專利名稱：檢測裝置和相關(guān)使用方法
檢測裝置和相關(guān)使用方法對相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求于2010年5月17日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/345，259的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請的公開內(nèi)容整體通過引用并入本文。背景
基于核酸技術(shù)的微陣列是充分建立的工具，其用于應(yīng)用例如基于基因表達(dá)模式的遺傳分析和診斷中。其他微陣列平臺技術(shù)例如蛋白質(zhì)(抗體)陣列、和基于復(fù)雜生物學(xué)樣品(細(xì)胞制備物、全血等)分析的測定由于技術(shù)挑戰(zhàn)的結(jié)果并未同樣開發(fā)，所述技術(shù)挑戰(zhàn)在核酸陣列中不一定發(fā)現(xiàn)。此類挑戰(zhàn)包括復(fù)雜的和/或多步驟的樣品處理、不一致的結(jié)合活性或非核苷酸捕獲試劑的穩(wěn)定性缺乏、基于測定條件(例如可溶性、PH等)結(jié)合功能的差異、和非特異性結(jié)合締合(例如生物分子與微陣列表面)。此類非特異性結(jié)合可以妨礙信號檢測，因為它生成高背景信號(噪音)。進(jìn)一步地，微陣列技術(shù)一般采用另外的制備步驟，例如涉及樣品分餾或純化的步驟，和/或在其與捕獲試劑結(jié)合之前或之后可檢測基團與分析物的結(jié)合或締合。相應(yīng)地，使得具有最低限度或無樣品前處理步驟的單個樣品中的一種或多種分析物的檢測成為可能，具有對于在樣品組分和基底之間的非特異性締合的低傾向，并采用單個或少量測定步驟的裝置和方法可以提供超過現(xiàn)有裝置和檢測方法的優(yōu)點。概述
在一個方面，公開內(nèi)容提供了包含下述的裝置:包含表面的基底；在表面上的防污聚合物層；在聚合物層上的至少一個捕獲區(qū)，包含至少一種捕獲試劑；和在聚合物層上的至少一個不穩(wěn)定區(qū)，包含至少一種檢測試劑和賦形劑；其中所述捕獲區(qū)和不穩(wěn)定區(qū)是空間分離的。在另一個方面，公開內(nèi)容提供了制造本文描述的裝置的方法，該方法包括:提供包含表面的基底；在表面上形成防污聚合物層；將至少一種捕獲試劑印刷到聚合物層上；和將至少一種檢測試劑和至少一種賦形劑印刷到聚合物層上；其中所述捕獲試劑印刷到聚合物層上與檢測試劑和賦形劑空間分離的區(qū)域中。在另一個方面，公開內(nèi)容提供了篩選受試者中的疾病或病癥的方法，其包括:從受試者中獲得樣品；使樣品與本文描述的裝置接觸足以允許不穩(wěn)定區(qū)中的檢測試劑溶解的時間；和檢測疾病或病癥的存在，其中可檢測，其中在裝置上的至少一個捕獲區(qū)上的可檢測信號指不受試者中疾病或病癥的存在。在另一個方面，公開內(nèi)容提供了用于鑒定受試者中的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)的診斷測定，其包括:從受試者中獲得樣品；使樣品與本文描述的裝置接觸足以允許不穩(wěn)定區(qū)中的檢測試劑溶解的時間；檢測受試者中的疾病、病癥和/或生物學(xué)狀態(tài)的存在，其中在裝置上的至少一個捕獲區(qū)上的可檢測信號指示受試者中的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)的存在。公開內(nèi)容涉及由于下述說明書和附圖將變得顯而易見的其他方面和實施方案。附圖簡述

圖1描述了已涂有POEGMA、用疏水墨壓印并用“捕獲斑點”和“不穩(wěn)定斑點”印刷的示例性一次性芯片。圖2描述了在玻璃載玻片上合成POEGMA聚合物層。圖3描述了示例性裝置的橫截面。圖4描述了示例性裝置的橫截面。圖5描述了示例性陣列形式。圖6描述了使用示例性裝置測定來自受試者的血樣的示例性方法。圖7描述了通過橢圓對稱法測量的在氧化硅和引發(fā)劑硅烷修飾的氧化硅(對照:O)上不同厚度的POEGMA刷上的蛋白質(zhì)吸附。圖例:Ly(溶菌酶)、Fn (纖連蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、FBS(胎牛血清)。圖8描述了: (A)由血清查詢的IL-6微陣列的圖像。㈧在聚(OEGMA)上的緩沖液和血清中的OPG劑量響應(yīng)曲線。(C)在聚(OEGMA)和硝酸纖維素上的血清中的IL-6劑量響應(yīng)曲線。(D)對于由全血查詢的IL-6微陣列的劑量響應(yīng)曲線。在B-D中，縱坐標(biāo)顯示在斑點中的背景減去的平均熒光強度，并且X軸顯示溶液中的分析物濃度。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖9 描述了:A)在暴露于由 I mg/mL b_Ab (左)和 0.0001 mg/mL (右)b_Ab 溶液印刷的、稀釋系列的鏈霉親和素_Cy5后的生物素化抗體(b-Ab)斑點；B)斑點對于稀釋系列的鏈霉親和素_Cy5的劑量響應(yīng)曲線。圖10描述了在加入一滴緩沖液之前和之后,用b-Ab捕獲斑點和Cy5_鏈霉親和素不穩(wěn)定斑點印刷的示例性芯片的熒光圖像。圖11描述了在印刷后RT貯存I天后(灰色三角)和在印刷后貯存23天后(黑色圓圈)，對于BNP檢測的測定的劑量響應(yīng)曲線。圖12描述了具有用蠟網(wǎng)格壓印的POEGMA刷的玻璃載玻片的圖像。㈧說明在單個蠟柵欄(corral)的中心點上的抗體陣列的圖像。(B)由含有可溶性熒光檢測試劑的斑點圍繞的內(nèi)部4x4抗體陣列的放大熒光圖像。圖13描述了對于IgG和IgM的示例性測定的結(jié)果。A)印刷的測定芯片。B)對于作為不穩(wěn)定的檢測斑點一起共印刷的IgG和IgM的共印刷的檢測抗體。C)其中芯片與PBS一起孵育的陰性對照。D)其中僅Cy5-抗IgG檢測試劑印刷到不穩(wěn)定斑點中的測定。E)其中僅Cy5-抗IgM檢測試劑印刷到不穩(wěn)定斑點中的測定。F)其中芯片與雞血一起孵育的陰性對照。圖14描述了來自測定的捕獲熒光，其中不同分子量的PEG預(yù)印刷到聚合物層上，和/或與捕獲試劑溶液一起包括。詳述
公開內(nèi)容在其應(yīng)用中并不限于下述說明書中闡述或附圖中舉例說明的組分構(gòu)建和排列的細(xì)節(jié)。公開內(nèi)容中所述的目的能夠具有其他實施方案并以多種方法實踐或進(jìn)行。此夕卜，本文使用的措辭和術(shù)語用于描述的目的且不應(yīng)視為限制性的?！鞍ā?、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其變化在本文中的使用意欲涵蓋其后列出的項目及其等價物以及另外的項目。為了促進(jìn)公開內(nèi)容原理的理解的目的， 參考具有用于描述其的舉例說明性語言的多個方面和有關(guān)實施方案。
冠詞“一 (a) ”、“一 (an) ”和“該(the) ”在本文中用于指冠詞的一個或超過一個(即，至少一個)語法對象。例如，“元件”意指至少一個元件并且可以包括超過一個元件。類似地，提及“細(xì)胞”包括多個細(xì)胞，并且在一些實施方案中，可以包括組織和/或器官。類似地，如本文使用的術(shù)語“和/或”應(yīng)理解為包括在有關(guān)短語內(nèi)敘述的任何單個元件，以及兩個或更多個元件的任何組合，包括所有元件。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語都具有與公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。定義
雖然認(rèn)為下述術(shù)語由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員充分理解，但闡述下述定義以促進(jìn)公開主題的解釋。盡管目前描述了代表性方法、裝置和材料，但與本文描述的那些相似或等價的任何方法、裝置和材料都可以用于公開主題的實踐或測試中。如本文使用的，術(shù)語“樣品”或“生物學(xué)樣品”指從其自然或天然狀態(tài)獲得的任何材料，以便促進(jìn)任何所需操作和/或進(jìn)一步處理和/或修飾。樣品或生物學(xué)樣品可以包含細(xì)胞、組織、液體(例如生物學(xué)液體)、蛋白質(zhì)(例如抗體、酶、可溶性蛋白質(zhì)、不溶性蛋白質(zhì))、多核苷酸(例如RNA、DNA)、膜制備物等，其可以任選進(jìn)一步從其自然或天然狀態(tài)分離和/或純化?！吧飳W(xué)液 體”指源于生物學(xué)生物體的任何液體。示例性生物學(xué)液體包括但不限于血液、血清、血漿、淋巴液、膽汁液、尿、唾液、粘液、痰、淚、腦脊髓液(CSF)、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽灌洗液、直腸灌洗液、陰道灌洗液、結(jié)腸灌洗液、鼻灌洗液、喉灌洗液、滑液、精液、腹水液、膿、母乳、耳液、汗液和羊膜液。生物學(xué)樣品可以處于其天然狀態(tài)，或通過加入組分例如試劑、或去除一種或多種天然組成成分(例如血液血漿)的修飾狀態(tài)。如本文使用的，術(shù)語“生物標(biāo)記”指與生物學(xué)狀態(tài)或生物學(xué)過程相關(guān)的物質(zhì)，例如疾病狀態(tài)或疾病或病癥的診斷或預(yù)后指示劑(例如鑒定疾病或病癥的存在或以后發(fā)展的可能性的指示劑)。生物標(biāo)記的存在或不存在、或生物標(biāo)記濃度的增加或減少可以與特定狀態(tài)或過程相關(guān)和/或指示特定狀態(tài)或過程。生物標(biāo)記可以包括但不限于細(xì)胞或細(xì)胞組分(例如病毒細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、癌細(xì)胞等)、小分子、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、肽、蛋白質(zhì)、酶、抗原和抗體。生物標(biāo)記可以衍生自傳染劑例如細(xì)菌、真菌或病毒，或可以是內(nèi)源分子，與健康個體相比較，所述內(nèi)源分子在患有疾病或病癥的受試者中以更大或更小的豐度被發(fā)現(xiàn)(例如基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的增加或減少)。如本文使用的，術(shù)語“檢測部分”是可通過方法檢測的任何部分或化合物，所述方法包括但不限于光譜的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、化學(xué)的、電化學(xué)的、放射性和其他物理方法。