專利名稱：用于rna干擾的治療用途的方法及組合物的制作方法
背景技術(shù)：
細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)行為是通過特定時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)模式確定的。長(zhǎng)期以來，基因表達(dá)的干擾一直被認(rèn)為是大量疾病產(chǎn)生的原因，這些疾病包括多種形式的癌癥、血管病、神經(jīng)元和內(nèi)分泌疾病。目前已知，擴(kuò)增、缺失、基因重排、喪失或獲得功能性突變形式的異常表達(dá)模式都將導(dǎo)致疾病細(xì)胞的異常行為。異常的基因表達(dá)也被認(rèn)為是某些生物避開病原體威脅的一種防御機(jī)制。
醫(yī)學(xué)的主要挑戰(zhàn)之一便是調(diào)控廣泛多種生理反應(yīng)所牽涉的靶基因的表達(dá)。雖然在真核細(xì)胞內(nèi)，外源導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)相對(duì)簡(jiǎn)單，但以特定基因?yàn)槟繕?biāo)的抑制仍然較難實(shí)現(xiàn)。抑制基因表達(dá)的傳統(tǒng)方法，包括位點(diǎn)定向基因破壞、反義RNA或協(xié)同抑制或注射，需要復(fù)雜的遺傳基因操縱，或常常超出宿主細(xì)胞毒性耐受水平的大劑量抑制物。
RNA干擾(RNAi)是一種描述了雙鏈(ds)RNA依賴基因的特異遺傳轉(zhuǎn)錄后沉默的現(xiàn)象。利用該現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)性地操縱哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最初嘗試受阻于在響應(yīng)長(zhǎng)dsRNA分子過程中激活的強(qiáng)烈且非特異性的抗病毒防御機(jī)制。Gil et al.Apoptosis2000，5107-114。該領(lǐng)域在證實(shí)21個(gè)核苷酸RNA的合成雙鏈體可介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因特異RNAi，而不引發(fā)遺傳抗病毒防御機(jī)制的基礎(chǔ)上獲得了顯著進(jìn)展。Elbashir et al.Nature2001，411494-498；Caplen et al.Proc NatlAcad Sci2001，989742-9747。小的干擾RNA(siRNA)因而成為剖析基因功能的有力工具?；瘜W(xué)合成小RNA是一種途徑，并已獲得有希望的結(jié)果。許多研究小組也尋求開發(fā)可于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生這種siRNA的基于DNA的載體。最近，個(gè)別研究小組實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)，并發(fā)表了相似的方案，這些方案通常包括短發(fā)夾(sh)RNA的轉(zhuǎn)錄，這些短發(fā)夾RNA可被有效加工而于細(xì)胞內(nèi)形成siRNA。Paddison et al.PNAS2002，991443-1448；Paddison et al.Genes&Dev2002，16948-958；Suiet al.PNAS2002，85515-5520；及Brummelkamp et al.Science2002，296550-553。這些報(bào)導(dǎo)均描述了產(chǎn)生可特異性地靶定眾多內(nèi)源及外源表達(dá)基因的siRNA的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種包含RNAi構(gòu)建體的穩(wěn)定呼吸配方，該RNAi構(gòu)建體被配制為用于將治療有效量的RNAi構(gòu)建體通過肺部或鼻部送遞至患者肺部。某些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被配制為平均直徑小于20微米，更優(yōu)選平均直徑為0.5-10微米的微粒。某些實(shí)施方案中，該微粒由生物可降解聚合物形成。某些實(shí)施方案中，該微粒由選自多糖、二酮哌嗪、聚羥酸、聚酐、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷撐、聚乙烯基化合物、聚硅氧烷、丙烯酸與異丁烯酸的聚合物、聚氨酯、纖維素、聚丁酸(butic acid)、聚戊酸、聚(交酯-共-己內(nèi)酯)或其共聚物中的一種或多種聚合物形成。
某些實(shí)施方案中，該微粒通過溶劑蒸發(fā)、噴霧干燥、溶劑萃取或熱融封裝形成；而另一些實(shí)施方案中，該微粒為干燥或凍干形式。在另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被配制在脂質(zhì)體內(nèi)。
還有一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被配制為包括多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子復(fù)合物。優(yōu)選的超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成，諸如聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β-環(huán)糊精聚合物(βCD聚合物)或其共聚物。更為優(yōu)選的超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成，例如，具有下式的結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精改性的聚氮丙啶 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
某些實(shí)施方案中，包含RNAi構(gòu)建體的呼吸配方包括推進(jìn)劑。
某些實(shí)施方案中，呼吸配方被容納在計(jì)量劑量吸入器、干粉吸入器或噴氣式霧化器內(nèi)。一種優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體的配制量以1-10個(gè)計(jì)量劑量提供治療有效量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了計(jì)量劑量氣溶膠分配器，該分配器中含有用于肺部或鼻部送遞的、包含RNAi構(gòu)建體的可呼吸配方的氣溶膠藥物組合物。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了實(shí)現(xiàn)RNAi構(gòu)建體的全身給藥的方法，該方法包括通過肺部給藥方式，將RNAi構(gòu)建體的可呼吸配方給予患者，其中該RNAi構(gòu)建體被深肺部吸收的量可實(shí)現(xiàn)該RNAi構(gòu)建體全身劑量的送遞。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，其中RNAi構(gòu)建體被配制為用于肺部或鼻部送遞。該藥學(xué)可接受載體任選選自藥學(xué)可接受鹽、酯、及這些酯的鹽。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含該藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝，其中該藥物制劑包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體，該RNAi構(gòu)建體配制為用于肺部或鼻部送遞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種組合物，包含一種或多種被配制在超分子復(fù)合物中，且配制量足以通過RNA干擾機(jī)制減弱所處理細(xì)胞中靶基因的表達(dá)的RNAi構(gòu)建體。例如，該RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)?？蛇x的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。任選地，RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。某些實(shí)施方案中，該組合物被用于體內(nèi)或處理體外細(xì)胞。
某些實(shí)施方案中，超分子復(fù)合物被聚集在平均直徑為20-500nm，更優(yōu)選20-200nm的粒子內(nèi)。
進(jìn)一步舉例說明，超分子復(fù)合物可以是包括線性聚合物或支鏈聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。典型聚合物為陽離子聚合物，如聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β-環(huán)糊精聚合物(βCD-聚合物)或其的共聚物。某些實(shí)施方案中，超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成，例如，具有下式的結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精改性的聚氮丙啶
其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了減弱體內(nèi)細(xì)胞靶基因表達(dá)的方法，該方法包括給予被配制在超分子復(fù)合物中的RNAi構(gòu)建體，給藥量足以通過RNA干擾機(jī)制減弱靶基因的表達(dá)，從而改變所處理細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，其中RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物內(nèi)。該藥學(xué)可接受載體任選選自藥學(xué)可接受鹽、酯、及這些酯的鹽。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含該藥物制劑，并附有指導(dǎo)給藥人類患者該制劑的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝，其中該藥物制劑包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體，其中RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了應(yīng)用于醫(yī)用裝置表面的涂層，該涂層包含內(nèi)部分散有RNAi構(gòu)建體的聚合物基質(zhì)，當(dāng)被植入患者體內(nèi)的位點(diǎn)時(shí)，RNAi構(gòu)建體從基質(zhì)內(nèi)釋放，并改變植入的裝置附近細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化。典型醫(yī)用裝置包括螺釘、板片、墊圈、縫合線、假體錨定裝置、平頭釘、卡釘、電導(dǎo)聯(lián)、瓣膜、膜、導(dǎo)管、可植入血管通路端口、儲(chǔ)血袋、輸血管、中央靜脈導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管、血管植入物、主動(dòng)脈內(nèi)球囊泵、心臟瓣膜、心血管縫合線、人造心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析組件、血液灌注組件、血漿置換組件以及適于血管內(nèi)展開的濾器。某些優(yōu)選實(shí)施方案提供了涂布的支架。
某些實(shí)施方案中，涂層中的RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)?？蛇x的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。任選地，該RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
舉例說明，涂層中的RNAi構(gòu)建體減弱選自細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、c-myb、c-myc、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、BRCA、Bcl-2、VEGF、MDR、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、IRE、C-fos、HSP27、C-raf及金屬硫蛋白基因中至少一種靶基因的表達(dá)。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體通過抑制基因表達(dá)減少平滑肌細(xì)胞的增殖和/或遷移。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了采用一種或多種RNAi構(gòu)建體涂布醫(yī)用裝置的方法，該方法包括a)配制用于涂布裝置表面的RNAi構(gòu)建體，使得該裝置被植入患者體內(nèi)的位點(diǎn)時(shí)，該RNAi構(gòu)建體從表面釋放；及b)將配制的RNAi構(gòu)建體涂布在醫(yī)用裝置表面，其中涂布有RNAi構(gòu)建體的醫(yī)用裝置減弱了植入的裝置附近細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含一種或多種RNAi構(gòu)建體的組合物，RNAi構(gòu)建體被配制為用于經(jīng)皮心包內(nèi)送遞至動(dòng)物。一種實(shí)施方案中，該組合物中的RNAi構(gòu)建體減弱基因表達(dá)，導(dǎo)致梗塞心肌內(nèi)及周圍的血管產(chǎn)生增加并/或減少局部缺血性損傷。任選地，該RNAi構(gòu)建體是全身可利用的，并減弱心包腔遠(yuǎn)端細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。
