)明采用的血纖維蛋白溶酶原激活劑也能通過定點(diǎn)突變的方式僅進(jìn)行點(diǎn)修飾。因此，例如由rt-PA-TNK(替奈普酶)得知，一方面在血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑結(jié)合位點(diǎn)，另一方面在t-PA用以結(jié)合至肝細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)處的三個(gè)突變導(dǎo)致催化活性增加，同時(shí)受PAI失活的能力降低。這從而引起替奈普酶的催化轉(zhuǎn)換常數(shù)Kcat/Km增強(qiáng)了100倍(就這一點(diǎn)，也參見Paoni NF、Keyt BA、Refino CJ、Chow AM、Nguyen HV、Berleau LT、Badillo J、Pena LC、Brady K、Wurm FM、Ogez J、Bennett WFA slow clearingfibrin-specific，PAI resistant variant of t-PA(T103N，KHRR296-299 AAAA).Thromb Haemostas 1993；70307-312以及CannonCP、Love TW、McCabe CH、Kirshenbaum JM、Henry T、Sequira R、Schweifer M、Breed J、Cutler D、Tracy R，for the TIMIinvestigators.TNK-tissue plasminogen activators in myocardialinfarction(TIMI)10Results of the initial patients in theTIMI 10 pilot-a phase 1，pharmacokinetics trial.Circulation1995；92(suppl.)1-415))。
實(shí)施例11.由DSPAα1和重組人t-PA激活血纖維蛋白溶酶原的情形下用作為輔因子的β淀粉樣蛋白(1-42)、纖維蛋白原和纖維蛋白的比較分析。
材料和方法使用以下物質(zhì)-DSPAα1(由Paion公司制備，批號(hào)2DSA01，2002年12月12日，樣品10)。將10mg該物質(zhì)溶解于10ml無(wú)菌水中以便獲得1mg/ml的終濃度。
-重組t-PA(Actilyse_，由Paion公司制備，批號(hào)102572)。將10mg溶解于10ml無(wú)菌水中得到1mg/ml的終濃度。
-人Glu-血纖維蛋白溶酶原，從人血漿中純化(由Paion公司制備)并將其溶解于濃度為25μM的PCLA緩沖液中。
-人纖維蛋白原，基本無(wú)血纖維蛋白溶酶原，從Sigma公司獲得(產(chǎn)品分類號(hào)F4883，批號(hào)12K7620)。將25mg溶解于25ml PCLA緩沖液中得到1mg/ml的終濃度。
-人凝血酶(Sigma公司；產(chǎn)品分類號(hào)T7009；批號(hào)61K7603)。將100U溶解于10ml PCLA緩沖液中以得到10U/ml的濃度。
-購(gòu)自Biopool公司(產(chǎn)品分類號(hào)101353，批號(hào)1512016)的Flavigen.pli顯色劑(D-but-CHT-Lys-p-nitroaniline-DHCL)。將100μM溶解于50ml PLCR緩沖液中得到2mM的終濃度。-購(gòu)自Bachem公司的β-淀粉樣蛋白(1-42)(產(chǎn)品分類號(hào)H-1368，批號(hào)0535120)。將4mg溶解于4ml 0.1％的氫氧化銨中得到1mg/ml的終濃度。
將所有的試劑分成等分并在-20℃下儲(chǔ)存不超過兩周。
PLC緩沖液(Jones 1990年)0.1M NaCl.2H2O(Acros，產(chǎn)品分類號(hào)20779)；0.03M NaHCO3(Acros，產(chǎn)品分類號(hào)21712)；4mMKCl(Fluka，產(chǎn)品分類號(hào)60130)；1mM CaCl2.2H2O(Acros，產(chǎn)品分類號(hào)207780)；1mM Na2HPO4.2H2O(Fluka，產(chǎn)品分類號(hào)71638)；0.3mM MgCl2.6H2O(Acros，產(chǎn)品分類號(hào)197530)；0.4mM MgSO4.7H2O(Fluka，產(chǎn)品分類號(hào)63140)；20mM HEPES(Applichem，產(chǎn)品分類號(hào)A1969)；0.01％聚山梨醇酯80(Fluka，產(chǎn)品分類號(hào)93781)。