檢測部分可以是可間接檢測的；例如，檢測部分可以是其為特異性結(jié)合對的成員的部分或化合物，其中所述結(jié)合對的第二個成員包括可以直接檢測的檢測部分。此類檢測部分的非限制性和已知例子是生物素，其可以與包含檢測部分例如熒光團的親和素或鏈霉親和素結(jié)合。示例性檢測部分包括但不限于熒光團、生色團、放射性標(biāo)記、多核苷酸、小分子、酶、納米顆粒和向上轉(zhuǎn)化劑(upconverter)。如本文使用的，術(shù)語“傳染病”(本文縮寫為ID)指由傳染劑引起的那些疾病，所述傳染劑包括但不限于微生物，例如病毒、細(xì)菌、古細(xì)菌、渦蟲、變形蟲和真菌。如本文使用的，術(shù)語“聚合物”以其如本領(lǐng)域使用的普通含義給出，即特征在于通過共價鍵連接的一個或多個重復(fù)單位(單體)的分子結(jié)構(gòu)。重復(fù)單位可以都是相同的，或在一些情況下，在聚合物內(nèi)可以存在超過一種類型的重復(fù)單位。術(shù)語聚合物預(yù)期涵蓋任何類型的聚合物，包括均聚物、共聚物(例如隨機共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物等)，及其摻和物、組合和混合物。聚合物可以是線性、分支、星狀的等。如本文使用的，術(shù)語“區(qū)域”指在材料表面上的限定區(qū)域。區(qū)域可以通過在具有不同組成的兩種材料之間的獨特界面鑒定且受其約束。如本文使用的“特異性結(jié)合對”指顯示出與彼此的特異性結(jié)合，或相對于其他分子與彼此增加的結(jié)合的兩個分子。特異性結(jié)合對可以顯示出功能結(jié)合活性，例如受體和配體(例如藥物、蛋白質(zhì)或碳水化合物)、抗體和抗原等；或結(jié)構(gòu)結(jié)合活性，例如蛋白質(zhì)/肽和蛋白質(zhì)/肽；蛋白質(zhì)/肽和核酸；以及核苷酸和核苷酸等。一般地，結(jié)合對的一個成員可以充當(dāng)本文描述的裝置中的捕獲試劑，并且捕獲試劑可以與所述結(jié)合對的第二個成員結(jié)合，其可以作為樣品例如生物學(xué)液體中的分析物存在。如上所述，如本文使用的“分析物”可以是特異性結(jié)合對的任何第二個成員。一般地，分析物是樣品例如生物學(xué)液體的組成成分，或在樣品例如生物學(xué)液體中發(fā)現(xiàn)。分析物可以是如上所述的生物標(biāo)記。如本文使用的，術(shù)語“受試者”和“患者”可互換使用且指人和非人動物。術(shù)語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，包括但不限于非人靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。在特定實施方案中，受試者是人患者。以一般含義，公開內(nèi)容涉及這樣的裝置，其包括包含表面的基底；在表面上的防污聚合物層；在聚合物層上的至少一個捕獲區(qū)，包含至少一種捕獲試劑；和在聚合物層上的至少一個不穩(wěn)定區(qū)，包含至少一種檢測試劑和賦形劑；其中所述捕獲區(qū)和不穩(wěn)定區(qū)是空間分離的。公開內(nèi)容還提供了包含裝置的方法、測定和試劑盒。防污聚合物層可以提供在樣品組分和基底和/或聚合物層之間的非特異性結(jié)合的減少。在聚合物層上的不穩(wěn)定區(qū)可以通過減少涉及一般測定的必需步驟而允許簡化的方法和測定，例如僅僅使裝置的表面與樣品接觸且隨后檢測來自捕獲區(qū)的任何信號，同時仍提供高度靈敏的檢測限值。裝置和相關(guān)方法高度適合于許多背景，包括研究和臨床實驗室以及大規(guī)模即時(point-of-care)測定。
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某底
多種不同類型的基底可以依照公開內(nèi)容使用。在實施方案中，基底包含允許應(yīng)用聚合物層的表面。在一些實施方案中，基底是無標(biāo)記的光學(xué)或質(zhì)量檢測器(例如表面等離振子共振檢測器、光波導(dǎo)器、橢圓對稱檢測器等)，并且基底的表面是傳感表面(例如將與生物學(xué)液體接觸的表面部分)。此類裝置的例子包括但不限于美國專利號 6，579，721 ;6，573，107 ;6，570，657 ;6，423，055 ;5，991，048 ；5，822，073 ;5，815，278 ;5，625，455 ;5，485，277 ;5，415，842 ;4，844，613 ;和 4，822，135 中所述的那些。在其他實施方案中，基底是生物傳感器、測定板等。例如，基底可以是光學(xué)生物傳感器，例如美國專利號5,313, 264,5,846,842,5,496, 701等中所述的那些。基底還可以是電勢測定或電化學(xué)生物傳感器，例如美國專利號5，413，690或PCT申請W098/35232中所述的。基底可以是金剛石膜生物傳感器，例如美國專利號5，777，372中所述的。相應(yīng)地，基底可以是有機或無機的；可以是金屬(例如銅或銀)或非金屬；可以是聚合物或非聚合物；可以是傳導(dǎo)、半傳導(dǎo)或不傳導(dǎo)的(絕緣的)；可以是反射或非反射的；可以是多孔或非多孔的；等。例如，基底可以包含聚乙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、金、娃、氧化娃、氮氧化娃、銦、氧化鉭、氧化銀、鈦、氧化鈦、鉬、銥、氧化銦錫、金剛石或金剛石樣膜等?；卓梢允沁m合于“基于芯片”和“基于針”的組合化學(xué)技術(shù)的基底。全部可以依照已知技術(shù)進(jìn)行制備。參見例如，美國專利號5，445，934,5, 288，514和5，624，711。如上所述的基底可以由任何合適材料形成，包括但不限于選自下述的材料:金屬、金屬氧化物、合金、半導(dǎo)體、聚合物(例如以任何合適形式的有機聚合物包括紡織的、非紡織的、塑模的、擠出的、澆鑄的等)、硅、氧化硅、陶瓷、玻璃及其復(fù)合物。如本文描述的用于形成基底的聚合物可以是任何合適的聚合物，包括但不限于:聚(乙烯)(PE)、聚(丙烯)(PP)、聚(丁二烯)(PB)的順和反異構(gòu)體、聚(異戊二烯)的順和反異構(gòu)體、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚(ε-己內(nèi)酯)(PECL或PCL)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)及其同系聚合物、聚(丙烯酸甲酯)及其同系聚合物、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯、聚(酸酐)、尼龍、聚酰亞胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丁二烯(PB)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺及其同系聚合物例如聚(N-異丙基丙烯酰胺)、氟化聚丙烯酸酯(PFOA)、聚(乙烯-丁烯)(PEB)、聚(苯乙烯-丙烯腈)(SAN)、聚四氟乙烯(PTFE)及其衍生物、聚烯烴塑性體、及其組合和共聚物等?；卓梢匀芜x具有在基底表面上形成的另外層例如金或氧化層，例如以促進(jìn)聚合物層或連接層的沉積，如下文進(jìn)一步討論的。連接層
取決于基底和聚合物的選擇，連接層可以任選包括在基底和聚合物層之間。例如，連接層可以由化合物形成，所述化合物包含與引發(fā)劑偶聯(lián)(例如共價偶聯(lián))的錨定基團(anchorgroup)(例如直接偶聯(lián)或通過中間連接基團偶聯(lián))。錨定基團的選擇將取決于在其上形成連接層的基底，并且引發(fā)劑的選擇將取決于用于形成如下文更詳細(xì)地討論的防污聚合物的具體反應(yīng)。錨定基團(anchoring group)可以使化合物或連接層與基底的表面共價或非共價偶聯(lián)。非共價偶聯(lián)可以是通過任何合適的次級相互作用，包括但不限于疏水作用、氫鍵合、范德華力、離子鍵、金屬-配體相互作用等?；撞牧虾拖鄳?yīng)錨定基團的例子包括例如金、銀、銅、鎘、鋅、鈀、鉬、汞、鉛、鐵、鉻、猛、鶴及其與含硫官能團的任何合金，所述含硫官能團例如硫醇、硫化物、二硫化物(例如-SR或-SSR，其中R是H、烷基例如低級烷基或芳基)等；具有硅烷和氯硅烷的摻雜或無摻雜的硅(例如-SiR2Cl,其中R是H、烷基例如低級烷基或芳基)；具有羧酸作為錨定基團的金屬氧化物，例如二氧化硅、氧化鋁、石英、玻璃等；具有亞硝酸鹽和異氰化物的鉬和鈀；和具有羥肟酸的銅。適合作為錨定基團的另外的合適官能團包括二苯甲酮、?；?、酸酐、環(huán)氧化物、磺?；⒘柞；⒘u基、膦酸酯、膦酸、氨基酸基團、酰胺等。參見例如，美國專利號6，413，587。任何合適的引發(fā)劑可以通過在對于引發(fā)劑的活性并不關(guān)鍵的位置上引入共價鍵而摻入錨定基團內(nèi)。此類引發(fā)劑的例子包括但不限于溴代異丁酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯-Cl、聚苯乙烯-C1、AIBN、2_溴代異丁酸酯、氯苯、六溴甲基苯、六氯甲基苯、二溴二甲苯、溴丙酸甲酯(methyl bromoproprionate)。引發(fā)劑的另外例子包括美國專利號6，413，587中所述的那些引發(fā)劑(例如在其第10-11欄)和美國專利號6，541，580中所述的那些引發(fā)劑。如上所述，連接基團或“間隔物”可以插入錨定基團和引發(fā)劑之間。接頭可以是極性、非極性、帶正電、帶負(fù)電或不帶電的，并且可以是例如飽和或不飽和、線性或分支的亞烷基、雜亞烷基、亞芳烷基、烷亞芳基或其他亞烴基(hydrocarbylene)，例如鹵化亞烴基，特別是氟化亞烴基。合適的接頭是3 - 20個碳原子的飽和亞烷基基團，即-(CH2)n-,其中η是包括3 - 20在內(nèi)的整數(shù)。參見例如，美國專利號6，413,587。接頭的另一個合適實施方案是3 - 20個單位的多縮乙二醇，即_(CH2CH20)n_，其中η是包括3 - 20在內(nèi)的整數(shù)。錨定層可以通過任何合適技術(shù)沉積。它可以作為自裝配的單層沉積。它可以通過經(jīng)由化學(xué)反應(yīng)(參見例如，美國專利號6，444，254)或經(jīng)由反應(yīng)性等離子體蝕刻或電暈放電處理修飾基底而產(chǎn)生。它可以通過等離子體沉積過程進(jìn)行沉積。它可以通過旋轉(zhuǎn)涂布或浸涂進(jìn)行沉積。它可以通過噴漆進(jìn)行沉積。它還可以通過沉積、印刷、壓印等進(jìn)行沉積。它可以作為連續(xù)層或不連續(xù)(例如模式化)層進(jìn)行沉積。在一些實施方案中，基底可以是通常用于微陣列生產(chǎn)的玻璃、氧化硅或其他無機或半導(dǎo)體材料(例如氧化硅、氮化硅)或化合物半導(dǎo)體(例如砷化鎵和砷化銦鎵)。在一些實施方案中，基底可以是微量滴定(微孔)板。在一些實施方案中，錨定基團可以是硅烷或氯硅烷(例如，-SiR2Cl,其中R是H、烷基例如低級烷基或芳基)。在一些實施方案中，連接層在兩個分開步驟中在基底上形成。例如，在第一個步驟中，烷基硅烷或烷硫醇的錨定層可以沉積到表面上例如二氧化硅或玻璃或金，并且呈現(xiàn)末端反應(yīng)性官能團(例如胺)。隨后，包含第一官能團的雙功能分子可以與第一個步驟中沉積的第一連接層反應(yīng)，所述第一官能團針對由第一連接層呈現(xiàn)的末端基團反應(yīng)。雙功能分子的第二官能團含有部分基團，所述部分基團充當(dāng)用于聚合物層聚合的引發(fā)劑例如ATRP引發(fā)劑。聚合物層`