某些實(shí)施方案中，組合物中的RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合。例如，該脂質(zhì)體是由陽離子囊泡形成脂質(zhì)所形成的陽離子脂質(zhì)體。任選地，該組合物中脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
另其它實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被配制為包括多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子復(fù)合物。優(yōu)選的聚合物為陽離子聚合物，如聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD聚合物)或其共聚物。
某些實(shí)施方案中，組合物中的超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成，例如，具有下式的結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精改性的聚氮丙啶
其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
某些實(shí)施方案中，組合物中的RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)?？蛇x的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。任選地，該RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。一種優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物給予人。
一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，RNAi構(gòu)建體配制用于經(jīng)皮心包內(nèi)送遞。該藥學(xué)可接受載體可任選選自藥學(xué)可接受鹽、酯及這些酯的鹽。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝，其中該藥物制劑包括至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體，該RNAi構(gòu)建體配制用于經(jīng)皮心包內(nèi)送遞。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了用于經(jīng)皮心包內(nèi)體內(nèi)送遞一種或多種RNAi構(gòu)建體的方法，該方法包括將RNA i構(gòu)建體配方給藥至動(dòng)物的心包腔，其中存在的RNAi構(gòu)建體的量足以減弱所治療動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)。例如，心包腔被用作RNAi構(gòu)建體的送遞貯存處。某些實(shí)施方案中，該方法的RNAi構(gòu)建體被局部送遞至心臟及其周圍血管系統(tǒng)中。另一些實(shí)施方案中，該方法的RNAi構(gòu)建體被用于減少平滑肌細(xì)胞的增殖和/或遷移，更為優(yōu)選的是用于治療心肌梗塞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含一種或多種RNAi構(gòu)建體的組合物，該RNAi構(gòu)建體被配制在脂質(zhì)體內(nèi)，可通過RNA干擾機(jī)制減弱體內(nèi)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)。可選的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。任選地，該RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。優(yōu)選的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人類細(xì)胞。
某些實(shí)施方案中，組合物中的脂質(zhì)體是包括陽離子囊泡形成脂質(zhì)的陽離子脂質(zhì)體。其它實(shí)施方案中，該脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了減弱患者細(xì)胞中靶基因的表達(dá)的方法，該方法包括將被配制在脂質(zhì)體中的RNAi構(gòu)建體給予患者，給藥量足以通過RNA干擾機(jī)制減弱靶基因的表達(dá)，從而改變所述細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)?？蛇x的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。任選地，該RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。該方法的優(yōu)選的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人類細(xì)胞。
某些實(shí)施方案中，該方法的脂質(zhì)體為包括陽離子囊泡形成脂質(zhì)的陽離子脂質(zhì)體。其它實(shí)施方案中，該脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，該RNAi構(gòu)建體被配制在脂質(zhì)體內(nèi)。該藥學(xué)可接受載體任選選自藥學(xué)可接受鹽、酯及這些酯的鹽。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含該藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝，其中該藥物制劑包括至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體，其中RNAi構(gòu)建體被配制在脂質(zhì)體內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含一種或多種RNAi構(gòu)建體的組合物，配制的RNAi構(gòu)建體被配制用于電穿孔進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞。例如，該RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物或脂質(zhì)體內(nèi)。某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞或肌細(xì)胞。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了一種通過電穿孔將一種或多種RNAi構(gòu)建體送遞給患者的方法，該方法包括通過電穿孔將足量的RNAi構(gòu)建體給予動(dòng)物，其中RNAi構(gòu)建體減弱患者體內(nèi)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。例如，該方法的RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物或脂質(zhì)體內(nèi)。某些實(shí)施方案中，該方法的細(xì)胞為上皮細(xì)胞或肌細(xì)胞。
一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，該RNAi構(gòu)建體被配制用于電穿孔進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞。該藥學(xué)可接受載體任選選自藥學(xué)可接受鹽、酯及這些酯的鹽。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含該藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝，其中該藥物制劑包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體，該RNAi構(gòu)建體被配制用于電穿孔進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含一種或多種配制的RNAi構(gòu)建體的組合物，用于抑制體內(nèi)不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)，其中通過RNA干擾機(jī)制，RNAi構(gòu)建體減少了對(duì)細(xì)胞有絲分裂和/或阻止該細(xì)胞凋亡而言必不可少的靶基因的表達(dá)。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)?？蛇x的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。例如，該表達(dá)載體選自附加型表達(dá)載體、整合表達(dá)載體、病毒表達(dá)載體。另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
某些實(shí)施方案中，該組合物中的RNAi構(gòu)建體抑制細(xì)胞增殖?？蛇x的RNAi構(gòu)建體促進(jìn)該細(xì)胞凋亡。
典型RNAi構(gòu)建體抑制靶基因，即致癌基因的表達(dá)，如c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I、Abl-1、Bcl2、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、src或Bcr/Abl融合基因。
某些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如抑制或減弱增生性細(xì)胞生長(zhǎng)，并且可以是對(duì)這類癌癥治療的一部分。
另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于抑制淋巴細(xì)胞的活化，包括治療或預(yù)防免疫介導(dǎo)的炎性疾病。
還有一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，包括治療或預(yù)防再狹窄。
還有另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于抑制上皮細(xì)胞的增殖(如作為化妝品制劑的一個(gè)成分)。
某些實(shí)施方案中，該組合物中的RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物內(nèi)。該超分子復(fù)合物任選包含至少一種聚合物，例如，含環(huán)糊精的聚合物?？蛇x地，該RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合，例如，由陽離子囊泡形成脂質(zhì)所形成的陽離子脂質(zhì)體。任選地，與RNAi構(gòu)建體復(fù)合的脂質(zhì)體具有典型地小于大約200nm的基本均一尺寸。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物為人類患者。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了一種抑制體內(nèi)不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括給予動(dòng)物足量的配制的RNAi構(gòu)建體，其中通過RNA干擾機(jī)制，RNAi構(gòu)建體減少了對(duì)細(xì)胞有絲分裂和/或阻止該細(xì)胞凋亡而言必不可少的靶基因的表達(dá)。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的RNAi構(gòu)建體是長(zhǎng)度優(yōu)選為19-30個(gè)堿基對(duì)的小的干擾RNA(siRNA)。可選的RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。例如，該表達(dá)載體選自附加型表達(dá)載體、整合表達(dá)載體、病毒表達(dá)載體。另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
某些實(shí)施方案中，組合物中的RNAi構(gòu)建體抑制細(xì)胞增殖?？蛇x的RNAi構(gòu)建體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