血纖維蛋白溶酶原的激活的檢測(cè)血纖維蛋白溶酶原的激活的檢測(cè)在總體積為0.15ml的微孔板上，按照Bringmann等的描述(如上引用)進(jìn)行。如下添加試劑50μl的血纖維蛋白溶酶原(0-24μM)；15μl的輔因子(1mg/ml)；10μl 7.5nM的血纖維蛋白溶酶激活劑和75μl Flavigen(2mM)。
總濃度如下血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA或DSPAα1)0.5nM；Glu-血纖維蛋白溶酶原0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μM；FlavigenPli1mM和輔因子100μg/ml。
將輔因子β-淀粉樣蛋白(1-42)、纖維蛋白原和纖維蛋白與沒有輔因子的對(duì)照比較。對(duì)于對(duì)照，反應(yīng)混合物含有另外的0.13單位人凝血酶/ml。
添加試劑后，立刻將微孔板于25℃導(dǎo)入至分子裝置ThermoMax微板計(jì)讀器中。
從時(shí)間t＝0開始攪拌。
以有規(guī)律的間隔測(cè)定405nm和490nm下的光密度。將490nm下的光密度從405nm下的光密度中減去以消除由于液體移動(dòng)引起的差異。用每種血纖維蛋白溶酶原濃度和血纖維蛋白溶酶原激活劑濃度將所有的試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。
測(cè)定Km值和kcat值(圖4-6)。
圖4a)測(cè)定pNA的摩爾消光系數(shù)。
b)通過以10nM血纖維蛋白溶酶作為Flavigen.pli濃度(μM)的函數(shù)轉(zhuǎn)化Flavigen.pli。
c)由10nM血纖維蛋白溶酶轉(zhuǎn)換的Flavigen的Michaelis-Menten繪圖。將Fig.4b的初始比率轉(zhuǎn)換為pNA/s。
圖5血纖維蛋白溶酶原激活劑和輔因子的四種不同的組合的相對(duì)于時(shí)間的光密度曲線。為此使用了8；4；2；1；0.5；0.25；0.125和0.0625μM濃度的血纖維蛋白溶酶原。
a)無(wú)輔因子的t-PAb)以β-淀粉樣蛋白(1-42)為輔因子的t-PAc)以纖維蛋白原為輔因子的t-PAd)以纖維蛋白為輔因子的t-PAe)無(wú)輔因子的DSPAα1f)以β-淀粉樣蛋白(1-42)為輔因子的DSPAα1g)以血纖維蛋白溶酶原為輔因子的DSPAα1h)以血纖維蛋白溶酶為輔因子的DSPAα1圖6a{＝ks.kcat.PA.E.P./(Km+P)}相對(duì)于血纖維蛋白溶酶原濃度的繪圖a)無(wú)輔因子或以β-淀粉樣蛋白、纖維蛋白原或纖維蛋白為輔因子的t-PA的曲線b)無(wú)輔因子的DSPAα111.38的繪圖結(jié)果表1
表1通過用β-淀粉樣蛋白(1-42)、纖維蛋白原和纖維蛋白為輔因子的重組人T-PA或DSPAα1激活血纖維蛋白溶酶原的kcat/Km值。
結(jié)果以三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差給出。
因?yàn)镵m值高于可能使用的最大的血纖維蛋白溶酶原濃度(8(M)，測(cè)定kcat和Km的精確值是不可能的。
因?yàn)樵谘w維蛋白溶酶原濃度接近或低于Km值下的反應(yīng)率取決于血纖維蛋白溶酶原濃度，動(dòng)力學(xué)常數(shù)的演算本身不足用以比較不同的輔因子的效率。為此，在2(M的生理血漿血纖維蛋白溶酶原濃度下用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)計(jì)算反應(yīng)率，以此為基礎(chǔ)，用于通過t-PA和DSPAα1激活血纖維蛋白溶酶原的不同輔因子的相對(duì)效率得以測(cè)定(表2)。
表2
在2μM的生理血纖維蛋白溶酶原濃度下血纖維蛋白溶酶原激活的相對(duì)比率，如使用表1中動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算。DSPA對(duì)照的組合是1。