本文描述的裝置的聚合物層顯示出防污性質(zhì)。如本文就聚合物層而言使用的，防污涉及生物體的生長抑制(例如減少或預(yù)防)，以及在聚合物和生物體或生物分子(例如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核苷酸等)之間的非特異性或偶然結(jié)合相互作用。聚合物的防污性質(zhì)可以通過任何合適方法引入，例如防污(或可替代地，抗污)劑的摻入或通過聚合物自身的結(jié)構(gòu)/體系結(jié)構(gòu)。防污劑是本領(lǐng)域已知的，并且可以通過技術(shù)人員根據(jù)裝置的具體用途或防污劑的可用性進(jìn)行選擇。非限制性例子包括具有殺生物活性的有機和無機化合物，以及可以與聚合物層一起摻入或與聚合物層結(jié)合的化合物，在接觸后所述聚合物層減少或抑制生物分子(例如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核苷酸、碳水化合物/脂質(zhì)等)與聚合物的非特異性結(jié)合相互作用。一些實施方案提供了具有提供防污性質(zhì)的結(jié)構(gòu)或體系結(jié)構(gòu)的聚合物層。在一些實施方案中，聚合物可以適當(dāng)包括刷狀聚合物，其一般而言通過具有一個或多個基團的單體核心基團的聚合形成，所述基團作用于抑制與之偶聯(lián)的生物分子(例如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核苷酸、碳水化合物/脂質(zhì)等)的結(jié)合。適當(dāng)?shù)?，單體核心基團可以與蛋白質(zhì)抗性首基(headgroup)偶聯(lián)。聚合物層可以使用游離基聚合技術(shù)適當(dāng)?shù)匦纬?，例如催化鏈轉(zhuǎn)移聚合、引發(fā)-轉(zhuǎn)移-終止劑介導(dǎo)的聚合(例如光引發(fā)-轉(zhuǎn)移-終止劑介導(dǎo)的聚合)、自由基聚合、穩(wěn)定自由基介導(dǎo)的聚合(SFRP)、原子轉(zhuǎn)移游離基聚合(ATRP)、和可逆的添加-片段化鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合。例如，單體形成刷狀聚合物的自由基聚合可以依照已知技術(shù)進(jìn)行，例如美國專利號6，423，465,6, 413，587和6，649，138，美國專利申請?zhí)?003/0108879中所述的，及其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化。單體形成刷狀聚合物的原子轉(zhuǎn)移游離基聚合也可以依照已知技術(shù)進(jìn)行，例如美國專利號6，541，580和6，512，060，美國專利申請?zhí)?003/0185741中所述的，及其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化?？梢允褂每赏ㄟ^上文討論的過程聚合的任何合適的核心乙烯基單體，包括但不限于苯乙烯、丙烯腈、乙酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯醇、乙烯酸及其組合。在一些實施方案中，聚合物層通過寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯(OEGMA)的表面引發(fā)的ATRP(S1-ATRP)以形成聚(OEGMA) (POEGMA)膜而形成。在一個實施方案中，聚合物層是通過甲基丙烯酸酯和甲氧基封端的OEGMA的共聚作用制備的官能化的POEGMA膜。適當(dāng)?shù)?，POEGMA聚合物可以在單個步驟中形成。一般而言，通過本文描述的過程(或本領(lǐng)域已知的或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他過程)形成的刷狀分子可以是長度為2或5直到100或200納米，或更長，并且可以以10、20或40至直到100、200或500毫克/米或更高的密度沉積到表面部分上。蛋白質(zhì)抗性基團可以是親水首基或kosmotropes。例子包括但不限于寡糖、三(丙基亞砜)、羥基、甘油、磷酰膽堿、三(肌氨酸)(Sarc)、N-乙酰哌嗪、甜菜堿、羧基甜菜堿、磺基甜菜堿、全甲基化山梨糖醇、六甲基磷酸酰胺、分子內(nèi)兩性離子(例如，-CH2N+(CH3)2CH2CH2CH2S(V) (ZW)、和甘露醇。kosmotrope蛋白質(zhì)抗性首基的另外例子包括但不限于:
-(OCH2CH2) 60H ；
-0(甘露醇)；
-C (0) N (CH3) CH2 (CH (OCH3)) 4CH20CH3 ；
-N(CH3) S+ClV - SO3^Na+(Iil)；
-N(CH3) /CH2CH2SO3^ ；
-C (0) Pip (NAc) (Pip =哌嗪基)
-N (CH3) 2+CH2CO2 ;
-0([Glc-a (1,4)-Glc-β (1)1)；
-C (0) (N (CH3) CH2C (0)) 3N (CH3) 2 ；
-N (CH3)/CH2CH2CH2SO3- ；
-C (0) N (CH3) CH2CH2N (CH3) P (0) (N (CH3) 2) 2- ;和 -(S(0) CH2CH2CH2) 3S (0) CH3。參見例如，Kane等人，Langmuir 19,2388-91 (2003)(例如表1)。在一些實施方案中，合適的蛋白質(zhì)抗性首基包含聚(乙二醇)(PEG)，例如3 - 20個單體單位的PEG。在進(jìn)一步的組分沉積到聚合物層上之前，具有任選連接層和聚合物層的基底可以是干燥的或至少肉眼可見干燥的(即，對于觸摸干燥的或?qū)τ谀恳暀z查干燥的，但在聚合物層中保留結(jié)合水或水合水)。例如，為了增強捕獲試劑的固定，聚合物層可以適當(dāng)?shù)乇Ａ艚Y(jié)合水或水合水，但不含大量表面水。如果具有連接層和聚合物層的基底已以烘干形式貯存，那么結(jié)合水或水合水可以通過使聚合物層快速暴露于水(例如通過浸入水中)和后續(xù)吹干表面(例如用氮或氬噴嘴)再引入?？商娲兀Y(jié)合水或水合水可以通過使聚合物層暴露于環(huán)境空氣對于大氣水與聚合物層結(jié)合足夠的時間再引入。捕獲區(qū)
該裝置包括包含至少一種捕獲試劑的至少一個捕獲區(qū)，所述捕獲試劑可以與聚合物層非共價結(jié)合。捕獲區(qū)的數(shù)目可以廣泛不同并且可以取決于幾種因素，包括基底的大小和形狀、裝置的預(yù)期用途(例如即時診斷、實驗對象組陣列(例如，用于篩選DNA、麗Chips (微小RNAs)、蛋白質(zhì)、組織、細(xì)胞、化學(xué)化合物、抗體、碳水化合物等的微陣列)等。捕獲區(qū)包含的捕獲試劑一般是特異性結(jié)合對的一個成員。合適的捕獲試劑的例子包括但不限于抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、核酸、核酸或肽適配體、配體、受體等。實施方案涉及包含多個捕獲區(qū)的裝置，例如診斷實驗對象組陣列，所述捕獲區(qū)包含多種不同的捕獲試劑。在實施方案中，捕獲試劑可以包含與任何感興趣的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)相關(guān)的生物標(biāo)記。相應(yīng)地，捕獲試劑的選擇可以通過本文描述的裝置和方法的預(yù)期用途或應(yīng)用驅(qū)動，并且可以包括已知與任何感興趣的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)相關(guān)的任何分子，或懷疑與任何感興趣的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)相關(guān)的任何分子。因此，捕獲試劑的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本領(lǐng)域可獲得的知識的能力之內(nèi)。在一些實施方案中，捕獲試劑可以包含與任何感興趣的微生物感染相關(guān)的生物標(biāo)記，其例子包括但不限于:炭疽、禽流感、肉毒中毒、水牛痘(Buffalopox)、基孔肯雅熱(Chikungunya)、霍亂、球孢子菌病、克雅氏病、克里米亞-剛果出血熱、登革熱、登革出血熱、白喉、Ebola出血熱、腸出血性大腸桿菌(Ehec)(大腸桿菌(E.Coli)0157)、腦炎、圣路易(Saint-Louis)、腸出血性大腸埃希桿菌感染腸道病毒(Enterohaemorrhagicescherischia coli infection Enterovirus)、經(jīng)食物傳播的疾病、腎綜合征性出血熱、漢坦病毒肺綜合征、肝炎 、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感、日本腦炎、拉沙熱、軍團桿菌病、利什曼病、鉤端螺旋體病、李斯特菌病、虱傳播的斑疹傷寒、瘧疾、馬爾堡出血熱、麻疹、腦膜炎球菌病、猴痘、心肌炎尼帕病毒、奧絨絨熱(O’Nyong-Nyong fever)、百日咳、痕疫、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、回歸熱、裂谷熱、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合征(SARS)、志賀氏菌病、天花疫苗意外暴露、葡萄球菌食物中毒、梅毒、兔熱病、傷寒癥、西尼羅河病毒、黃熱病等。