某個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶基因?yàn)橹掳┗?，如c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I、Abl-1、Bcl2、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、src或Bcr/Abl融合基因。某些實(shí)施方案中，細(xì)胞為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因RNAi構(gòu)建體被用于治療增生性細(xì)胞生長(zhǎng)，包括癌癥的治療。另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于抑制淋巴細(xì)胞的活化，包括治療或預(yù)防免疫介導(dǎo)的炎性疾病。還有一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，包括治療或預(yù)防再狹窄。還有另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被用于抑制上皮細(xì)胞的增殖(如作為化妝品制劑的一個(gè)成分)。
另一些實(shí)施方案中，該方法的RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物內(nèi)。該超分子復(fù)合物任意地包含至少一種聚合物，例如含環(huán)糊精的聚合物。
可選地，RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合，例如，由陽離子囊泡形成脂質(zhì)所形成的陽離子脂質(zhì)體。任意地，與RNAi構(gòu)建體復(fù)合的脂質(zhì)體具有典型地小于大約200nm的基本均一尺寸。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法中的動(dòng)物為人類。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，該RNAi構(gòu)建體被配制用于抑制不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)。該藥學(xué)可接受載體任選選自藥學(xué)可接受鹽、酯，及這些酯的鹽。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含該藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝，其中該藥物制劑包含至少一種RNAi構(gòu)建體，以及藥學(xué)可接受載體，其中該RNAi構(gòu)建體被配制用于抑制不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)。另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種RNAi構(gòu)建體的化妝品制劑，該RNAi構(gòu)建體被配制用于抑制不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，該方法包括給予體內(nèi)靶細(xì)胞雙鏈RNA，或可轉(zhuǎn)錄具有足夠長(zhǎng)度以激活靶細(xì)胞中PKR應(yīng)答的雙鏈RNA的表達(dá)載體，該雙鏈RNA被配制為超分子復(fù)合物的一部分。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，雙鏈RNA的長(zhǎng)度超過35個(gè)堿基對(duì)，還要更為優(yōu)選的是超過75、100、200或甚至400個(gè)堿基對(duì)。某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，超分子復(fù)合物是包括線性聚合物或支鏈聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成，如聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
某些實(shí)施方案中，超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成，包括具有下式的結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精改性的聚氮丙啶
其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了一種進(jìn)行藥品商業(yè)的方法，該方法包括a)鑒定抑制體內(nèi)靶細(xì)胞增殖，并減小涉及不希望的靶細(xì)胞增殖的疾病的影響的RNAi構(gòu)建體；b)進(jìn)行步驟a)中所鑒定的RNAi構(gòu)建體的效力及毒性的治療特征分析；及c)配制包含一種或多種經(jīng)步驟b)鑒定為具有可接受治療特征的RNAi構(gòu)建體的藥物制劑。
優(yōu)選地，進(jìn)行藥品商業(yè)的方法包括另一個(gè)步驟，即建立將該藥物制劑分裝以用于銷售的分裝系統(tǒng)，并(任選地)建立營銷該藥物制劑的銷售團(tuán)體的補(bǔ)充步驟。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了一種進(jìn)行藥品商業(yè)的方法，該方法包括a)鑒定抑制體內(nèi)靶細(xì)胞增殖，并減小涉及不希望的靶細(xì)胞增殖的疾病的影響的RNAi構(gòu)建體；b)(任選地)進(jìn)行步驟a)中所鑒定的RNAi構(gòu)建體的效力及毒性的治療特征分析；及c)將進(jìn)一步開發(fā)RNAi構(gòu)建體的權(quán)利授予第三方。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示將編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒和/或編碼siRNA寡核苷酸的有義鏈和反義鏈的質(zhì)粒送遞至HEK 293-EcR細(xì)胞內(nèi)。在0.5ml的opti-MEM中，使一(多)種質(zhì)粒以15N/P的比例與分支PEI25k-hi-CD聚合物復(fù)合，再將其送遞至細(xì)胞內(nèi)。相對(duì)GFP表達(dá)是采用所指示的一(多)種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后測(cè)定的。
圖2顯示β-CD聚合物4/DNA配比及血清條件對(duì)BHK-21細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效力(●和■)及細(xì)胞存活情況的影響。采用點(diǎn)線和實(shí)線分別顯示10％血清和無血清培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染結(jié)果。報(bào)告數(shù)據(jù)為三個(gè)樣品的平均+/-S.D.。
發(fā)明詳述I.概述本發(fā)明提供了減弱體內(nèi)靶基因表達(dá)的方法及組合物。通常，該方法包括給予RNAi構(gòu)建體(如靶定特定mRNA序列的小的干擾RNA(即siRNA)，或可于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的核酸物質(zhì))，給藥量足以通過RNA干擾機(jī)制，如以序列依賴性、PKR不依賴性方式減弱靶基因表達(dá)。特別是本發(fā)明方法可以被用于改變細(xì)胞生長(zhǎng)、存活或分化，從而達(dá)到治療和美容的目的。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及應(yīng)用RNAi構(gòu)建體減弱增殖調(diào)節(jié)基因(包括凋亡抑制基因)的表達(dá)。這種實(shí)施方案可作為治療或美容治療程序的一部分，可抑制或至少減少體內(nèi)不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于肺部給藥的RNAi構(gòu)建體，如可呼吸RNAi構(gòu)建體配方。這種配方可被用于局部或全身性送遞RNAi構(gòu)建體，并構(gòu)成將用于任意多種適應(yīng)癥，如不限于治療增生性疾病的RNAi構(gòu)建體給予患者的簡(jiǎn)便方法。僅舉例證明，本發(fā)明的某些RNAi組合物可被用于降低血管收縮劑的表達(dá)，或降低該血管收縮劑的受體水平，以降低全身性及肺動(dòng)脈高血壓患者的血壓。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面涉及采用RNAi構(gòu)建體，通過經(jīng)皮心包內(nèi)藥物送遞方式治療患者的方法，其中心包腔有效被用作RNAi構(gòu)建體的送遞貯存處。雖然該技術(shù)在RNAi構(gòu)建體的全身性送遞中有效，仍然可預(yù)期其對(duì)局部送遞至心臟及其周圍血管系統(tǒng)而言將尤其有效。
例如，在心肌梗塞的治療中，本發(fā)明提供了給予血管生成性RNAi構(gòu)建體的方法，以促進(jìn)血管產(chǎn)生，并從而促進(jìn)梗塞心肌內(nèi)及周圍組織的恢復(fù)和/或預(yù)防對(duì)其的進(jìn)一步損傷。例如，本發(fā)明方法可被用于送遞可抑制負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性得蛋白質(zhì)表達(dá)的RNAi構(gòu)建體，例如，通過抑制NF-κB阻抑物IκB的表達(dá)，或者負(fù)調(diào)節(jié)其它任何可減少體內(nèi)基底成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)血管產(chǎn)生的細(xì)胞因子的活性。RNAi介導(dǎo)減弱的其它目標(biāo)包括編碼C-反應(yīng)蛋白(CRP)的基因。CRP可抑制由基礎(chǔ)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激的血管生成。
心包內(nèi)藥物送遞也可被用于送遞RNAi構(gòu)建體，該RNAi構(gòu)建體減少平滑肌細(xì)胞的增殖和/或遷移，從而可用于治療新內(nèi)膜增生，如再狹窄，關(guān)節(jié)硬化等。僅舉例證明，新內(nèi)膜增生的抑制可通過給予RNAi構(gòu)建體而得以實(shí)現(xiàn)，所述RNAi構(gòu)建體減弱c-myb、c-myc、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、諸如核因子κB(NF-κB)和E2F的轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)。除了心包內(nèi)藥物送遞以減少新內(nèi)膜增生以外，本發(fā)明也具體考慮了“于支架上”的RNAi構(gòu)建體送遞，或通過將RNAi構(gòu)建體直接涂布至少一部分的支架，或借助于可釋放該RNAi構(gòu)建體的聚合物涂層，而實(shí)現(xiàn)送遞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及涂布的醫(yī)用裝置。例如，某些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法提供了至少一個(gè)表面附有涂層的醫(yī)用裝置，其中該涂層包括本發(fā)明的聚合物基質(zhì)和RNAi構(gòu)建體。這種涂層可應(yīng)用在外科手術(shù)器械上，如螺釘、板片、墊圈、縫合線、假體錨定裝置、平頭釘、卡釘、電導(dǎo)聯(lián)、瓣膜、膜。該裝置可以是導(dǎo)管、可植入血管通路端口、儲(chǔ)血袋、輸血管、中央靜脈導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管、血管植入物、主動(dòng)脈內(nèi)球囊泵、心臟瓣膜、心血管縫合線、人造心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析組件、血液灌注組件、血漿去除組件，及適于血管內(nèi)展開的濾器。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面提供了適合電穿孔進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞的RNAi構(gòu)建體的組合物，如電穿孔至上皮組織內(nèi)(皮膚、黏膜等)以及肌肉內(nèi)(平滑肌或骨骼肌)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物內(nèi)，并適合作為藥劑使用，如基本上無熱源物質(zhì)。例如，該超分子復(fù)合物可由包含線性聚乙烯亞胺或含環(huán)糊精線性聚合物，以及支鏈聚乙烯亞胺或支鏈環(huán)糊精聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，將該表達(dá)構(gòu)建體與環(huán)糊精，如環(huán)糊精細(xì)胞送遞體系配制在一起。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面涉及利用長(zhǎng)雙鏈RNA激活某些細(xì)胞內(nèi)非序列依賴性dsRNA的應(yīng)答，如激活ds-RNA依賴性蛋白質(zhì)激酶PKR。PKR介導(dǎo)的對(duì)長(zhǎng)dsRNA(如長(zhǎng)度超過35個(gè)堿基對(duì)，還要更為優(yōu)選的是超過39、50、75、100或者甚至200個(gè)堿基對(duì)的dsRNA)的應(yīng)答是一種主要于病毒感染細(xì)胞內(nèi)被激活，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的有效生長(zhǎng)抑制蛋白。此處所描述用于實(shí)現(xiàn)序列依賴RNA干擾的組合物可方便地被調(diào)整用于將長(zhǎng)dsRNA(如長(zhǎng)度足以激活PKR，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的dsRNA分子，如長(zhǎng)度在40-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選的100-800個(gè)堿基對(duì)，還要更為優(yōu)選的200-500個(gè)堿基對(duì)的范圍內(nèi))送遞至希望發(fā)生細(xì)胞死亡的細(xì)胞內(nèi)。一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的長(zhǎng)dsRNA配方可被用于殺死癌癥細(xì)胞。