實(shí)施例2朊病毒疾病即海綿狀腦病是致命的神經(jīng)退化現(xiàn)象，所述的這種神經(jīng)退化現(xiàn)象特征在于，在淀粉樣蛋白沉淀物中朊蛋白的非正常同種型(PrPsc)的積聚。正常的朊蛋白(PrPc)在許多組織中表達(dá)，特別在腦內(nèi)集中于突觸上。PrPc構(gòu)象變化產(chǎn)生PrPsc的機(jī)制以及通過PrPsc的形成導(dǎo)致神經(jīng)退化的機(jī)制仍然不是十分清楚。一種可能的機(jī)制可能在于與血纖維蛋白溶酶原被t-PA激活相關(guān)對(duì)PrPsc的影響。
我們已經(jīng)表明，使用重組蛋白質(zhì)，PrP能使t-PA-催化的血纖維蛋白溶酶原的激活增加300倍(Ellis V、Daniels M、Misra R、Brown DR(2000)Plasminogen activation is stimulated by prion proteinand regulated in a copper-dependent manner，Biochemistry 416891-6896)。
PrP刺激血纖維蛋白溶酶原激活的能力取決于PrP的構(gòu)象，該構(gòu)象受Cu2+的存在或不存在的影響。后一情況下的形式包含大量β結(jié)構(gòu)，其對(duì)應(yīng)與PrPsc同種型并刺激血纖維蛋白溶酶原激活。這些數(shù)據(jù)與早先的觀察結(jié)果一致，當(dāng)血纖維蛋白溶酶原結(jié)合至從搔癢病感染的小鼠腦中分離的PrPsc時(shí)，它不像正常腦細(xì)胞那樣與PrPc結(jié)合(Fischer M、Roeckl C、Rarizek P、Schwarz HP、Aguzzi A(2000)Binding ofdisease-associated prion protein to plasminogen.Nature 408479-483)。
因此，我們的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明PrP-刺激的血纖維蛋白溶酶原激活的機(jī)制也包括t-PA與apoprP(即無(wú)Cu2+的PrP)的結(jié)合。這種結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)還沒有詳細(xì)的評(píng)估。然而，因?yàn)槭艿紻FP-失活的t-PA的阻礙，這種結(jié)合是特定的。
其它方法這些研究中使用的PrP批次，在每種情況下都源于從E.coli分離出的重組鼠科動(dòng)物的PrP。純化His-標(biāo)記的PrP后，蛋白質(zhì)在缺乏或存在氯化銅時(shí)再一次折疊以便形成holo-PrP或apo-PrP。在每種情況中這些蛋白質(zhì)的聚積形式通過在水中快速溶解產(chǎn)生。通過離心過濾收集蛋白質(zhì)。這種材料耐受蛋白酶K的消化。以同樣的方式制備不包含Cu2+結(jié)合位點(diǎn)的Δ51-90型突變體。通過使用賴氨酸-血纖維蛋白溶酶原(25nm)和DSPA(0.25nm)孵育PrP(0-100μg/m)研究了PrP的這些不同形式對(duì)于DSPA激活血纖維蛋白溶酶原的影響。用SPECTRAmaxGemini-lourescence微板計(jì)讀器通過血纖維蛋白溶酶-特異性染料H-d-Val-Leu-Lys-7-氨基-4-甲基香豆素在37℃時(shí)的水解測(cè)定血纖維蛋白溶酶原的激活。這些試驗(yàn)的對(duì)照包括作為PrP對(duì)血纖維蛋白溶酶原激活的影響的正對(duì)照的sc-t-PA，和作為刺激t-PA和DSPA激活的正對(duì)照的纖維蛋白片斷。
血纖維蛋白溶酶原結(jié)合的特異性通過其與DFP-失活的t-Pa的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。賴氨酸類似物EACA也可以用做競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
結(jié)果試驗(yàn)的結(jié)果在表3和圖7-10中展示。
圖7特別提供了實(shí)質(zhì)性說明。該圖表明PrP只特定地活化t-PA而不是DSPA。此外表明環(huán)餅2的賴氨酸-結(jié)合位點(diǎn)必定與DSPA和t-PA之間的本質(zhì)區(qū)別相關(guān)。表3反應(yīng)率，M-1s-1