捕獲試劑可以通過任何合適的技術(shù)沉積到聚合物層上，所述技術(shù)例如縮微印刷或微印記，包括壓電或其他形式的非接觸性印刷和直接接觸性羽毛筆印刷。當(dāng)捕獲試劑印刷到聚合物層上時，它可以適當(dāng)?shù)匚降骄酆衔飳觾?nèi)，從而使得當(dāng)裝置暴露于液體例如生物學(xué)液體時，它保持結(jié)合。刷狀聚合物還可以提供保護(hù)性環(huán)境，從而使得當(dāng)裝置貯存時，捕獲試劑保持穩(wěn)定。例如，在其中捕獲試劑是肽或蛋白質(zhì)例如抗原蛋白質(zhì)或抗體的實施方案中，刷狀聚合物層可以保護(hù)捕獲試劑免于降解，允許裝置貯存于環(huán)境條件下。當(dāng)通過多種捕獲試劑沉積到聚合物層上的不連續(xù)位置形成陣列時，可以制備1、3、5、10、100或直到1000個探針位置/cm2的探針密度?，F(xiàn)代非接觸性陣列儀(arrayers)可以用于沉積步驟中，以產(chǎn)生具有最多至1，000, 000個探針位置/cm2的陣列。例如，使用浸蘸筆納米平板印刷術(shù)，可以制備具有最多至10億不連續(xù)的探針位置/Cm2的陣列。應(yīng)當(dāng)理解的是，如本文描述，取決于具體應(yīng)用，在每個捕獲斑點上的具體分子種類可以是不同的，或一些可以是相同的(例如以提供一些冗余或?qū)φ?。捕獲試劑可以印刷到聚合物層上以形成捕獲區(qū)。一個或多個捕獲區(qū)可以以任何特定方式排列，并且可以包含任何所需形狀或模式，例如斑點(例如具有任何一般的幾何形狀)、線或其他合適模式，所述形狀或模式允許鑒定在聚合物和基底表面上的捕獲區(qū)。在實施方案中，多種捕獲試劑可以以預(yù)定模式排列，從而使得捕獲試劑的身份與基底上的特定位置相關(guān)。不穩(wěn)定區(qū)
該裝置另外包括包含至少一種檢測試劑和賦形劑的至少一個不穩(wěn)定區(qū)。在一些實施方案中，在與液體例如生物學(xué)液體、緩沖液或含水溶劑接觸后，捕獲試劑可以保持與聚合物層(例如聚合物刷)非共價結(jié)合，而不穩(wěn)定區(qū)中存在的賦形劑可以吸附到聚合物刷內(nèi)且阻斷檢測試劑的吸附。相應(yīng)地，當(dāng)暴露于含水液體例如包含生物學(xué)液體的樣品時，檢測試劑可以溶解且釋放到液體內(nèi)，并且可以與感興趣的分析物結(jié)合。賦形劑也可以在貯存過程中進(jìn)一步穩(wěn)定檢測試劑。在一些實施方案中，檢測試劑可以包含能夠與特異性結(jié)合對的第二個成員結(jié)合的化合物。當(dāng)溶解且釋放到樣品(例如生物學(xué)液體)內(nèi)時，如果特異性結(jié)合對的第二個成員存在于液體中，那么它可以與檢測試劑結(jié)合。然后所述第二個成員可以與裝置的捕獲區(qū)中的捕獲試劑結(jié)合?？商娲?，當(dāng)已與捕獲試劑結(jié)合時，檢測試劑可以遇到特異性結(jié)合對的第二個成員。例如，如果捕獲試劑是抗原蛋白質(zhì)，并且分析物是可以特異性結(jié)合抗原蛋白質(zhì)的患者生成的抗體時,檢測試劑可以包含抗人抗體。在一些實施方案中，不穩(wěn)定區(qū)可以包含兩種不同試劑以形成“夾心”型測定。在此類實施方案中，第一種試劑可以與分析物結(jié)合，而其他試劑與第一種試劑結(jié)合，以形成隨后可以與捕獲試劑結(jié)合的“夾心”。例如，檢測試劑可以包含生物素，其可以結(jié)合用檢測部分官能化的親和素或鏈霉親和素。`檢測試劑進(jìn)一步包含可檢測部分，所述可檢測部分直接或間接提供可檢測信號。示例性檢測部分包括但不限于熒光團、生色團、放射性標(biāo)記、多核苷酸、小分子、酶、納米顆粒和向上轉(zhuǎn)化劑(upconverter)。在一些實施方案中,檢測部分可以是突光團例如花青(例如CyDyes，例如Cy3或Cy5)、熒光素、羅丹明、香豆素、熒光蛋白質(zhì)或其功能片段，或它可以包含小分子例如生物素，或它可以包含金、銀或膠乳顆粒。在一些實施方案中，賦形劑是分子或分子的組合，所述分子選擇的方式使得允許在檢測試劑和聚合物之間存在穩(wěn)定但不持久的結(jié)合。在實施方案中，賦形劑可以是在含水溶液(例如緩沖液、水、樣品、生物學(xué)液體等)中部分可溶、基本上可溶或可溶的。在此類實施方案中，賦形劑的非限制性例子可以選自鹽、碳水化合物(例如糖，例如葡萄糖、巖藻糖、果糖、麥芽糖和海藻糖)、多元醇(例如甘露醇、甘油、乙二醇)、乳化劑、水溶性聚合物及其組合。此類賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以基于在賦形劑和檢測試劑之間的相互作用、賦形劑和聚合物之間的相互作用、賦形劑在特定介質(zhì)中的可溶性、和此類因素的任何組合進(jìn)行選擇。在一些實施方案中，賦形劑包含PEG。檢測試劑和賦形劑可以通過任何合適技術(shù)沉積到聚合物層上，所述技術(shù)例如縮微印刷或微印記，包括壓電或其他形式的非接觸性印刷和直接接觸性羽毛筆印刷。檢測試劑和賦形劑的混合物可以同時沉積，或賦形劑可以在檢測試劑之前沉積。當(dāng)通過多種檢測試劑沉積到聚合物層上的不連續(xù)位置形成陣列時，可以制備1、3、
5、10、100或直到1000個探針位置/cm2的探針密度?，F(xiàn)代非接觸性陣列儀可以用于沉積步驟中，以產(chǎn)生具有最多至1，000, 000個探針位置/cm2的陣列。例如，使用浸蘸筆納米平板印刷術(shù)，可以制備具有最多至10億不連續(xù)的探針位置/cm2的陣列。應(yīng)當(dāng)理解的是，取決于具體應(yīng)用，在每個捕獲點上的具體分子種類可以是不同的，或一些可以是相同的(例如以提供一些冗余或?qū)φ?。其他元件
在一些實施方 案中，該裝置可以進(jìn)一步包含試劑以區(qū)分聚合物層上的模式化區(qū)域，從而使得液體(例如生物學(xué)液體)將保持局限于聚合物層上的指定區(qū)域，從而使得它接觸捕獲區(qū)和不穩(wěn)定區(qū)。此類試劑可以是例如在捕獲試劑和不穩(wěn)定區(qū)的組分的沉積之前，在聚合物層上印刷的疏水墨?？商娲兀噭┛梢允窍?。在其他實施方案中，可以通過選擇用于基底的合適幾何學(xué)和/或體系結(jié)構(gòu)，例如允許樣品分散至包含捕獲試劑和不穩(wěn)定斑點的組分的區(qū)域的幾何學(xué)，而在裝置上包含或定向樣品。在一些實施方案中，基底可以包含孔、或一系列互聯(lián)孔。在一些實施方案中，例如當(dāng)生物學(xué)液體是血樣時，不穩(wěn)定區(qū)可以包含抗凝劑以預(yù)防血液凝固。示例性抗凝劑包括但不限于維生素K拮抗劑例如香豆素、肝素和低分子量肝素。在一些實施方案中，該裝置可以進(jìn)一步包含用對照試劑印刷的區(qū)域。例如，當(dāng)檢測試劑包含抗人抗體時，可以沿著捕獲區(qū)印刷人IgG的對照捕獲區(qū)，以驗證抗人檢測抗體的活性并且使來自檢測部分的信號例如熒光強度均一化。裝置貯存
在捕獲試劑、檢測試劑、賦形劑及其他任選組分沉積后，如上所述，例如通過輕柔干燥、吹干、凍干或在環(huán)境溫度暴露于環(huán)境空氣而任選地干燥該裝置，持續(xù)對于物品干燥或至少肉眼可見干燥所需的足夠時間。一旦裝置是干燥或至少肉眼可見干燥的，它就可以密封在容器(例如不透性或半透性聚合物容器)中，它可以貯存于其中并運送至用戶。一旦密封在容器中，在一些實施方案中，當(dāng)貯存于25°C的溫度時，裝置就可以具有至少2 - 4個月，或直到6個月或更多的貯存期限(例如沒有超過20、30或50百分比的結(jié)合活性的喪失)。檢濕
在本文描述的裝置暴露于生物學(xué)樣品(例如生物學(xué)液體)后，可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法檢測來自檢測試劑的信號。示例性方法包括但不限于目視檢測、熒光檢測(例如熒光顯微鏡檢測)、閃爍計數(shù)、表面等離振子共振、橢圓對稱法、原子力顯微鏡檢測、表面聲波裝置檢測、放射自顯影術(shù)和化學(xué)發(fā)光。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，檢測方法的選擇取決于采用的具體檢測試劑。試劑盒
在一些實施方案中，公開內(nèi) 容還提供了用于在本文描述的方法中使用的試劑盒。試劑盒可以包括如本文描述的裝置，和任選的另外組分例如緩沖液、試劑和關(guān)于實施本文描述的方法的說明書。緩沖液和試劑的選擇取決于具體應(yīng)用，例如測定的背景(即時、研究、臨床)、待測定的一種或多種分析物、使用的檢測部分等。例如，如果捕獲試劑是多核苷酸并且感興趣的分析物是互補多核苷酸，那么試劑盒可以包括加入生物學(xué)液體的樣品中的裂解緩沖液，以便從樣品制備可用于結(jié)合的多核苷酸。試劑盒還可以包括信息材料，其可以是描述、指導(dǎo)、銷售的或涉及本文描述的方法和/或用于本文描述的方法的裝置用途的其他材料。在實施方案中，信息材料可以包括關(guān)于裝置產(chǎn)生、裝置的物理性質(zhì)、有效期、分批或生產(chǎn)場所信息等等的信息。示例性測定設(shè)計
下述段落更詳細(xì)地描述了公開內(nèi)容的一個非限制性實施方案。在一些實施方案中，公開內(nèi)容提供了允許小型化、多路測定的一次性芯片，其可以對于一種或多種感興趣的IDs測試生物學(xué)液體。在一些實施方案中，測定可以在一個步驟中進(jìn)行。在特定實施方案中，測定可以無需預(yù)處理或微流體而進(jìn)行。除了用于結(jié)合感興趣的生物標(biāo)記的穩(wěn)定捕獲斑點外，裝置還包括不穩(wěn)定微斑點(miCTospots)，其允許次級檢測試劑沿著捕獲試劑印刷。在與一滴生物學(xué)液體接觸后，在不穩(wěn)定斑點中的這些次級試劑可以溶解到溶液內(nèi)且標(biāo)記樣品中存在的目標(biāo)。在這種技術(shù)的一個實施方案中，且如圖1中所示，根據(jù)公開內(nèi)容的測定包含一次性芯片，由一次性芯片組成，或基本上由一次性芯片組成，所述一次性芯片已涂有P0EGMA，且隨后用疏水墨印刷，所述疏水墨區(qū)分POEGMA的模式化區(qū)域。用于在玻璃基底上合成POEGMA刷的程序概括于圖2中。模式區(qū)含有個別捕獲試劑的斑點。POEGMA刷的親水性質(zhì)允許一滴血液擴散跨越整個POEGMA表面，而疏水墨產(chǎn)生可以使血滴局限于分析區(qū)的“柵欄”。POEGMA的模式化區(qū)域還含有“不穩(wěn)定斑點”，其包括熒光標(biāo)記的檢測抗體，和可溶性聚乙二醇。在一些實施方案中，捕獲斑點中的捕獲試劑可以是診斷感興趣的ID的抗原。當(dāng)來自患者的液體(例如血液)樣品應(yīng)用于芯片時，樣品中的患者生成的抗體可以與抗原結(jié)合。