II.定義為方便起見，下文集中了本說明書、實(shí)施例及所附權(quán)利要求中應(yīng)用到的特定術(shù)語。
此處所用術(shù)語“動(dòng)物”指哺乳動(dòng)物，優(yōu)選的哺乳動(dòng)物如人類。同樣，有待于本發(fā)明方法治療的“患者”或“受試者”可以指人類或非人類的動(dòng)物。
術(shù)語“凋亡”或“程序性細(xì)胞死亡”指不希望或無用的細(xì)胞于發(fā)育及其它正常生物學(xué)過程期間被清除的生理學(xué)過程。凋亡是于正常生理學(xué)條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡模式，且該細(xì)胞為其自身死亡(“細(xì)胞自殺”)的積極參與者。該現(xiàn)象最為常見于正常細(xì)胞更新及組織平衡、胚胎形成、免疫耐受性的誘導(dǎo)及維持、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及內(nèi)分泌依賴性組織萎縮期間。正在凋亡的細(xì)胞顯示出特有的形態(tài)及生化特征。這些特征包括染色質(zhì)聚集、核與細(xì)胞質(zhì)凝聚、細(xì)胞質(zhì)與核分配到包含核糖體、形態(tài)完整的線粒體及核物質(zhì)的膜包圍得囊泡(凋亡體)中。在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞或相鄰的上皮細(xì)胞可迅速識(shí)別并吞噬這些凋亡體。這種清除體內(nèi)凋亡細(xì)胞的有效機(jī)制的存在避免了引發(fā)炎癥反應(yīng)。在體外，凋亡體及殘留細(xì)胞碎片最終膨脹并裂解。體外細(xì)胞死亡的末期被冠以術(shù)語“次級(jí)壞死”。
“細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”在此處是可互換使用的術(shù)語。應(yīng)當(dāng)理解這些術(shù)語不僅指特定受檢細(xì)胞，還指這些細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境影響，某些修飾可能在后續(xù)的世代中出現(xiàn)，這種后代實(shí)際上可能與其母細(xì)胞不完全一致，但仍然被包括在此處所用該術(shù)語的范疇內(nèi)。
“疾病相關(guān)的”或“引發(fā)疾病的”基因指對(duì)不希望的細(xì)胞表型而言，其表達(dá)必不可少或起重要作用的任何基因。該基因可能是以異常高水平表達(dá)的基因；可能是以異常低水平表達(dá)的基因，其中改變的表達(dá)與疾病的發(fā)生和/或進(jìn)行有關(guān)。疾病相關(guān)基因也指具有一(多)種突變或遺傳變異的基因，這些突變或遺傳變異或者是疾病病因的直接原因，或者與造成疾病病因的基因處于連鎖不平衡狀態(tài)中。其轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物可能是已知或未知的，且可能處于正?；虍惓Ｋ健?br> 此處所用術(shù)語“dsRNA”指siRNA分子，或其它具有雙鏈特征，并且可于細(xì)胞內(nèi)被加工為siRNA的RNA分子，如發(fā)夾RNA部分。
另外，如果上下文未指明，術(shù)語“編碼”將指包括編碼多肽的DNA序列，該術(shù)語被典型應(yīng)用時(shí)，也包括被轉(zhuǎn)錄為抑制性反義分子的DNA序列。
對(duì)于基因序列而言的術(shù)語“表達(dá)”指該基因的轉(zhuǎn)錄，以及從得到的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物到蛋白質(zhì)的適當(dāng)翻譯。因此，從上下文中應(yīng)當(dāng)清楚的是編碼序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)是該編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果。
細(xì)胞的“生長(zhǎng)狀態(tài)”指該細(xì)胞的增殖速率及分化狀態(tài)。
此處所用“無限增殖化細(xì)胞”指已經(jīng)由化學(xué)、遺傳和/或重組方式被改變的細(xì)胞，該細(xì)胞因而具有在培養(yǎng)經(jīng)過無限的分裂次數(shù)后仍能夠生長(zhǎng)的能力。
“基因表達(dá)的抑制”指源自靶基因的蛋白質(zhì)和/或mRNA產(chǎn)物水平上的缺乏(或可觀察到的減少)?！疤禺愋浴敝敢种瓢谢虻耐瑫r(shí)對(duì)該細(xì)胞其它基因無明顯影響的能力。抑制結(jié)果可通過檢驗(yàn)該細(xì)胞或生物體的外在屬性或(如下文實(shí)施例所介紹)或通過諸如RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、微陣列基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、放射免疫實(shí)驗(yàn)(RIA)、其它免疫實(shí)驗(yàn)及熒光激活細(xì)胞分析(FACS)的生化技術(shù)得以證實(shí)。
術(shù)語“功能喪失”，當(dāng)涉及本發(fā)明RNAi方法所抑制的基因時(shí)，該術(shù)語指與缺乏RNAi構(gòu)建體時(shí)的基因表達(dá)水平相比，基因表達(dá)水平上的減少。
此處所用短語“介導(dǎo)RNAi”指(表明)判別哪些RNA可以被該RNAi方法降解的能力，如以序列特異方式，而不是通過非序列依賴的dsRNA應(yīng)答，如PKR應(yīng)答所發(fā)生的降解。
術(shù)語“鼻部送遞”指通過經(jīng)由鼻部吸入并進(jìn)入鼻內(nèi)的方式將RNAi構(gòu)建體全身性地送遞至患者體內(nèi)。
此處所用術(shù)語“核酸”指諸如脫氧核糖核酸(DNA)，適當(dāng)時(shí)也指核糖核酸(RNA)的多核苷酸。當(dāng)適用于所描述的實(shí)施方案時(shí)，該術(shù)語也應(yīng)當(dāng)被理解為包括單鏈(如有義或反義)和雙鏈多核苷酸。
當(dāng)描述兩個(gè)DNA區(qū)域之間的關(guān)系時(shí)，“可操作地連接”指它們功能上彼此相關(guān)。例如，啟動(dòng)子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列如果可以控制某個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，便可以被可操作地連接到該編碼序列上。
術(shù)語“藥學(xué)可接受鹽”指本發(fā)明的化合物中生理學(xué)及藥學(xué)可接受的鹽類，即保留了期望的母體化合物生物學(xué)活性，而未獲得不希望的毒理效果的鹽。
此處所用“增殖的”和“增殖”指進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞。
“蛋白質(zhì)編碼序列”或“編碼”特定多肽或肽的序列指當(dāng)處于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列控制之下時(shí)，于體外或體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄(DNA情況下)和翻譯(mRNA情況下)為多肽的核酸序列。該編碼序列的邊界由位于5’(氨基)末端的起始密碼子及位于3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子界定。編碼序列可以包括，但不限于，原核或真核mRNA來源的cDNA、原核或真核DNA來源的基因組DNA序列，甚至是合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列將通常被定位于該編碼序列的3’末端。
術(shù)語“肺部送遞”和“呼吸送遞”指通過經(jīng)由嘴部吸入并進(jìn)入肺部的方式將RNAi構(gòu)建體全身性送遞至患者體內(nèi)。
“重組病毒”指已經(jīng)過遺傳改造的病毒，如通過將異源核酸構(gòu)建體添加或插入該病毒粒子中的方式。
此處所用術(shù)語“RNAi構(gòu)建體”是貫穿本說明書所采用的一個(gè)通稱，該術(shù)語包括小的干擾RNA(siRNA)、發(fā)夾RNA，及其它可于體內(nèi)被裂解并形成siRNA的RNA種類。此處的RNAi構(gòu)建體也包括具有如下功能的表達(dá)載體(也被稱為RNAi表達(dá)載體)，即引發(fā)可于細(xì)胞內(nèi)形成dsRNA或發(fā)夾RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，和/或引發(fā)可于體內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
“RNAi表達(dá)載體”(此處也被稱為“dsRNA編碼質(zhì)?！?指被用于表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)RNA的可復(fù)制核酸構(gòu)建體，其中該RNA可于表達(dá)該構(gòu)建體的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA部分。這種載體包括的轉(zhuǎn)錄單位包含如下三種物質(zhì)的集合，(1)在基因表達(dá)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一(多)種遺傳元件，例如啟動(dòng)子、操縱子或增強(qiáng)子，這些遺傳元件被可操作地連接到(2)被轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生雙鏈RNA(于細(xì)胞內(nèi)退火并形成siRNA的兩個(gè)RNA部分，或可被加工成siRNA的單個(gè)發(fā)夾RNA)的“編碼”序列，及(3)合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。啟動(dòng)子及其它調(diào)節(jié)元件的選擇通常根據(jù)所計(jì)劃的宿主細(xì)胞的不同而變化。通常，重組DNA技術(shù)利用的表達(dá)載體常常為“質(zhì)粒”形式，即指圓形雙鏈DNA環(huán)，以該載體形式存在的表達(dá)載體不與染色體結(jié)合。本說明書中，當(dāng)質(zhì)粒為載體最常用的形式時(shí)，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用。不過，本發(fā)明計(jì)劃包括可發(fā)揮相當(dāng)功能并隨后被本領(lǐng)域所知的其它形式的表達(dá)載體。
該表達(dá)載體中，控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件通?？梢詠碓醋圆溉閯?dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因。并且可以另外摻入通常由復(fù)制起點(diǎn)所賦予的宿主內(nèi)復(fù)制能力，以及有助于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。也可應(yīng)用來源自諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等病毒的載體。
術(shù)語“小的干擾RNA”或“siRNA”指長(zhǎng)度大約為19-30個(gè)核苷酸，更為優(yōu)選21-23個(gè)核苷酸的核酸。該siRNA為雙鏈，并且可能在每一末端包括短突出端。優(yōu)選地，位于3’末端的突出端長(zhǎng)度為1-6個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域已知該siRNA可以被化學(xué)合成，或來源自更長(zhǎng)的雙鏈RNA或發(fā)夾RNA。該siRNA具有與靶RNA類似的重要序列，因此該siRNA可與靶RNA配對(duì)，并通過RNA干擾機(jī)制導(dǎo)致該靶RNA的序列特異性降解。任選地，該siRNA分子包括3’羥基。