折疊刺激
實(shí)施例3a)制備和純化人源化DSPA(humDSPA)(如圖11中描述的氨基酸序列)使用Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen公司)制備重組人DSPA桿狀病毒DNA并且將純化的病毒DNA轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞。用Sf9細(xì)胞擴(kuò)增生產(chǎn)的重組桿狀病毒。用無(wú)血清培養(yǎng)基中的High Five昆蟲細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)基中表達(dá)HumDSAP。將含有重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液在-20℃冷凍直到將其用于進(jìn)一步工作。
在震蕩器上于室溫將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液緩慢地解凍并隨后于4000×g離心1小時(shí)。將蛋白質(zhì)溶液(1.5l)用50mM醋酸氨平衡至pH 6.0，上樣至SP-瓊脂糖凝膠XL(Amersham)離子交換柱(350ml柱床體積)上并用5柱體積50mM醋酸氨溶液洗滌。將結(jié)合蛋白用0-100％的1M的醋酸氨梯度，pH 6，多于10柱體積洗脫。
含有HumDSPA的級(jí)分通過蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)鑒定；檢測(cè)蛋白后，將這些級(jí)分接受活性測(cè)試，于-80℃冷凍并隨后凍干。
與標(biāo)準(zhǔn)活性檢測(cè)法相比，在這種試驗(yàn)中使用50μl洗脫液(＝含有humDSPA的級(jí)分)、50μl 0.2M的Tris，pH 8.0及100μl PBS中的2mM的S-2288。
b)DSPA活性的檢測(cè)使用的活性檢測(cè)法是檢測(cè)血纖維蛋白溶酶原激活劑將無(wú)色底物S-2288轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩a(chǎn)物的比率。檢測(cè)法是用于測(cè)定血纖維蛋白溶酶原激活因子的蛋白水解活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過測(cè)定由測(cè)試物釋放的發(fā)色團(tuán)(p-硝基苯氨，pNA)而使活性可見。Chromogenix公司提供用于此目的的發(fā)色團(tuán)S-2288。
在這種檢測(cè)法中，反應(yīng)速率不是直接地測(cè)定(如用catal為單位)；而是與定義為100％活性的標(biāo)準(zhǔn)相比較。
在有以下組成25mM Tris-HCl pH 8/0.1％清蛋白/100mMNaCl/1.1mM甘氨酸/1.2mM甘露醇/2.5mM S-2288的緩沖液中測(cè)定反應(yīng)速率。
使用空白值、標(biāo)準(zhǔn)品和含有不同蛋白質(zhì)濃度的樣品在96孔板中進(jìn)行測(cè)量。
使用光度計(jì)紀(jì)錄在405nm時(shí)吸收度隨時(shí)間的增加量。使用Excel測(cè)定曲線的線性部分的斜率。這樣可得出活性。
圖14表示級(jí)分的活性(表現(xiàn)為S-2288活性)。在圖15a和15b中可以看到銀染色膠凝。圖16a和16b顯示蛋白質(zhì)印跡。在蛋白質(zhì)印跡中檢測(cè)出的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于銀染色膠凝中用箭頭標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4凝塊溶解(血栓溶解劑活性)將含有humDSPA的級(jí)分B6的殘余溶解于15ml PBS中并將該溶液于4000×g離心15分鐘。因?yàn)楸憩F(xiàn)出最高的純度而選擇該級(jí)分。移出一等分用于活性測(cè)定。該樣品的催化活性與5μg活化酶(activase)/ml的催化活性大概相當(dāng)。