在此類實施方案中，不 穩(wěn)定斑點可以包括熒光標(biāo)記的抗人抗體，其可以與固定的患者生成的抗體結(jié)合。測定的此類實施方案在圖3中舉例說明。在其他實施方案中，捕獲斑點中的捕獲試劑可以是針對診斷感興趣的ID的抗原的抗體。當(dāng)來自患者的液體(例如血液)樣品應(yīng)用于芯片時，樣品中的患者生成的抗原可以與抗體結(jié)合。在此類實施方案中，不穩(wěn)定斑點可以包括對于相同抗原上的不同表位特異性的熒光標(biāo)記的抗體，其可以與固定的患者生成的抗原結(jié)合。測定的此類實施方案在圖4中舉例說明。在特定實施方案中，將待用作捕獲試劑的抗原蛋白質(zhì)或抗體作為每種抗原的一行個別斑點點在POEGMA表面上，以便提供獨立重復(fù)且從而改善測定的穩(wěn)定性。例如，含有不同捕獲抗體密度的微斑點的微陣列可以允許范圍寬得多的分析物濃度落在給定檢測器的動態(tài)范圍內(nèi)，并且從而可以消除通常運行單個樣品的測試的稀釋系列。低分析物濃度可以在高捕獲抗體密度的區(qū)域中檢測，而高分析物濃度可以在低捕獲抗體密度的區(qū)域中檢測。如圖5中所述，陣列可以以確保檢測抗體斑點在與血樣接觸后溶解的方式格式化。在該圖中，十二個分開的捕獲區(qū)作為斑點印刷，具有各自含三種不同的捕獲試劑的四組斑點。在捕獲斑點周圍印刷包括Cy5標(biāo)記的抗人抗體作為檢測試劑的不穩(wěn)定區(qū)?？扇苄訮EG也包括在不穩(wěn)定斑點中?？扇苄訮EG可以優(yōu)先吸附到POEGMA刷內(nèi)，并且阻斷檢測抗體吸附到刷內(nèi)。相應(yīng)地，盡管由于壓電噴墨印刷和肉眼可見的干燥過程局限于斑點中，但檢測抗體事實上是“不穩(wěn)定”狀態(tài)，因為在與含水溶液接觸后，它們可以容易地溶解且釋放到血滴內(nèi)。過量可溶性PEG的添加還可以在貯存過程中穩(wěn)定熒光標(biāo)記的檢測抗體，并且當(dāng)測試血滴引入時，可以充當(dāng)幫助再溶解檢測抗體的賦形劑。在與一滴血液接觸后，標(biāo)記的檢測抗體將溶解到溶液內(nèi)。在一些實施方案中，檢測抗體可以是抗人抗體，其可以與血樣中存在的所有人抗體結(jié)合且從而標(biāo)記所述人抗體。同時，血液中存在的分析物(如果存在的話)(即患者生成的針對抗原的抗體)可以與穩(wěn)定印刷的抗原斑點結(jié)合。在其他實施方案中，檢測抗體可以是對于感興趣的抗原的特異性抗體。在與血樣接觸后，如果抗原存在于樣品中，那么檢測抗體可以與抗原結(jié)合，其依次又可以與捕獲試劑抗體結(jié)合。作為陽性對照，人IgG的斑點可以沿著抗原斑點印刷。這些對照的作用是驗證抗人檢測抗體的活性，并且還可以用于跨越測定使熒光強度歸一化，以減少測定間變異性。為了預(yù)防血液凝固，酶肝素也可以印刷到不穩(wěn)定斑點中的POEGMA刷上。肝素可以在印刷前與PEG混合，或可以在分開步驟中自身印刷。在一個實施方案中，且如下文在圖6中所示，可以對患者實施手指針刺，并且將所得到的血滴應(yīng)用于芯片表面。印刷到芯片表面上的疏水墨引起血滴僅擴展跨越一個或多個目標(biāo)檢測區(qū)，其中它溶解為在檢測區(qū)內(nèi)印刷的可溶性檢測試劑和肝素(以預(yù)防血液的凝固)。當(dāng)溶解的、熒光標(biāo)記的檢測抗體通過血滴由其印刷斑點溶解時，必須發(fā)生三個系列事件以生成陽性信號。這些事件包括下述:(I)血液中存在的分析物與個別捕獲試劑的固定且無熒光的斑點的結(jié)合產(chǎn)生夾心的前半部分；(2)血液側(cè)面擴散通過聚合物刷導(dǎo)致可溶性檢測抗體從其印刷斑點的移動；(3)在進(jìn)入捕獲試劑和分析物的復(fù)合物(夾心的前半部分)后，熒光標(biāo)記的檢測抗體與其各自的分析物-捕獲試劑斑點結(jié)合，完成夾心且導(dǎo)致在其中未標(biāo)記試劑已印刷的位置上的熒光斑點的形成。
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在這個實施方案中，測定基于支持?jǐn)?shù)據(jù):通過含有分析物的溶液的擴散，作為“不穩(wěn)定斑點”印刷的熒光標(biāo)記的檢測抗體通過血流攜帶至印刷并穩(wěn)定固定的捕獲試劑的相鄰行。因此，顯現(xiàn)來自用不同捕獲試劑印刷的斑點的熒光的出現(xiàn)提供了不同分析物(陽性)的明確鑒定。與通過使用摻料到全血內(nèi)的分析物的稀釋系列預(yù)校正裝置的常規(guī)熒光免疫測定相同地進(jìn)行不同分析物的濃度的定量。根據(jù)這個實施方案的測定解決了如下POC測試中的每個關(guān)鍵需要:(I)通過小型化、多路化、一步、現(xiàn)場處理，并且通過無需預(yù)處理或微流體的情況下在得自手指針刺的未稀釋全血中直接測試而減少ID測試的成本；(2)為了簡化ID篩選過程，在二維中的擴散使空間定位的試劑結(jié)合在一起，以產(chǎn)生功能測定，并且從而消除了關(guān)于液體轉(zhuǎn)移步驟、樣品或試劑的微流體操作和洗滌步驟的需要；(3)這個多路平臺能夠在無需樣品預(yù)處理的情況下用單滴血液篩選ID標(biāo)記的實驗對象組；(4)測定將是快速的，其減輕通常與通訊ID測試結(jié)果相關(guān)的困難；和(5)所公開設(shè)計的實際檢測方案是夾心型熒光免疫測定，其提供目前在本領(lǐng)域中可獲得的最高靈敏度。ID篩選中的這個量級的改善具有顯著影響整個人群的健康的潛力。為了控制傳染病，過程的一個部分是定期篩選，以鑒定通過空氣、食物、水或物理接觸傳播的多種病原體，并且認(rèn)為開發(fā)所提議的篩選平臺使得定期和廣泛的ID篩選對于大得多百分比的人群更可接近。最后，高度適應(yīng)并且模塊化的設(shè)計在用作用于許多其他需要領(lǐng)域的診斷中同樣是有用的，包括在臨床試驗中的生物標(biāo)記監(jiān)測、大范圍流行篩選、生物防御和新發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記的大規(guī)模驗證。
ID篩詵的方法
下述節(jié)段描述了目前的ID篩選方法的幾個障礙，以及各自如何通過例如上文描述的實施方案來解決。成本
用于單個傳染病標(biāo)記的最準(zhǔn)確的基于免疫測定的測試被稱為酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，其每個測試的標(biāo)記花費約$16美元并且要求平均6小時的技術(shù)人員時間。使得多路成為可能的近期的改善目前能夠以約$14美元的成本測試四種傳染劑的一個陣列，并且要求平均約4.5小時的技術(shù)人員時間。然而，這些測試要求使用約$110,000 - $160,000美元價值的實驗室設(shè)備。此外，每個測試要求使用約200 μ L血清或血漿，其必須從通過靜脈抽血得自患者的全血樣品分離。這種抽血一般在即時獲得，且隨后必須轉(zhuǎn)運至中央實驗室用于實際測試。通過使樣品收集、處理和測試的關(guān)鍵方面流線化，根據(jù)本實施方案所述的裝置如下顯著減少了成本:(I)通過直接測試得自手指針刺的未稀釋全血而消除了所有預(yù)處理；
(2)測試小型化，以減少作為捕獲試劑和檢測抗體點上的試劑-蛋白質(zhì)抗原的量；和(3)一步、現(xiàn)場處理。此外，測試可以是多路的并且能夠靶向IDs實驗對象組，同時使成本不顯著增加超過單個ID測試的成本?？梢詿o需使用樣品預(yù)處理或使用微流體來使細(xì)胞與分析物溶液分離而實現(xiàn)這一點，這是由于獨特的蛋白質(zhì)和細(xì)胞抗性聚合物刷允許用飛摩爾的檢測限值從全血進(jìn)行熒光免疫測定，這在本文進(jìn)一步詳細(xì)描述。提供多路測試的實施方案產(chǎn)生進(jìn)一步的優(yōu)點。許多已集中于受到最大媒體關(guān)注的IDs，例如HIV，導(dǎo)致通常缺乏對于需要測試其他IDs的一般群體的期望或緊迫性。關(guān)于這個問題的合適解決方案是每當(dāng)要求單個ID測試時，提供用于整個IDs實驗對象組的測試，這可以僅導(dǎo)致相對于針對單個ID的測試成本的增加。本文描述的裝置的小型化幫助遏制成本，因為印刷到本文描述的裝置上的捕獲試劑和檢測抗體具有趨于零的小的皮升數(shù)量。當(dāng)要求對于受指責(zé)(stigmatized)疾病例如HIV的特異性測試時，多路還可以幫助一些人經(jīng)歷的不適，因為HIV是在芯片上存在的幾種IDs之一。具有覆蓋許多IDs包括食物和空氣傳播的IDs的多路測試，允許個體對于要求測試感覺更少憂慮。此外，經(jīng)改造的功能表面(由發(fā)明人開發(fā))的新應(yīng)用允許裝置的小型化，以減少所需的捕獲試劑的量，并且有效消除標(biāo)準(zhǔn)實驗室ID篩選測試的最顯著成本之一，例如基于板的ELISAs。此外，通過采用近期開發(fā)的噴墨印跡技術(shù)，可以以大約數(shù)美分(several cents)/芯片的成本制造一次性、多路傳感器芯片。減少測定成本的實施方案提供幾個優(yōu)點，例如以更少錢測試更多人的能力。但是通過減少對于高度發(fā)達(dá)的衛(wèi)生保健基礎(chǔ)設(shè)施的所需依賴達(dá)到的降低成本也是重要的。例如，在發(fā)展中國家中的旅行診所具有有限的時間和人員，并且具有單步驟、現(xiàn)場處理的多路測試顯著增加患者的通量和檢測的感染的數(shù)目。此外，產(chǎn)生小型化、多路測定消除了巨大量的材料并且顯著減少運輸和貯存的負(fù)擔(dān)。特別地，本公開內(nèi)容的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性質(zhì)使得芯片在環(huán)境溫度中的運輸和貯存成為可能，避免關(guān)于昂貴的氣候控制貯存和轉(zhuǎn)運的需要。測定簡單性和讀出時間