術(shù)語“超分子復(fù)合物”指由至少一種聚合物形成的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該聚合物分子可以是線性或分支的，例如聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β-環(huán)糊精聚合物(βCD-聚合物)及其的共聚物。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及被配制為超分子復(fù)合物的RNAi構(gòu)建體。
“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”是貫穿本說明書用來指DNA序列的通稱，如可誘導(dǎo)或控制特定編碼序列轉(zhuǎn)錄的起始信號(hào)、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等，其中該編碼序列與該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是可操作連接的。
此處所用術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“轉(zhuǎn)染”是被普遍接受的技術(shù)，意指通過核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將核酸，如一種表達(dá)載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。此處所用的“轉(zhuǎn)化”指由于外源DNA或RNA的細(xì)胞攝取導(dǎo)致細(xì)胞基因型改變的一個(gè)過程，例如，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)RNAi構(gòu)建體。當(dāng)一種核酸構(gòu)建體可被細(xì)胞的子代繼承時(shí)，則該細(xì)胞已被該核酸構(gòu)建體“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染”了。
此處所用“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”指自然轉(zhuǎn)變?yōu)闊o限制生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，即它們?cè)谂囵B(yǎng)中獲得了經(jīng)過無限分裂次數(shù)仍然生長(zhǎng)的能力。根據(jù)生長(zhǎng)控制的喪失程度，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可由諸如瘤的、未分化的和/或增生性的術(shù)語表征。對(duì)本發(fā)明目的而言，術(shù)語“惡性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化表型”和“轉(zhuǎn)化表型”可以包括但不限于，下列與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的表型特性中的任意一種無限增殖化、形態(tài)學(xué)或生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化、致腫瘤性，正如所檢測(cè)到的在細(xì)胞培養(yǎng)中的生長(zhǎng)延長(zhǎng)，可于半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，或者在免疫缺陷或同基因動(dòng)物體內(nèi)中的致腫瘤生長(zhǎng)。
“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染”指外源DNA未整合至已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組內(nèi)的情況，如當(dāng)附加型DNA被轉(zhuǎn)錄為mRNA，并被翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)。
此處所用術(shù)語“載體”指一種核酸分子，該核酸分子可將另一個(gè)核酸轉(zhuǎn)移至其已連接的部分。一種類型的載體為基因組整合載體，或“整合載體”，該類型載體可以被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)。另一種類型的載體為附加型載體，即可于染色體外復(fù)制的核酸。可將基因表達(dá)引導(dǎo)到操作性地連接的載體在此處被稱為“表達(dá)載體”。本說明書中，如上下文無另外指明，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用。
III.典型RNAi構(gòu)建體該RNAi構(gòu)建體含有可于細(xì)胞生理?xiàng)l件下，與待抑制基因(即“靶”基因)至少一部分的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該雙鏈RNA僅需與已具有介導(dǎo)RNAi能力的天然RNA充分相似即可。因此，本發(fā)明具有能夠耐受可能由于遺傳突變、菌株多態(tài)性或進(jìn)化趨異而被預(yù)期到的序列變異的優(yōu)勢(shì)。靶序列與該RNAi構(gòu)建體序列之間容許的核苷酸錯(cuò)配數(shù)目為5個(gè)堿基對(duì)中不超過一個(gè)，或10個(gè)堿基對(duì)中不超過一個(gè)，或20個(gè)堿基對(duì)中不超過一個(gè)，或50個(gè)堿基對(duì)中不超過一個(gè)。SiRNA雙鏈體中心的錯(cuò)配最為關(guān)鍵，并且可能基本破壞靶RNA的裂解。與之相比，位于與靶RNA互補(bǔ)的siRNA鏈的3’末端的核苷酸對(duì)靶識(shí)別的特異性而言并無顯著作用。
通過本領(lǐng)域已知的序列比較和比對(duì)算法(見Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，及其所引用的參考文獻(xiàn))，并通過，例如采用默認(rèn)參數(shù)的BESTFIT軟件程序?qū)崿F(xiàn)的Smith-Waterman算法(如University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)，計(jì)算核苷酸序列之間的百分比差異，便可最優(yōu)化序列同一性。抑制性RNA和部分靶基因之間的序列同一性超過90％，或者甚至100％是優(yōu)選的?？蛇x地，該RNA的雙鏈體區(qū)域可能在功能上被定義為可與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一部分雜交的核苷酸序列(如400mM NaCl、40mMPIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃雜交12-16小時(shí)；繼而洗滌)。
通過化學(xué)合成方法或重組核酸技術(shù)可以進(jìn)行RNAi構(gòu)建體的產(chǎn)生。所處理細(xì)胞的內(nèi)源RNA聚合酶可以介導(dǎo)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，或者克隆的RNA聚合酶可被用于體外轉(zhuǎn)錄。該RNAi構(gòu)建體可以包括對(duì)磷酸-糖主鏈或核苷的修飾，如，降低對(duì)細(xì)胞核酸酶的感受性，改善生物利用率、配方特性，和/或改變其它藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。例如，天然RNA的磷酸二酯鍵可以被修飾為包括至少一個(gè)氮或硫的雜原子。RNA結(jié)構(gòu)上的修飾可以被修整為允許特異性的遺傳抑制，而同時(shí)避免對(duì)dsRNA的一般應(yīng)答。另外，可以對(duì)堿基進(jìn)行修飾以阻斷腺苷脫氨酶的活性。該RNAi構(gòu)建體可通過酶促或通過部分/總有機(jī)合成獲得，通過體外酶促或有機(jī)合成的方法可以導(dǎo)入任何修飾的核糖核苷酸。
化學(xué)修飾RNA分子的方法也可以適用于修飾RNAi構(gòu)建體(見例如，Heidenreich et al.(1997)Nucleic Acids Res.25776-780；Wilsonet al.(1994)J Mol Recog789-98；Chen et al.(1995)Nucleic AcidsRes232661-2668；Hirschbein et al.(1997)Antisense Nucleic AcidDrug Dev755-61)。僅舉例說明，可以采用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合膦酸甲酯-磷酸二酯、肽核酸、含寡聚物或糖修飾(如2’-替代的核糖核苷，a-構(gòu)型)的5-丙炔基-嘧啶修飾RNAi構(gòu)建體的主鏈。
該雙鏈結(jié)構(gòu)可通過單條自身互補(bǔ)RNA鏈或兩條互補(bǔ)RNA鏈形成。RNA雙鏈體的形成可于細(xì)胞內(nèi)或外啟動(dòng)?？梢员粚?dǎo)入的RNA量應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)每個(gè)細(xì)胞至少送遞一個(gè)拷貝。雙鏈物質(zhì)的較高劑量(如每個(gè)細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個(gè)拷貝)可以產(chǎn)生更為有效的抑制，而較低劑量也可能對(duì)某些特定應(yīng)用有效。抑制為序列特異，因?yàn)榕c該RNA雙鏈體區(qū)域相應(yīng)的核苷酸序列被靶定用于遺傳抑制。
某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體為“小的干擾RNA”或者“siRNA”。這些核酸的長(zhǎng)度大約為19-30個(gè)核苷酸，還要更為優(yōu)選的長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸，如在長(zhǎng)度上與通過核酸酶“切割”較長(zhǎng)雙鏈RNA所獲得的片段對(duì)應(yīng)。該siRNA被認(rèn)為補(bǔ)充了核酸酶復(fù)合物，并通過與特定序列配對(duì)，將該復(fù)合物引導(dǎo)至靶mRNA。結(jié)果是，該靶mRNA被蛋白質(zhì)復(fù)合物中的核酸酶降解。一種特定實(shí)施方案中，長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸的siRNA分子包含3’羥基。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)均可獲得本發(fā)明的siRNA分子。例如，利用本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生siRNA。例如，可以合成短的有義和反義RNA寡聚物，并將其退火以形成每一末端均具有2-核苷突出端的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)(Caplen，et al.(2001)Proc NatlAcad Sci USA，989742-9747；Elbashir，et al.(2001)EMBOJ，206877-88)。隨后，如下所述，或者通過被動(dòng)攝取，或者選定的送遞體系，便可將這些雙鏈siRNA結(jié)構(gòu)直接導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。
某些實(shí)施方案中，可通過加工較長(zhǎng)雙鏈RNA獲得siRNA構(gòu)建體，例如，在dicer酶存在的情況中。一種實(shí)施方案中，采用的是果蠅體外系統(tǒng)。該實(shí)施方案中，dsRNA與果蠅胚胎來源的可溶性提取物混合，產(chǎn)生了一種聯(lián)合體系。該聯(lián)合體系被維持在dsRNA可以被加工成長(zhǎng)度為大約21到大約23個(gè)核苷酸的RNA分子的條件下。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)均可純化該siRNA分子。例如，利用凝膠電泳純化siRNA?？蛇x地，可利用非變性方法，如非變性柱層析純化該siRNA。另外，可以利用色譜法(如大小排阻色譜法)、甘油梯度離心、采用抗體的親和純化的方法純化siRNA。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該siRNA分子的至少一條鏈具有一個(gè)3’突出端，其長(zhǎng)度為大約1到大約6個(gè)核苷酸，不過也可以是2-4個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。更為優(yōu)選的3’突出端長(zhǎng)度為1-3個(gè)核苷酸。某些實(shí)施方案中，一條鏈具有一個(gè)3’突出端，另一條鏈則被鈍端化，或者也具有一個(gè)突出端。每條鏈的突出端長(zhǎng)度可以相同或不同。為進(jìn)一步增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性，可對(duì)該3’突出端進(jìn)行抗降解穩(wěn)定化。一種實(shí)施方案中，通過包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鳥嘌呤核苷酸以穩(wěn)定RNA。可選地，由修飾的類似物替代嘧啶核苷酸，如可由2’-脫氧胸腺嘧啶核苷替代尿嘧啶核苷酸3’突出端，且不影響RNAi的效力。2’羥基的缺乏顯著增強(qiáng)了組織培養(yǎng)基中突出端的核酸酶抗性，并且可能在體內(nèi)是有利的。