使用的血塊源自提前24小時(shí)獲取的正常血液樣品并且在每一試驗(yàn)中是由2ml轉(zhuǎn)移至聚丙烯試管的且在自然條件下凝結(jié)的血液形成的。溶解在PBS中進(jìn)行。
首先將含有humDSPA的級(jí)分B6(來自SPXL-瓊脂糖凝膠捕獲步驟)凍干。將殘余溶解于15ml PBS中并以4000g離心15分鐘。在加入血塊之前將該溶液的樣品移出以測(cè)定S-2288活性。該樣品的催化活性與5μg活化酶/ml的催化活性基本一致。
圖17a-17d顯示在加入humDSPA后0h、3h、4h和24h凝塊溶解隨時(shí)間數(shù)列進(jìn)行的結(jié)果。每一試驗(yàn)中的左側(cè)檢測(cè)顯示對(duì)照。在上述數(shù)量的包含humDSPA的PBS在右側(cè)檢測(cè)中顯示。
血細(xì)胞慢慢地在分解的凝塊外沉積。一種在4小時(shí)后已經(jīng)可以辨別的網(wǎng)狀物在24小時(shí)后保持不變。在該檢測(cè)中，4小時(shí)后用注射器將分離的血細(xì)胞吸出以便觀察剩余的凝塊的結(jié)構(gòu)。
必須考慮的事實(shí)是當(dāng)凝塊不再懸浮于自身的溶解產(chǎn)物中時(shí)纖維蛋白的溶解慢了下來。這就是為什么24小時(shí)后任何凝塊全部仍然存在的原因。
定量這種反應(yīng)是不可能的。然而，humDSPA與天然DSPA相比在活性上表現(xiàn)出顯著的增強(qiáng)，因?yàn)楸仨毷褂弥辽?倍數(shù)量的DSPA以便溶解同樣體積的凝塊。
權(quán)利要求
1.血纖維蛋白溶酶原激活劑治療血栓形成病特別是中風(fēng)的用途，所述的血纖維蛋白溶酶原激活劑與天然t-PA相比賴氨酸結(jié)合能力減弱。
2.如權(quán)利要求1中所述的用途，其特征在于，血纖維蛋白溶酶原激活劑在環(huán)餅2或在功能上或結(jié)構(gòu)上與之同源的結(jié)構(gòu)域上的修飾。
3.如權(quán)利要求2中所述的用途，其特征在于，環(huán)餅2或在功能上或結(jié)構(gòu)上與之同源的結(jié)構(gòu)域的刪除。
4.如權(quán)利要求2中所述的用途，其特征在于，環(huán)餅2賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)或在功能上或結(jié)構(gòu)上與之同源的結(jié)構(gòu)域上的修飾。
5.如權(quán)利要求4中所述的用途，其特征在于，D236N或與之同源的氨基酸的取代。
6.如前述的權(quán)利要求之一中所述的用途，其特征在于，血纖維蛋白溶酶原激活劑表現(xiàn)出與t-PA至少75％的同源性。
7.如權(quán)利要求6中所述的用途，其特征在于，通過刪除或取代修飾t-PA活性位點(diǎn)以致不發(fā)生蛋白水解切割。
8.如權(quán)利要求7中所述的用途，其特征在于，氨基酸位置R15-I16的修飾。
9.如權(quán)利要求8中所述的用途，其特征在于，活性位點(diǎn)具有LHST序列。
10.如前述的權(quán)利要求之一中所述的用途，其特征在于，在環(huán)餅結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸橋之間的過渡區(qū)中，血纖維蛋白溶酶原激活劑具有包含SKAT的氨基酸序列片段。
11.包含如圖3、11和13之一中描述的氨基酸序列的血纖維蛋白溶酶原激活劑。
12.血纖維蛋白溶酶原激活劑，其特征在于，與如權(quán)利要求10中所述的血纖維蛋白溶酶原激活劑具有至少70％的同一性，優(yōu)選地具有80-90％的同一性，特別優(yōu)選具有95％的同一性。
13.如權(quán)利要求10-12之一中所述的血纖維蛋白溶酶原激活劑，其特征在于，與天然DSPA相比溶解血栓活性增強(qiáng)。
全文摘要
結(jié)合賴氨酸的能力降低的血纖維蛋白溶酶原激活劑對(duì)治療血栓形成疾病的用途。
文檔編號(hào)A61K38/49GK1849394SQ200480026081
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2004年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者W·澤恩根, O·科普斯, V·埃利斯 申請(qǐng)人:帕昂德國(guó)有限公司