已經(jīng)歷ID測試的個人注意到導(dǎo)致作為不適的結(jié)果通知的焦慮的等待期(通常數(shù)天到數(shù)周)和回避未來測試的原因。如果要求第二次就診以收到測試結(jié)果，那么超過50%的患者不返回。研究還已顯示如果等待時間是100分鐘，那么最高達(dá)50%的患者將在收到測試結(jié)果前離開，如果等待時間是50分鐘，那么約20%的患者將離開。本公開內(nèi)容的裝置和方法通過在5分鐘時期內(nèi)實現(xiàn)結(jié)果而消除了這個問題。這幫助確保測試和結(jié)果都在單次就診過程中提供，并且將消除患者提供用于結(jié)果通知的聯(lián)系信息的需要(提供這個信息可以導(dǎo)致患者隱私憂慮，這是測試回避的另一個原因)。要求通過靜脈穿刺抽取的全血樣品的測試要求高度熟練工人的顯著努力、時間和可用性。除了血樣的實際抽取外，許多診斷還要求血液分離成細(xì)胞和血漿。這要求另外的設(shè)備和專業(yè)知識，增加了測定成本和讀出時間，并且限制了提供即時診斷的能力。另外，靜脈穿刺過程自身可以導(dǎo)致患者中的醫(yī)學(xué)并發(fā)癥，并且許多個體對于針和靜脈穿刺感到的強烈厭惡。所有這些憂慮可以通過產(chǎn)生這樣的測試得到減少，所述測試能夠檢測僅數(shù)微升血液中的IDs實驗對象組，所述數(shù)微升血液可以經(jīng)由手指針刺容易地獲得。此外，通過產(chǎn)生具有檢測數(shù)微升血液中的多重目標(biāo)的能力的測試，對于新生兒測試的增加的接近是可能的，在所述新生兒中抽取更大數(shù)量的血液是成問題的，并且由于所需血液的數(shù)量，通常要求在血液抽取時進(jìn)行輸血。本文描述的裝置和方法對于新生兒的ID篩選也具有造成顯著影響的潛力，當(dāng)母親的醫(yī)療史是無法獲得的(例如在戰(zhàn)爭、饑荒和斗爭的情況下)，或必須研究已知ID從母親到新生兒的潛在傳播時，這是通常需要的。最后，通過依賴擴散以使兩組空間分離的試劑集合以生成信號，本文描述的裝置和方法消除了對于洗滌或液體轉(zhuǎn)移步驟的需要。這消除了對于昂貴或復(fù)雜微流體的需要，這從而減少芯片前成本(pre-chip cost)，并且當(dāng)它們實際上用臨床樣品野外測試時，消除了對于大多數(shù)當(dāng)代“芯片實驗室”設(shè)計如此常見的失敗主因。更高通量的ID測試可以`通過減少所需材料(例如針和采血小瓶的消除，以及其適當(dāng)處置的關(guān)注)來達(dá)到。此外，除了手指針刺采血針外，在本公開內(nèi)容的裝置和方法中產(chǎn)生的僅有一次性項目是小片玻璃或塑料，其充當(dāng)測定的血液接觸表面。數(shù)千個這些可以用一升漂白劑溶液消毒，并且可以將這些表面處置在常規(guī)垃圾中。此外，在低資源背景中的測試通常在隔離區(qū)域中發(fā)生。雖然將測試運送至這些區(qū)域增加了接近，但是任何類型的隨訪是不存在的或僅在長時間段后發(fā)生缺失經(jīng)常的情況。此外，面對面通訊通常是唯一選擇，因為其他方法例如郵件、電話或電子郵件是不能利用或不可靠的。由于這些原因，快速結(jié)果是必需的。如上所述，選項例如基于側(cè)面流動條的測試可用于這些情況，但是它們的靈敏度是有限的并且關(guān)于這種形式的多路測試的潛力也是有限的。靈敏度
在一些實施方案中描述的裝置提供在標(biāo)準(zhǔn)實驗室測試?yán)缁诎宓腅LISA測試中發(fā)現(xiàn)的靈敏度，具有廉價、手提式和快速結(jié)果側(cè)面流動條測試的優(yōu)點。這通過在裝置的設(shè)計中利用新材料(本文進(jìn)一步詳細(xì)討論的)來達(dá)到。通過使用廉價的表面包被層能夠消除生物分子和細(xì)胞的非特異性吸附。因此，因為消除了在生物測定中由于蛋白質(zhì)的偶然吸附引起的背景噪音的最大來源，本文描述的裝置和方法提供了可以達(dá)到先前難以達(dá)到的靈敏度水平的實施方案。一般地，最靈敏的測定要求技術(shù)高端和資本密集型健康護(hù)理基礎(chǔ)設(shè)施的支持。在目前方法中，在即時獲得的患者樣品必須轉(zhuǎn)運至維持進(jìn)行實際測試所需的設(shè)備和人員的實驗室。低資源背景只是缺乏對于此類設(shè)施的接近，這排除這些區(qū)域具有對于最靈敏診斷的接近。根據(jù)一些實施方案所述的裝置提供了現(xiàn)場分析，其允許高度靈敏的診斷用于在其中健康護(hù)理基礎(chǔ)設(shè)施較不發(fā)達(dá)的背景中。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解上文公開的示例性實施方案將充分適合于進(jìn)行所述目的且獲得結(jié)果和優(yōu)點，以及其中固有的那些。這個實施方案中描述的方法、程序、處理、分子和具體化合物僅僅代表更一般技術(shù)的一個考慮應(yīng)用，并且不應(yīng)視為限制于上文更一般地公開的方面和實施方案。下述非限制性實施例預(yù)期是純粹舉例說明的，并且顯示依照公開內(nèi)容進(jìn)行的具體實驗。
實施例實施例1.在玻璃載玻片上合成POEGMA刷
POEGMA刷如下在玻璃上構(gòu)造(圖2，所有化學(xué)制品都購自Sigma):首先，將玻璃載玻片(VffR)在3:1 H2SO4: H2O2的溶液中清潔30分鐘。在用去離子H2O清洗且干燥后，將清潔的載玻片浸入10%氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中30分鐘，并且隨后用乙醇清洗且在120°C干燥3小時(步驟I)。隨后將載玻片浸入1%溴代異丁酰溴和1%三乙胺的二氯甲烷溶液中30分鐘，用二氯甲烷和乙醇清洗，并且用N2吹干(步驟2)。隨后將載玻片在氬氣下浸入5 mg/mL Cu(I)Br、12 mg/mL 二卩比唳和300 mg/mL寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的脫氣聚合作用溶液中12小時(步驟3)。最后，將載玻片用去離子H2O清洗且用N2吹干。實施例2.POEGMA刷的蛋白質(zhì)抗性` 通過纖連蛋白(Fn)、牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(Ly)(所有蛋白質(zhì)都以I mg/mL的PBS溶液，pH = 7.4)和未稀釋的胎牛血清(FBS)的吸附，測試在硅片上生長的POEGMA刷的蛋白質(zhì)抗性。通過橢圓對稱法測量作為POEGMA膜厚度的函數(shù)的蛋白質(zhì)層厚度，且顯示于圖7中。在陰性對照-具有固定的ATRP引發(fā)劑的表面-上的吸附蛋白質(zhì)厚度取決于蛋白質(zhì)而改變，并且對于其他蛋白質(zhì)和FBS的范圍為 10 A(Ly)至 25 A0相比之下，薄POEGMA刷Γ14 A厚度)顯示所有蛋白質(zhì)和血清的顯著更少的蛋白質(zhì)吸附。POEGMA刷的厚度增加至、5 A或更大消除所有蛋白質(zhì)的吸附和最顯著地消除血清蛋白質(zhì)的吸附至低于橢圓對稱法的I A檢測限值。實施例3.抗體微陣列的印刷
無接觸PerkinElmer Piezorray用于在室溫和一定濕度將Ab微陣列印刷到POEGMA基底上。關(guān)于IL-6和骨保護(hù)素(OPG) (R&D Systems)的抗體由50 μ g/mL溶液印刷且允許非共價吸附到100 nm厚的聚合物刷內(nèi):(1)在玻璃上，和(2)在未修飾的硝酸纖維素基底(Whatman,陽性對照)上通過S1-ATRP生長的100 nm厚的POEGMA刷。在印刷后，通過將印刷的載玻片置于真空下而促進(jìn)斑點的干燥。首先使陣列與稀釋系列的100 mL分析物摻料的(analyte-spiked)PBS或血清一起伴隨攪拌孵育2小時，隨后與具有l(wèi)%(w/v)BSA的PBS中的100 ml I mg/ml生物素化的二抗孵育I小時。最后，通過在100 mL I μ g/ml鏈霉親和素_Cy5中孵育30分鐘使陣列顯色，隨后用Axon Genepix 4200熒光微陣列掃描儀掃描。在每個孵育步驟后，將陣列用1%BSA (w/v)和 0.l%(w/v) Tween-20 的 PBS 溶液 30 秒洗滌兩次。顯示于圖8A中的關(guān)于點在玻璃上的POEGMA上的IL_6測定的微陣列斑點的熒光圖像顯示隨著漸增的分析物濃度的熒光強度的增加。斑點甚至在0.1 pg/mL(5 fM)的IL-6濃度也可以在視覺上與背景區(qū)分。圖8A還顯示在陣列構(gòu)造和后續(xù)夾心免疫熒光測定自始至終，POEGMA基質(zhì)保留其抵抗非特異性蛋白質(zhì)吸附的能力，因為在測試前測量的斑點周圍的背景區(qū)域中的熒光強度顯示在程序完成后無強度的增加。在POEGMA上的這種背景信號轉(zhuǎn)變?yōu)檠逯酗w摩爾的檢測限值(LODs)，和跨越五個數(shù)量級的分析物濃度的動態(tài)范圍(圖SB直到8D)。此外，盡管采用孵育和清洗步驟，不存在斑點的析出(圖8A)，其證實了捕獲抗體的穩(wěn)定固定。在緩沖液和血清中關(guān)于點在POEGMA上的OPG特異性抗體的OPG劑量應(yīng)答曲線(圖SB)顯示了使用蛋白質(zhì)抗性基底的另一個重要后果，因為它們顯示LODs在緩沖液和血清中幾乎相同。這些結(jié)果與大多數(shù)其他熒光免疫測定形成對比，在其他熒光免疫測定中，與相同測定中的緩沖液中的LOD相比較，在含有高濃度的外來蛋白質(zhì)的復(fù)雜生理溶液中的LOD —般大幾個數(shù)量級。盡管來自在POEGMA上的斑點陣列的絕對信號低于得自點在硝酸纖維素上的陣列的絕對信號(原始數(shù)據(jù)未顯示)，但得自POEGMA刷的背景信號(其接近玻璃基底的自體熒光水平)顯著低于來自硝酸纖維素的背景信號。作為血清中的IL-6濃度的函數(shù)，點在硝酸纖維素和POEGMA上的IL-6特異性抗體陣列的熒光應(yīng)答顯示于圖SC中。數(shù)據(jù)顯示來自硝酸纖維素上印刷的捕獲Ab斑點的熒光信號僅可見至10 pg/ml的濃度,而在POEGMA上的信號低至100 fg/ml的濃度仍清晰可見。盡管與硝酸纖維素相比來自點在POEGMA刷上的抗體陣列的絕對信號更低，但在POEGMA刷上顯著更低的背景熒光更多地補償了更低的來自斑點的絕對信號。另外，點在玻璃上的POEGMA刷上的針對IL-6的抗體可以檢測直接來自未稀釋的全血的IL-6，具有 15 fM的LOD (圖8D)。實施例 4.印刷的抗體微陣列的劑量應(yīng)答
兩個不同濃度的生物素化的抗體(b-Ab)用于產(chǎn)生在POEGMA刷表面上的微陣列，其隨后暴露于稀釋系列的鏈霉親和素_Cy5(圖9A)。印刷溶液的濃度差異4個數(shù)量級(lmg/mLb-Ab和.0001mg/mL b-Ab)。通過使陣列暴露于已知濃度的Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素獲得這些微陣列針對鏈霉親和素的劑量應(yīng)答(圖9B)。具有高b-Ab濃度的斑點顯示出從4 fM到4 nM的六個數(shù)量級的動態(tài)范圍。具有低b-Ab濃度的斑點也具有從I pM到I μ M的六個數(shù)量級的動態(tài)范圍，并且證明對于定量更高濃度的Cy-5鏈霉親和素(其在高b-Ab濃度的斑點中生成檢測器飽和信號)是有用的。通過組合兩個斑點濃度的應(yīng)答，獲得9個數(shù)量級的應(yīng)答。實施例5.穩(wěn)定b-Ab捕獲斑點和鏈霉親和素_Cy5不穩(wěn)定斑點的印刷