另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體的形式為長(zhǎng)雙鏈RNA。某些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體至少包含25、50、100、200、300或400個(gè)堿基。某些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體長(zhǎng)度為400-800個(gè)堿基。該雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被消化，如在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA序列。不過，體內(nèi)利用長(zhǎng)雙鏈RNA并不總是有效，可能是因?yàn)榉切蛄幸蕾囆缘膁sRNA應(yīng)答所引起的毒性效應(yīng)。這些實(shí)施方案中，利用局部送遞體系和/或可減少干擾素或PKR效應(yīng)的藥劑是優(yōu)選的。
某些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體的形式為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(被命名為發(fā)夾RNA)。該發(fā)夾RNA可以是外源合成的，或體內(nèi)RNA聚合酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄形成。在例如Paddison et al..，Genes Dev，2002，16948-58；McCaffrey et al.，Nature，2002，41838-9；McManus et al.，RNA，2002，8842-50；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2002，996047-52的文獻(xiàn)中描述了制備并將這種發(fā)夾RNA應(yīng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因沉默的實(shí)例。優(yōu)選的，這種發(fā)夾RNA被工程設(shè)計(jì)在細(xì)胞中或動(dòng)物體內(nèi)，以確保對(duì)靶基因連續(xù)且穩(wěn)定的抑制。本領(lǐng)域已知于細(xì)胞內(nèi)加工發(fā)夾RNA可以產(chǎn)生siRNA。
還有另一些實(shí)施方案中，采用質(zhì)粒送遞雙鏈RNA，如作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雙鏈RNA。這些實(shí)施方案中，質(zhì)粒被設(shè)計(jì)為包括分別對(duì)應(yīng)于該RNAi構(gòu)建體的有義和反義鏈的兩個(gè)“編碼序列”。這兩個(gè)編碼序列可以是相同的序列，如，由兩個(gè)倒置的啟動(dòng)子位于其側(cè)翼，或者可以是分別處于兩個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下的兩個(gè)獨(dú)立序列。該編碼序列被轉(zhuǎn)錄后，互補(bǔ)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物堿基配對(duì)便形成了雙鏈RNA。
PCT申請(qǐng)WO01/77350描述了一種用于雙向轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因，以于真核細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生相同轉(zhuǎn)基因的有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的典型載體。相應(yīng)地，某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述獨(dú)特特征的重組載體包含病毒復(fù)制子，該復(fù)制子內(nèi)的兩個(gè)相反方向上排列有兩個(gè)重疊轉(zhuǎn)錄單位，并且位于一個(gè)轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼，該轉(zhuǎn)基因被用于我們感興趣的RNAi構(gòu)建體，其中這兩個(gè)重疊轉(zhuǎn)錄單位可以在宿主細(xì)胞內(nèi)的從相同轉(zhuǎn)基因片段產(chǎn)生有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
IV.典型配方本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體也可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物，例如脂質(zhì)體、聚合物、受體靶定的分子、口服、直腸、局部或其它配方混合、封裝、結(jié)合或經(jīng)由其它方式締合，以輔助攝取、分配和/或吸收。本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體可以被提供在也包括穿透增強(qiáng)劑、載體化合物和/或轉(zhuǎn)染劑的配方中。
講述了制備可適用于送遞RNAi構(gòu)建體，尤其是siRNA分子的攝取、分配和/或吸收輔助配方的方法的代表性美國專利包括，但不僅限于，U.S.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756。
本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體也包括任何藥學(xué)可接受鹽、酯或這些酯的鹽，或者其它任何在對(duì)包括人類在內(nèi)動(dòng)物給藥的基礎(chǔ)上，可以(直接或間接地)提供其生物學(xué)活性代謝物或殘余物的化合物。相應(yīng)地，例如，該公開內(nèi)容也涉及RNAi構(gòu)建體和siRNA的藥學(xué)可接受鹽、這種RNAi構(gòu)建體的藥學(xué)可接受鹽，以及其它生物等效物。
藥學(xué)可接受堿加成鹽由金屬或胺形成，如堿和堿土金屬或有機(jī)胺。被用作陽離子的金屬實(shí)例為鈉、鉀、鎂、鈣等。合適的胺實(shí)例為N，NI-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺及普魯卡因(見例如Berge et al.，“PharmaceuticalSalts，”J.of Pharma Sci.，1977，66，1-19)。酸性化合物的堿加成鹽是通過常規(guī)方式，使游離形式的酸與足量指定的堿接觸后產(chǎn)生鹽，而得以制備的。游離酸可通過使鹽與酸接觸，并以常規(guī)方式分離該游離酸后得以再生。該游離酸與其相應(yīng)的鹽在某些物理屬性，諸如在極性溶劑中的溶解度方面略有差異，但另一方面，對(duì)本發(fā)明的目的而言，該鹽與其相應(yīng)的游離酸等效。此處所用“藥物加成鹽”包括本發(fā)明組合物中任一組分酸形式的藥學(xué)可接受鹽。這包括胺的有機(jī)或無機(jī)酸鹽。優(yōu)選的酸鹽為鹽酸鹽、醋酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員還熟知其它合適的藥學(xué)可接受鹽，包括多種無機(jī)和有機(jī)酸的堿性鹽。
對(duì)siRNA寡核苷酸而言，藥學(xué)可接受鹽的優(yōu)選實(shí)例包括，但不僅限于(a)由諸如鈉、鉀、銨、鎂、鈣的陽離子，諸如精胺和亞精胺的多胺，等形成的鹽；(b)由例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等的無機(jī)酸形成的酸加成鹽；(c)由諸如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、棕櫚酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等的有機(jī)酸形成的鹽；(d)由諸如氯、溴和碘的元素陰離子形成的鹽。
A.超分子復(fù)合物某些實(shí)施方案中，本發(fā)明RNAi構(gòu)建體被配制為“超分子復(fù)合物”的一部分。進(jìn)一步舉例證明，該RNAi構(gòu)建體可與至少一種聚合物接觸，形成一種合成物，隨后，在足以形成包含該RNAi構(gòu)建體和多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子復(fù)合物的條件下處理該合成物的聚合物。該聚合物分子可以是線性或分支的。相應(yīng)地，一組兩個(gè)或多個(gè)聚合物分子可以是線性、分支或者線性和分支聚合物的混合物。該合成物可通過本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法制備。例如，通過使該RNAi構(gòu)建體與聚合物簡(jiǎn)單接觸、混合或分散，便可形成該合成物。也可通過使可能相同或不同，且能夠在該表達(dá)構(gòu)建體的存在條件下形成線性或分支聚合物的單體聚合，而制備該合成物。可采用至少一種配體進(jìn)一步修飾該合成物，如可以引導(dǎo)該表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞攝取，或者相反，影響該表達(dá)構(gòu)建體在體內(nèi)的組織或細(xì)胞分配。該合成物可以是任意合適的形式，優(yōu)選的形式為粒子。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明RNAi構(gòu)建體與陽離子聚合物被配制在一起。典型陽離子聚合物包括聚(L)賴氨酸(PLL)和聚氮丙啶(PEI)。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體與含β-環(huán)糊精聚合物(βCD聚合物)被配制在一起。βCD-聚合物能夠與核酸一起形成多聚復(fù)合物，并轉(zhuǎn)染所培養(yǎng)的細(xì)胞。該βCD聚合物可以例如通過使二氨基-環(huán)糊精單體A與二酰亞胺酯共聚單體B縮合而被合成。環(huán)糊精是α-(1，4)鍵中含天然存在的D(+)-吡喃葡糖單位的環(huán)狀多糖。最常見的環(huán)糊精為分別含有6、7或8個(gè)吡喃葡糖單位的α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ環(huán)糊精。在例如Gonzalez等人的PCT申請(qǐng)WO00/01734和Dayis PCT申請(qǐng)WO00/33885中描述了可方便地被調(diào)整用于送遞本發(fā)明RNAi構(gòu)建體的典型環(huán)糊精送遞體系。
某些實(shí)施方案中，該超分子復(fù)合物被聚集在粒子中，例如，平均直徑為20-500納米(nm)，還要更為優(yōu)選的是20-200nm的粒子配方。
B.其它陽離子、非脂質(zhì)配方某些實(shí)施方案中，該RNAi構(gòu)建體被提供在陽離子、非脂質(zhì)載體中，并且被配制應(yīng)用在經(jīng)由呼吸道的氣溶膠送遞中。采用聚(乙烯亞胺)和諸如dsRNA和dsRNA-編碼質(zhì)粒的大分子的配方可以在霧化過程中導(dǎo)致高水平的肺部轉(zhuǎn)染并提高穩(wěn)定性。PEI-核酸配方也可以顯示出對(duì)肺部的高程度特異性。
除了采用PEI配制RNAi構(gòu)建體以外，本發(fā)明也設(shè)想應(yīng)用環(huán)糊精改性的聚合物，諸如環(huán)糊精改性的聚氮丙啶。某些實(shí)施方案中，該聚合物具有如下結(jié)構(gòu)式 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
某些實(shí)施方案中，對(duì)至少大約1％，更為優(yōu)選的至少大約2％，或者至少大約3％，直至大約5％或甚至10％可能為伯胺的氮原子而言，R代表的是環(huán)糊精部分(即R代表H的兩種情況)，而對(duì)環(huán)糊精部分而言，則并非如此。
某些實(shí)施方案中，按重量計(jì)算，環(huán)糊精部分組成了環(huán)糊精改性的聚合物的至少大約2％、3％或4％，直至5％、7％，甚至10％。
某些實(shí)施方案中，按重量計(jì)算，聚合物中至少大約2％、3％或4％，直至5％、7％，甚至10％的氮丙啶亞單位是由環(huán)糊精部分修飾的。
具有易與環(huán)糊精部分發(fā)生衍生作用的親核氨基取代基團(tuán)的聚氮丙啶共聚物也可以被用于制備本發(fā)明范疇內(nèi)的環(huán)糊精改性的聚合物。