將具有五個生物素化的Ab斑點的陣列印刷到POEGMA表面上，以形成捕獲試劑的“穩(wěn)定的”固定斑點。此外，將鏈霉親和素_Cy5和可溶性PEG的溶液點在可溶性PEG的預(yù)印刷斑點之上，以產(chǎn)生檢測試劑的“不穩(wěn)定”斑點的8x2陣列。該裝置顯示于圖1OA中，在其中穩(wěn)定斑點在左小圖的頂部部分中不可見，因為不是發(fā)熒光的。在一周貯存后，將50 μ L PBS吸取到陣列的表面上，以測試鏈霉親和素_Cy5斑點溶解到溶液內(nèi)且與生物素化的Ab捕獲斑點結(jié)合的能力。如圖1OB中所示，足夠量的活性Cy5-鏈霉親和素溶解到溶液內(nèi)，并且通過生物素化的Ab斑點捕獲以產(chǎn)生可檢測信號。實施例6.BNP測定的劑量應(yīng)答
在室溫(RT)貯存I天后和在貯存23天后，測量印刷在POEGMA上的測定用于檢測腦利鈉肽(brain naturietic peptide)(關(guān)于心臟損傷的生物標(biāo)記)的劑量應(yīng)答。進(jìn)行這個測定以確定:(1)用測定可能的定量，和(2)其在貯存后的穩(wěn)定性。將分析物孵育20分鐘以模擬POC測試條件。5參數(shù)邏輯擬合法擬合數(shù)據(jù)，且獲得8 pg/ml的L0D，如圖11中所示；相比之下，1-Stat測試(Abbott)具有14 pg/mL的L0D。重要的是，即使在忙存3周后,在測定的LOD或DR中也不存在差異。這些結(jié)果也與其他研究者的先前觀察結(jié)果一致:PEG可以在環(huán)境條件下穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在環(huán)境條件下的長貯存期限是用于即時裝置(point-of-caredevices)的重要屬性，因為這些印刷的診斷裝置將無需在4°C貯存于緩沖液中，從而使得印刷的芯片可以在室溫轉(zhuǎn)運、貯存且使用，這是對于在其中可能不容易獲得致冷條件的低資源設(shè)置中使用重要的屬性。實施例7.檢測人IgGs和IgMs的測定
在這個實施例中，制備檢測來自血液的人IgGs和IgMs的測定。選擇這些分析物是因為健康供體血液可以用于這個目的。圖12顯示了測定的構(gòu)造。首先通過S1-ATRP在玻璃載玻片上生長 100 nm厚的POEGMA刷。隨后使用載玻片壓印器將玻璃載玻片用網(wǎng)格圖形的蠟壓印，以使樣品局限于這個芯片的活性區(qū)。接下來將抗體陣列噴墨印刷到單個蠟柵欄的中心；每個斑點直徑為 150 Mm。內(nèi)部4x4陣列是捕獲Abs (AbeS)的斑點，以形成“穩(wěn)定的”捕獲斑點；行I和4是抗小鼠Abc (陽性對照);行2:抗人IgG Abc ;行3:抗人IgM Abc0接下來，將檢測混合物(cocktail)印刷作為“不穩(wěn)定”斑點的3個外部行(圖23B)。這些斑點含有小鼠Cy-5-抗人IgG和/或小鼠Cy-5-抗人IgM(檢測Ab具有不同于AbeS的針對人IgG和IgM的表位)、肝素和IOX-摩爾過量的PEG5000的混合物。內(nèi)部4x4抗體陣列不具有固有熒光，并且由于來自印刷的Ab的光散射，在圖12B中僅僅勉強可見。外部斑點是可見的，因為它們含有以足夠高濃`度的Cy5-標(biāo)記的Ab/ S，足以使它們飽和熒光檢測器且因此看起來是白色的。將來自手指針刺的一滴血液Γ20 μ )施加到疏水柵欄內(nèi)的測定表面，并且孵育5分鐘。將表面用來自擠壓瓶的ml緩沖液快速清洗，所述緩沖液應(yīng)去除松散結(jié)合的血細(xì)胞和蛋白質(zhì)。血液流動至邊緣且與疏水柵欄結(jié)合，表現(xiàn)為在邊緣周圍的紅色(未顯示)。圖13顯示了測定的結(jié)果。在圖13B中，人IgG和IgM的AbdS作為不穩(wěn)定檢測斑點(具有PEG+肝素)共印刷，從而使得在血液中孵育后產(chǎn)生完全夾心，導(dǎo)致在行2和3中都出現(xiàn)的熒光斑點。在圖13B-F中的邊緣信號是由于在通過洗滌步驟從POEGMA刷去除后，來自與疏水柵欄結(jié)合的血液的散射。在全血中，IgG的濃度是大致5 mg/mL(33 μΜ)和IgMs的濃度是1.5mg/mL (1.6 μΜ)，提示甚至在這個最初實驗中，這些蛋白質(zhì)分析物也應(yīng)在這個水平由未稀釋的血液檢測。圖13C和13F顯示了其中芯片與PBS(C)或雞血(F) —起孵育的陰性對照實驗，從而使得僅陽性對照:行I和4發(fā)光，而行2和3未顯示熒光。圖13D和13Ε是兩種其他對照；在圖13D中，僅Cy5-抗IgG Abd印刷到不穩(wěn)定斑點中，從而使得行2發(fā)光，而行3則不發(fā)光，而在小圖13E中，僅Cy5-抗IgM Abd印刷到不穩(wěn)定斑點中，從而使得行3發(fā)光，而行2則不發(fā)光。應(yīng)當(dāng)指出Cy5-Abds以高濃度印刷到不穩(wěn)定斑點的外部環(huán)境中，并且在與血液接觸后僅是部分溶解的，從而使得其殘留熒光仍飽和檢測器。實施例8.賦形劑印刷模式的評估 就其對印刷的捕獲試劑抗體(Abd)溶解的作用評估兩種方法:(I)可溶性PEG加入Abd的印刷溶液中，和⑵在Abd印刷前，可溶性PEG直接預(yù)印刷到POEGMA刷內(nèi)。評估PEG的三種分子量:1000、11000和66000 Da。這些PEGs各自以I mg/mL的濃度加入Cy-5標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I(cTnl)抗體的印刷溶液中。將以I mg/mL濃度的可溶性PEG印刷到POEGMA刷上，然后將檢測試劑印刷到這些PEG的斑點上。在印刷可溶性PEG的微斑點后，將Abd微斑點直接印刷到先前印刷的PEG之上。為了測定將PEG加入印刷溶液中的有效性，將Abd的斑點印刷在cTnl Abe斑點陣列周圍。將20 PL含有cTnl的緩沖液加入陣列中，其允許Cy-5抗cTnl抗體斑點溶解到溶液內(nèi)，且標(biāo)記cTnl。在掃描后，測定在標(biāo)記的cTnl捕獲后由穩(wěn)定Abe斑點生成的信號。將麗10000或66000的PEG加入印刷的檢測抗體溶液中改善了檢測抗體的可用性。預(yù)印刷的PEG看起來不會極大影響檢測抗體的可用性。實施例9.用于HBV和HIV的單一分析物和多路夾心測定
制備由涂有POEGMA的一次性芯片組成的微陣列，其邊界隨后用微陣列載玻片壓印器(Arraylt Corp.)由疏水烴墨(hydrocarbon ink)印刷。疏水墨將產(chǎn)生將血滴局限于芯片的活性區(qū)的“柵欄”。對于單一分析物測定，這個活性區(qū)將是對于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特異性的個別Abe的印刷的“穩(wěn)定”斑點。還將印刷一行HBsAg以充當(dāng)陽性對照。對于多路D4測定，p24和gp41 (用于HIV-1)、和gp36 (用于HIV-2)也將印刷在分開行中，并且HIV抗原的斑點將沿著作為陽性對照的捕獲抗體斑點印刷。Ab。將作為一行個別斑點點在POEGMA表面上，以便提供獨立重復(fù)且從而改善檢測的統(tǒng)計學(xué)和測定的穩(wěn)定性。POEGMA刷的親水性質(zhì)和體系結(jié)構(gòu)將允許血滴擴散跨越芯片的活性POEGMA區(qū)。除了捕獲Abs的“穩(wěn)定”斑點外，還將印刷熒光標(biāo)記的檢測抗體(Abd)的可溶性“不穩(wěn)定”斑點。陣列以類似于圖5中所示那種的方式格式化。為了確保印刷的Abd的不穩(wěn)定斑點在與血液接觸后溶解，將可溶性PEG加入印刷溶液中。這種可溶性PEG將優(yōu)先吸附到POEGMA刷內(nèi)，且阻斷Abd吸附到刷內(nèi)。盡管僅僅由于噴墨印刷和肉眼可見的干燥過程局限于斑點中，但這些Abd事實上處于“不穩(wěn)定”狀態(tài)，并且在與含水溶液接觸后可以容易地溶解且釋放。過量可溶性PEG加入檢測Ab的作用是在貯存過程中穩(wěn)定檢測試劑，并且重要的是當(dāng)測試血滴引入時，充當(dāng)幫助再溶解檢測Ab的賦形劑。在與一滴血液接觸后，這些標(biāo)記的抗體將溶解到溶液內(nèi)且與血樣中存在的所有目標(biāo)結(jié)合且從而標(biāo)記所述目標(biāo)。作為陽性對照，HBV和HIV抗原的斑點將沿著捕獲抗體斑點印刷。這些對照的作用是驗證檢測試劑的活性，并且還可以用于跨越測定使熒光強度歸一化，以減少測定間變異性。為了預(yù)防凝固，與過量PEG類似地混合的不穩(wěn)定肝素斑點也印刷到刷上。實施例10.能夠直接檢測在全血中的多重傳染性標(biāo)記的自包含測定(self-contained assay)
在這個實施例中，對于POC免疫測定，使用作為“不穩(wěn)定斑點”印刷的檢測試劑開發(fā)用于HBV的定量單一分析物測定以及用于HBV和HIV的定量多重分析物D4測定。在檢測HIV感染中有用的抗體應(yīng)答一般針對三類抗原蛋白質(zhì):包膜抗原(ENV)、聚合酶基因產(chǎn)物(POL)和種群特異性抗原(GAG)。一般而言，單一HIV抗原對于血清學(xué)診斷是不夠靈敏或特異性的，從而使得抗原的組合對于血清學(xué)診斷是最有用的。主要包膜抗原將是gp41,而gpl20和gpl60作為備份。用于評估的來自核心蛋白質(zhì)主要抗原是匆(GAG),而其他抗原包括p55(其為p24的前體的GAG蛋白質(zhì))和p53 (POL)。HIV-2感染的鑒定也是重要的。用于HIV-2的前導(dǎo)候選抗原是gp36 (ENV)，HIV-1的gp41的類似物。HBV的診斷是直接的，因為HBsAg在樣品中的存在指示感染。針對HBsAg的商購可得的單克隆和多克隆抗體在這個平臺中估計，以確定最適合于該平臺的那些抗體。單個分析物定量測定。最佳化的POEGMA表面和檢測試劑印刷條件，例如本文描述的那些，將用于印刷抗HBsAg微斑點的陣列(以類似于圖5中所示的陣列的形式)?？笻BsAgAb的五個重復(fù)斑點包含在陣列中的單一行中，并且還將印刷一行HBsAg以充當(dāng)陽性對照。Cy5標(biāo)記的抗HBsAg檢測抗體的微斑點將印刷在捕獲抗體和陽性對照行周圍的區(qū)域中。在一個載玻片上將印刷二十四個陣列，并且四個載玻片將裝配成96孔板形式。使用目標(biāo)摻料的緩沖液生成涵蓋Og/mL - 100g/mL濃度的劑量應(yīng)答曲線，隨后生成來自由I fM -1 μΜ分析物摻料的HBV陰性人血液的劑量應(yīng)答曲線。劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)將擬合至五參數(shù)邏輯(5-PL)擬合。