典型環(huán)糊精部分包括主要由7-9個(gè)糖部分組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如環(huán)糊精和氧化環(huán)糊精。環(huán)糊精部分任選包含在環(huán)狀結(jié)構(gòu)和聚合物主鏈之間形成共價(jià)鍵的連接部分，優(yōu)選的鏈中含1-20個(gè)原子，如烷基鏈，包括二羧酸衍生物(如戊二酸衍生物、琥珀酸衍生物等)，和異烷基鏈，如寡乙二醇鏈。
C.脂質(zhì)體配方某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含被封裝于脂質(zhì)體或以其它方式與脂質(zhì)體締合的dsRNA或dsRNA-編碼質(zhì)粒的組合物。僅舉例證明，可利用聚陽離子縮合劑縮合dsRNA部分或dsRNA-編碼質(zhì)粒，并將其懸浮于低離子強(qiáng)度的水性培養(yǎng)基中，陽離子囊泡形成脂質(zhì)便形成了陽離子脂質(zhì)體?？烧{(diào)整脂質(zhì)體脂質(zhì)與質(zhì)粒的比例以獲得最大轉(zhuǎn)染效果。納摩爾脂質(zhì)體脂質(zhì)/微克質(zhì)粒的比例常常超過5，但小于25，優(yōu)選的超過8，但小于18，更為優(yōu)選的超過10，但小于15，最為優(yōu)選的12-14。這種復(fù)合物優(yōu)選地具有典型地小于大約200nm，并優(yōu)選地在50-200nm范圍內(nèi)的基本均一的尺寸(即在尺寸上±20％，優(yōu)選的±10％，更為優(yōu)選的±5％)。
此處所用的脂質(zhì)體指具有外部脂質(zhì)殼且封閉有親水性內(nèi)部的脂質(zhì)囊泡，該外部脂質(zhì)殼典型地形成于一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)雙層上。一種優(yōu)選實(shí)施方案中，該脂質(zhì)體是由介于大約20-80摩爾百分?jǐn)?shù)的陽離子囊泡形成脂質(zhì)，與其余成中性囊泡形成脂質(zhì)，和/或其它組分所組成的陽離子脂質(zhì)體。此處所用“囊泡形成脂質(zhì)”指任何具有疏水和極性頭基團(tuán)部分的兩性脂質(zhì)，如磷脂所例證的，其自身在水中可自動(dòng)形成雙層囊泡。優(yōu)選的囊泡形成脂質(zhì)為二?；溨|(zhì)，如磷脂，其酰基鏈長(zhǎng)度典型地為大約14-22個(gè)碳原子，且具有可變的不飽和度。
陽離子囊泡形成脂質(zhì)是在操作pH，如pH4-9條件下，極性頭基團(tuán)具有凈正電荷的脂質(zhì)。典型實(shí)例包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺，其極性頭基團(tuán)是由帶正電部分，作為例證如賴氨酸衍生的，例如由L-賴氨酸衍生的脂質(zhì)DOPE(LYS-DOPE)(Guo，et al.，1993)。該類脂質(zhì)也包括糖脂，如具有陽離子極性頭基團(tuán)的腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。
可應(yīng)用的另一種陽離子囊泡形成脂質(zhì)是膽甾醇胺及相關(guān)的陽離子甾醇。典型陽離子脂質(zhì)包括1，2-二油基氧基-3-(三甲氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2，3-雙十四烷氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)；N-[1-(2，3，-二油基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DORIE)；N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)；3β[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨甲?；鵠膽甾醇(DC-Chol)；和二甲基雙十八烷基銨(DDAB)。
該脂質(zhì)體的其余部分由中性囊泡形成脂質(zhì)形成，意指囊泡形成脂質(zhì)無凈電荷，或者可能包括小比例的在極性頭基團(tuán)中具有負(fù)電荷的脂質(zhì)。該類脂質(zhì)還包括磷脂，諸如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰環(huán)己六醇(PI)、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、膽甾醇、膽甾醇衍生物及其它無電荷甾醇。
上述脂質(zhì)是商業(yè)可提供的，或根據(jù)已公開方法制備而得。本發(fā)明包括的其它脂質(zhì)為糖脂，如腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，dsRNA或dsRNA-編碼質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物包括具有以親水聚合物鏈為表面涂層的脂質(zhì)體，該涂層可有效延長(zhǎng)該質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物的血液循環(huán)時(shí)間。合適的親水聚合物包括環(huán)糊精(CD)、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺，及衍生的纖維素，如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。優(yōu)選的親水聚合物鏈為聚乙二醇(PEG)，優(yōu)選的PEG鏈分子量為500-10,000道爾頓，更優(yōu)選為1,000-5,000道爾頓。該親水聚合物可能在水和非水性溶劑，如氯仿中均具有可溶性。
該涂層優(yōu)選地通過下述方法制備，即將磷脂或其它二?；溨|(zhì)包含在囊泡形成脂質(zhì)內(nèi)，并采用該聚合物鏈將其頭部基團(tuán)衍生。制備這種脂質(zhì)，并由其形成聚合物涂布脂質(zhì)體的典型方法在U.S.Pat.Nos.5,013,556和5,395,619中有所描述，在此引入作為參考。
應(yīng)當(dāng)理解，親水聚合物可穩(wěn)定地與該脂質(zhì)偶聯(lián)，或經(jīng)由一個(gè)不穩(wěn)定鍵偶聯(lián)，該不穩(wěn)定鍵使該聚合物涂布的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物可以在血流循環(huán)期間，或在定位于目標(biāo)位點(diǎn)之后便擺脫或“釋放”親水聚合物涂層。親水聚合物，尤其是聚乙二醇(PEG)，可通過一個(gè)有助于釋放該聚合物鏈以應(yīng)答刺激物的鍵，附著在囊泡形成脂質(zhì)上，在例如此文所引作參考的WO 98/16202、WO 98/16201中，以及Kirpotin，D.等人(FEBS Letters，388115-118(1996))均描述了這種情況。
一種實(shí)施方案中，可釋放鍵是通過給藥合適的釋放劑，或在選擇性生理?xiàng)l件下，如在酶或還原劑存在條件下而被裂解的化學(xué)可釋放鍵。例如，酯酶或肽酶裂解酯鍵和肽鍵。二硫鍵是通過給藥諸如谷胱甘肽或抗壞血酸的還原劑，或通過體內(nèi)存在的還原劑，如存在于血漿和細(xì)胞中的半胱氨酸而得以裂解的。
其它可釋放鍵包括pH敏感鍵以及暴露于葡萄糖、光或熱時(shí)便裂解的鍵。例如，親水聚合物鏈可通過pH敏感鍵可附著到脂質(zhì)體上，并且該質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物被靶定在某個(gè)位點(diǎn)上，如腫瘤區(qū)，該位點(diǎn)的pH值可有效裂解該pH敏感鍵，并釋放親水鏈。典型pH敏感鍵包括酰氧基烷基醚、縮醛和縮酮鍵。另一實(shí)例中，可裂解鍵為二硫鍵，此處被廣泛用于指含硫鍵。含硫鍵可以被合成，以實(shí)現(xiàn)設(shè)定的不穩(wěn)定性程度，而且包括二硫鍵、混合硫醚-砜鍵和硫醚-亞砜鍵。這三種鍵中，二硫鍵最不易感于硫解作用，硫醚-亞砜鍵則最為易感。
這種可釋放鍵有助于調(diào)整親水聚合物片段從脂質(zhì)體復(fù)合物中釋放的速率。例如非常不穩(wěn)定的二硫鍵可以被用于靶定血液細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞很容易接近，而且較短的脂質(zhì)體血液循環(huán)壽命已足夠。另一個(gè)極端方面，當(dāng)目標(biāo)為腫瘤組織或其它器官時(shí)，為使復(fù)合物抵達(dá)指定目標(biāo)，通常需要較長(zhǎng)的脂質(zhì)體血液循環(huán)壽命，這時(shí)便可采用持久或穩(wěn)定的二硫鍵。
使親水聚合物鏈附著在脂質(zhì)體上的可釋放鍵在體內(nèi)被裂解的原因典型的是環(huán)境的改變，例如，該脂質(zhì)體到達(dá)稍低pH的特定位點(diǎn)，如腫瘤組織區(qū)域，或具有還原條件的位點(diǎn)，如缺氧腫瘤的情況中。體內(nèi)的還原條件也可以通過給藥某種還原劑而得以實(shí)現(xiàn)，諸如抗壞血酸、半胱氨酸或谷胱甘肽?？闪呀怄I在對(duì)外部刺激，諸如光或熱的應(yīng)答中也可能被破壞。
另一種實(shí)施方案中，脂質(zhì)體復(fù)合物包括可有效地特異性結(jié)合到治療所針對(duì)靶細(xì)胞上的親和部分或?qū)蚺潴w。這種部分可附著在脂質(zhì)體表面，或親水聚合物鏈的末端。如PCT申請(qǐng)Nos.WO US94/03103，WO98/16202和WO 98/16201所描述的，典型的部分包括抗體和用于特異結(jié)合靶細(xì)胞表面受體的配體等。該部分也可以是有利于該復(fù)合物與靶細(xì)胞融合的疏水片段。
被用于縮合dsRNA和dsRNA-編碼質(zhì)粒的聚陽離子縮合劑可以是多重帶電陽離子聚合物，并且優(yōu)選是生物聚合物，如亞精胺、精胺、聚賴氨酸、魚精蛋白、總組蛋白、諸如H1、H2、H3、H4的特定組蛋白組分，及其它聚陽離子多肽，也可以包括生物相容聚合物，如多粘菌素B。應(yīng)當(dāng)理解，這些聚陽離子縮合劑可以被利用的形式為游離堿或鹽，例如，硫酸魚精蛋白和聚賴氨酸氫溴酸鹽。一種優(yōu)選實(shí)施方案中，聚陽離子縮合劑為組蛋白，此處所指組蛋白包括總組蛋白或特定組蛋白組分。
某些實(shí)施方案中，聚合物-脂質(zhì)結(jié)合物中的疏水片段為疏水多肽序列。優(yōu)選的，該多肽序列由大約5-80，更優(yōu)選為10-50，最優(yōu)選為20-30個(gè)非極性和/或脂肪族/芳香族氨基酸殘基組成。這些序列可有效啟動(dòng)某些有被膜的病毒與宿主細(xì)胞的融合，這些病毒包括副流感病毒，諸如仙臺(tái)病毒、猿猴病毒-5(SV5)、麻疹病毒、新城疫病毒(NDV)和呼吸道合胞病毒(RSV)。其它實(shí)例包括人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)，即AIDS的病原體，可通過該病毒被膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜的融合感染細(xì)胞。融合在生理性(即中性)pH條件下發(fā)生，繼而該病毒遺傳物質(zhì)(核殼體)便被注入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分中。
D.配體導(dǎo)向的配方某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的超分子復(fù)合物和脂質(zhì)體可與一種或多種配體締合，該配體可有效結(jié)合到靶細(xì)胞上的特定細(xì)胞表面蛋白或基質(zhì)，從而有利于該復(fù)合物對(duì)靶細(xì)胞的捕獲，某些情況中，可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)該RNAi構(gòu)建體的攝取。僅舉例證明，適用于將本發(fā)明的超分子復(fù)合物和脂質(zhì)體靶定至特定細(xì)胞類型的配體實(shí)例如下表所列。
E.可呼吸RNAi構(gòu)建體本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了適用于將RNAi構(gòu)建體送遞至呼吸道的氣溶膠。呼吸道包括上氣道、下氣道，其中上氣道包括口咽和喉，下氣道包括氣管以及直達(dá)支氣管和細(xì)支氣管的分枝。上氣道和下氣道被統(tǒng)稱為傳導(dǎo)性氣道。末端細(xì)支氣管接著分成通入最終呼吸區(qū)，即肺泡或深肺部的呼吸細(xì)支氣管。
據(jù)此看來，吸入給藥可以是口服和/或鼻給藥。適用于氣溶膠送遞的藥用裝置實(shí)例包括計(jì)量劑量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和噴氣式霧化器。在例如，美國專利5,756,353、5,858,784和PCT申請(qǐng)WO98/31346、WO98/10796、WO00/27359、WO01/54664、WO02/060412中描述了可被方便地調(diào)整用于送遞本發(fā)明RNAi構(gòu)建體的典型吸入式核酸送遞體系。美國專利6,294,153、6,344,194、6,071,497和PCT申請(qǐng)WO02/066078、WO02/053190、WO01/60420、WO00/66206中描述了可用于送遞雙鏈RNA的其它氣溶膠配方。此外，如Templin et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2000，10359-68；Sandrasagra etal.，Expert Opin Biol Ther，2001，1979-83；Sandrasagra et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2002，12177-81所描述的，可以將適用于吸入式送遞其它寡核苷酸(如反義寡核苷酸)的方法調(diào)整為適用于送遞RNAi構(gòu)建體的方法。