參數(shù)評估將使用MATLAB (版本6.5)通過大規(guī)模置信域反射牛頓算法(large-scaletrust-region reflexive Newton algorithm)進(jìn)行。就其 LOD、DR 和 COV 而言評估測定。對于用肝素化全血(通過檢測混合物的溶解而肝素化)的測定，來自表面的血液去除對于成像熒光是必需的。因此，采用去除來自表面的血液的不同“去除”方案:(1)使用Visine瓶逐滴洗滌表面；(2)芯片插入緩沖液填充的具有軌道(tracks)的瓶內(nèi)，所述軌道指導(dǎo)芯片的插入和浸入及其從瓶中的去除。我們首先使用Wilhelmy板平衡，以將芯片以不同速率插入且收回到緩沖液內(nèi)，持續(xù)時間為用于最佳化這個方案的不同的孵育總時間。測定血液“去除”方法對測定LOD、DR和COV的影響，并且最佳方案用于所有血液分析。多重分析物定量測定。最佳化的POEGMA表面和檢測試劑印刷條件，例如本文描述的那些，將用于印刷抗HBsAg、抗p24、抗gp41和抗gp36捕獲Ab微斑點的陣列(以類似于圖5中所示的陣列的形式)。每種捕獲抗體的五個重復(fù)斑點包含在陣列中的單一行中，并且還將存在每種抗原的一行陽性對照。由必需的Cy5標(biāo)記的檢測抗體的混合物組成的微斑點將印刷在捕獲抗體和陽性對照行周圍的區(qū)域中。使用分析物摻料的緩沖液，隨后為分析物摻料的人血(HIV/HBV陰性的)，生成劑量應(yīng)答曲線，并且如先前對于單一分析物測定所述擬合數(shù)據(jù)。單一分析物HBsAg的劑量應(yīng)答曲線將與得自4分析物D4測定的劑量應(yīng)答曲線相比較，以在潛在交叉反應(yīng)性的方面檢查同時暴露于多重分析物和4種不同檢測Abs印刷到相同芯片上對D4測定性能的作用。進(jìn)一步地，我們注意到，盡管這些多重分析物測定將在這個SA中定量表征，但當(dāng)信號超過3 σ LOD (其中LOD通過血液中的劑量應(yīng)答曲線確定)的閾值時，它們僅以定性-是/否形式-用于SA4中，以確定分析物的存在或不存在。 本文引用的所有專利、出版物和參考文獻(xiàn)在此完全引入作為參考。在其中本說明書和引入作為參考的文件包括沖突和/或不一致內(nèi)容的情況下，以本說明書為準(zhǔn)。如果引入作為參考的兩個或更多個文件包括就彼此而言沖突和/或不一致的內(nèi)容，那么以具有稍后生效日期的文件為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.裝置，其包含: a.包含表面的基底； b.在所述表面上的防污聚合物層； c.在所述聚合物層上的至少一個捕獲區(qū)，包含至少一種捕獲試劑；和 d.在所述聚合物層上的至少一個不穩(wěn)定區(qū)，包含至少一種檢測試劑和賦形劑； 其中所述捕獲區(qū)和所述不穩(wěn)定區(qū)是空間分離的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述防污聚合物層包含多個刷狀分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述多個刷狀分子中的至少一個包含單體核心基團。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述 的裝置，其中所述單體核心基團選自苯乙烯、丙烯腈、乙酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯醇、乙烯酸及其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述多個刷狀分子中的至少一個包含蛋白質(zhì)抗性首基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其中所述蛋白質(zhì)抗性首基包含親水首基或kosmotrope。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其中所述蛋白質(zhì)抗性首基包含糖、寡糖、三(丙基亞砜)、羥基、甘油、磷酰膽堿、三(肌氨酸)、N-乙酰哌嗪、甜菜堿、羧基甜菜堿、磺基甜菜堿、全甲基化山梨糖醇、-CH2N+ (CH3) 2CH2CH2CH2S03_)或六甲基磷酸酰胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述防污聚合物層包含聚(寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其包含多個捕獲區(qū)，每個捕獲區(qū)包含至少一種捕獲試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述多個捕獲區(qū)包含至少兩種不同的捕獲試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述多個捕獲區(qū)各自包含不同的捕獲試劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述捕獲試劑是生物標(biāo)記。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述生物標(biāo)記包含細(xì)胞、小分子配體、脂質(zhì)、碳水化合物、多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、抗原或抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述生物標(biāo)記與疾病或病癥相關(guān)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述生物標(biāo)記與傳染病相關(guān)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其中所述傳染病選自病毒、細(xì)菌、古細(xì)菌、渦蟲或真菌感染。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，其中所述傳染病是性傳播疾病。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其包含多個不穩(wěn)定區(qū)，每個不穩(wěn)定區(qū)包含至少一種檢測試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述檢測試劑包含小分子配體、脂質(zhì)、碳水化合物、多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、抗原或抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的裝置，其中所述抗體是非人抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述檢測試劑包含選自下述的檢測部分:生色團、熒光團、放射性標(biāo)記、多核苷酸、小分子、酶、納米顆粒、微粒、量子點或向上轉(zhuǎn)化劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述賦形劑選自鹽、碳水化合物、糖、乳化劑、水溶性聚合物及其任何組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述賦形劑是聚(乙二醇)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中至少一個不穩(wěn)定區(qū)進(jìn)一步包含肝素。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述基底包含玻璃、硅、金屬氧化物或聚合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其進(jìn)一步包含在所述基底和所述聚合物層之間的連接層。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其進(jìn)一步包含試劑以區(qū)分在所述表面或所述聚合物層上的檢測區(qū)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其中所述試劑是疏水墨。
29.根據(jù)權(quán)利要求2 7所述的裝置，其中所述試劑是蠟。
30.制造根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置的方法，所述方法包括: a.提供包含表面的基底； b.在所述表面上形成防污聚合物層； c.將至少一種捕獲試劑印刷到所述聚合物層上；和 d.將至少一種檢測試劑和至少一種賦形劑印刷到所述聚合物層上； 其中所述捕獲試劑印刷到所述聚合物層上與所述檢測試劑和賦形劑空間分離的區(qū)域中。
31.篩選受試者中的疾病或病癥的方法，其包括: a.從所述受試者中獲得生物學(xué)樣品； b.使所述生物學(xué)樣品與權(quán)利要求1的裝置接觸足以允許所述不穩(wěn)定區(qū)中的檢測試劑溶解的時間； c.檢測所述疾病或病癥的存在，其中在所述裝置上的至少一個捕獲區(qū)上的可檢測信號指不所述受試者中疾病或病癥的存在。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述疾病包括傳染病。
33.用于測定受試者中的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)的診斷測定，其包括: a.從所述受試者中獲得生物學(xué)樣品； b.使所述生物學(xué)樣品與權(quán)利要求1的裝置接觸足以允許所述不穩(wěn)定區(qū)中的檢測試劑溶解的時間； c.檢測所述疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)的存在，其中在所述裝置上的至少一個捕獲區(qū)上的可檢測信號指示所述受試者中的疾病、病癥或生物學(xué)狀態(tài)的存在。
34.權(quán)利要求33所述的診斷測定，其中所述疾病是傳染病。
35.權(quán)利要求33所述的診斷測定，其中所述測定是即時測定。
36.試劑盒，其包含權(quán)利要求1的裝置、一組緩沖液和/或試劑、和使用說明書。
全文摘要
公開的是用于檢測來自樣品的分析物的裝置和方法。
文檔編號A61B5/055GK103108587SQ201180035201
公開日2013年5月15日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者A.基爾科蒂, A.赫克納爾 申請人:杜克大學(xué)