人類肺部可以在數(shù)分鐘直至數(shù)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，清除或迅速降解可通過水解裂解的沉積氣溶膠。在上氣道中，有纖毛的上皮細(xì)胞有助于“黏膜纖毛活動(dòng)梯”，通過它便可向嘴部方向從氣道清除存在的粒子。如Pavia，D.，“LungMucociliary Clearance”，Aerosols and the LungClinical and Experimental Aspects，Clarke，S.W.和Payia，D.，Eds.，Butterworths，London，1984中所描述的。在深肺部中，肺泡巨噬細(xì)胞能夠在粒子沉積后不久便將其吞噬。如Warheit et al.，Microscopy Res.Tech.，26412-422(1993)和Brain，J.D.，“Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages”，TheReticuloendothelial System，S.M.Reichard和J.Filking，Eds.，Plenum，New.York.，pp.315-327，1985中所描述的。深肺部或肺泡均是全身性送遞RNAi構(gòu)建體所用的吸入治療性氣溶膠的主要目標(biāo)。
一些優(yōu)選實(shí)施方案中，尤其是希望實(shí)現(xiàn)RNAi構(gòu)建體的全身性劑量給藥時(shí)，氣溶膠化的RNAi構(gòu)建體被配制為微粒。直徑為0.5-10微米的微粒可以穿透肺部，并通過大部分天然屏障。通過喉部所要求的微粒直徑小于10微米；避免被呼出時(shí)，所要求的微粒直徑大于或等于0.5微米。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物中，如上所述，其直徑為0.5-10微米，并且可以被組合在直徑為0.5-10微米的粒子中。
另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體被提供在經(jīng)過適當(dāng)配制后適合肺部送遞的脂質(zhì)體或超分子復(fù)合物(如上所述)中。
(i)用于形成微粒的聚合物除上述超分子復(fù)合物以外，還有大量其它聚合物可被用于形成微粒。此處所用術(shù)語“微粒”包括微球(均勻球體)、微膠囊(具有一個(gè)核心和聚合物外層)及不規(guī)則形狀粒子。
聚合物優(yōu)選的是在一定的時(shí)間段內(nèi)或相對(duì)不久之后，通常1年內(nèi)，更為典型的幾個(gè)月，還要更為典型的幾天到幾周內(nèi)，可隨時(shí)間被生物降解并釋放RNAi構(gòu)建體的聚合物。生物降解既可以指微粒的破裂，即形成微粒的聚合物和/或聚合物本身的離解。其發(fā)生原因可以為下述幾種，從粒子所在的載體到其被給藥后所釋放位點(diǎn)的pH變化，如二酮哌嗪的情況，水解，如聚羥酸的情況，諸如鈣的離子從微粒的擴(kuò)散，如在通過諸如海藻酸鹽的聚合物離子結(jié)合所形成的微粒情況中，以及酶作用，如多數(shù)的多糖和蛋白質(zhì)情況中。某些情況中，線性釋放可能是最為有用的，盡管其它情況中脈沖釋放或“大量釋放”也可能獲得更為有效的結(jié)果。
代表性的合成材料為二酮哌嗪，諸如聚乳酸、聚羥基乙酸的聚羥酸及其共聚物，聚酐，諸如聚原酸酯的聚酯，聚酰胺，聚碳酸酯，諸如聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)苯二甲酸亞乙酯的聚烷撐，諸如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基乙酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯的聚乙烯基化合物，聚硅氧烷，丙烯酸與異丁烯酸的聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯，聚氨酯及其共聚物，纖維素包括烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝酸纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、醋酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、苯二甲酸醋酸纖維素、羧乙基纖維素、三醋酸纖維素、硫酸纖維素鈉鹽、聚丁酸、聚戊酸及聚(交酯-共-己內(nèi)酯)。
天然聚合物包括海藻酸鹽，及包括葡聚糖和纖維素的其它多糖、膠原、白蛋白及其它親水蛋白、玉米蛋白及其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白，其共聚物和混合物。此處所用的其化學(xué)衍生物指諸如烷基、亞烷基的化學(xué)基團(tuán)的取代、加成，羥基化，氧化及本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行的其它修飾。
生物附著性聚合物包括H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell在Macromolecules，1993，26，581-587中所描述的生物可侵蝕性水凝膠，還包括聚透明質(zhì)酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酐、聚丙烯酸、海藻酸鹽、殼聚糖和聚丙烯酸酯。
進(jìn)一步舉例說明，通過溶劑蒸發(fā)、噴霧干燥、溶劑萃取及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，均可使聚合物形成基質(zhì)。有文獻(xiàn)描述了制備適用于藥物送遞的微球的方法，例如Mathiowitz和Langer，J.Controlled Release5，13-22(1987)；Mathiowitz，et al.，ReactivePolymers6，275-283(1987)；和Mathiowitz，et al.，J.Appl.Polymer Sci.35，755-774(1988)。如Mathiowitz，et al.，ScanningMicroscopy4，329-340(1990)；Mathiowitz，et al.，J.Appl.PolymerSci.45，125-134(1992)；和Benita，et al.，J.Pharm.Sci.73，1721-1724(1984)所描述的，方法的選擇取決于所選聚合物、尺寸、外部形態(tài)、所希望的結(jié)晶度。
如Mathiowitz，et al.，(1990)，Benita，和Jaffe的U.S.Pat.No.4,272,398所描述的，在溶劑蒸發(fā)情況中，聚合物被溶解在可揮發(fā)的有機(jī)溶劑中。以可溶形式或微粒形式分散的RNAi構(gòu)建體被添加至該聚合物溶液中，混合物便懸浮在含表面活性劑，如聚乙烯醇的水相中。攪動(dòng)獲得的乳濁液，直至大部分有機(jī)溶劑揮發(fā)，便留下了固體微球。
通常，該聚合物可以溶解在二氯甲烷中。可以采用若干不同的聚合物濃度，例如，0.05-0.20g/ml。將藥物加入該溶液中后，將所獲溶液懸浮于200mi劇烈攪拌的含1％(w/v)聚乙烯醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的蒸餾水中。攪拌4小時(shí)后，有機(jī)溶劑從聚合物揮發(fā)，再以水洗滌所獲得的微球，并于冷凍干燥機(jī)中干燥過夜。
通過適用于獲得相對(duì)穩(wěn)定聚合物，如聚酯和聚苯乙烯的方法，可以獲得不同尺寸(1-1000微米，盡管氣溶膠應(yīng)用要求小于10微米)和形態(tài)的微球。不過，不穩(wěn)定的聚合物，如聚酐則可能由于暴露于水而降解。對(duì)這些聚合物而言，熱融封裝并脫除溶劑的方法可能是優(yōu)選的。
在熱融封裝過程中，聚合物首先被融化，并與RNAi構(gòu)建體的固體粒子混合，優(yōu)選地是通過篩分獲得合適尺寸。將該混合物懸浮在不易混合的溶劑，如硅油中，并進(jìn)行連續(xù)攪拌，加熱至高于該聚合物熔點(diǎn)5℃的溫度。一旦該乳濁液穩(wěn)定，便將其冷卻直至該聚合物粒子凝固。通過采用石油醚傾析的方法洗滌所獲得的微球，以獲得自由流動(dòng)的粉狀物。采用該方法可以獲得直徑為1-1000微米的微球。采用該技術(shù)制備的微球外表面通常光滑且致密。該操作可用于水不穩(wěn)定聚合物，但采用分子量為1000-50000的聚合物時(shí)則有局限性。
在噴霧干燥過程中，聚合物被溶解在有機(jī)溶劑，如二氯甲烷(0.04g/ml)中。將已知量的RNAi構(gòu)建體懸浮(如果不可溶)或共溶(如果可溶)于該聚合物溶液中。繼而噴霧干燥該溶液或分散體系。采用該方法可以獲得直徑為1-10微米的微球，形態(tài)則取決于所選擇的聚合物。
由凝膠類型聚合物，如海藻酸鹽、聚膦嗪或其它二羧基聚合物制成的水凝膠微球的制備方法如下，將該聚合物溶解在水溶液中，將待整合的材料懸浮于該混合物中，擠壓該聚合物的混合物通過一種配置有氮?dú)鈬娚淦鞯奈⒌涡纬裳b置。如Salib，et al.，PharmazeutischeIndustrie40-111A，1230(1978)所描述，獲得的微球落入緩慢攪拌的離子硬化浴中。如Lim et al.，J.Pharm.Sci.70，351-354(1981)所描述，該體系的優(yōu)勢(shì)是可以在加工完成后，可通過采用聚陽離子聚合物，如聚賴氨酸涂布的方法，進(jìn)一步修飾微球表面。例如，在海藻酸鹽的情況中，通過海藻酸鹽與鈣離子的離子交聯(lián)，繼而于加工完成后，使微粒的外表面與聚陽離子，如聚賴氨酸交聯(lián)，便可以形成水凝膠。采用不同尺寸的擠壓機(jī)、聚合物流速及氣體流速，便可以控制該微球粒子的尺寸。
通過將聚合物溶解于酸性溶液，并與三聚磷酸鹽交聯(lián)的方法可以制備殼聚糖微球。例如，羧甲基纖維素(CMC)微球是通過使聚合物溶解于酸溶液，并采用鉛離子沉淀微球的方法制備而得?？梢灾苽浜Ｔ逅猁}/聚乙烯亞胺(PEI)以減少海藻酸鹽微膠囊上羧基基團(tuán)的量。
(ii)藥物組合物該微?？梢詰腋∮谌魏芜m當(dāng)?shù)乃幬镙d體中，如用于給予患者的鹽水。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，以干燥或凍干形式保存微粒，直至給藥前。繼而可以將其懸浮于足量溶液中，例如適用于以氣溶膠或干粉形式給藥的水溶液。
(iii)導(dǎo)向給藥該微粒可以被送遞至特定細(xì)胞，尤其是吞噬細(xì)胞和器官。淋巴集結(jié)內(nèi)的吞噬細(xì)胞似乎可以選擇性地?cái)z取口服給藥的微粒。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞也可攝取靜脈給藥的微粒?？梢岳梅尾烤奘杉?xì)胞對(duì)微粒的吞噬，使該微粒靶定脾臟、骨髓、肝臟和淋巴結(jié)。
如上所述，通過附著可以特異或非特異地結(jié)合特定靶的配體，也可使微粒導(dǎo)向。這種配體的實(shí)例也包括抗體、含可變區(qū)的片段、外源凝集素、激素或其它在靶細(xì)胞表面上具有受體的有機(jī)分子。
(iv)微粒的保存優(yōu)選實(shí)施方案中，該微粒是凍干保存的。劑量的確定是根據(jù)所封裝RNAi構(gòu)建體的量、肺系統(tǒng)內(nèi)的釋放速率以及該化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。
(v)微粒的送遞可采用多種方法送遞微粒，范圍從直接給藥進(jìn)鼻道以使部分粒子抵達(dá)肺系統(tǒng)，到利用粉末滴注裝置，或利用直達(dá)肺部管道的導(dǎo)管或管狀物。盡管利用烴類推進(jìn)劑的那些裝置已不再被利用，而且那些依賴于患者呼吸攝取量的裝置會(huì)導(dǎo)致劑量變動(dòng)，仍然有商業(yè)可提供的干粉吸入器。合適推進(jìn)劑的實(shí)例包括氫氟烷推進(jìn)劑，如1，1，1，2-四氟乙烷(CF3CH2F)(HFA-134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷(CF3CHFCF3)(HFA-227)、全氟乙烷、單氯氟甲烷、1，1-二氟乙烷及其組合。
F.用于釋放RNAi構(gòu)建體的醫(yī)用裝置涂層本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及涂布有涂層的醫(yī)用裝置。例如，某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了至少一個(gè)表面附有涂層的醫(yī)用裝置，其中該涂層包含本發(fā)明的聚合物基質(zhì)和RNAi構(gòu)建體。這種涂層可應(yīng)用于外科手術(shù)器械，如螺釘、板片、墊圈、縫合線、假體錨定裝置、平頭釘、卡釘、電導(dǎo)聯(lián)、瓣膜、膜。該裝置可以是導(dǎo)管、可植入血管通路端口、儲(chǔ)血袋、輸血管、中央靜脈導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管、血管植入物、主動(dòng)脈內(nèi)球囊泵、心臟瓣膜、心血管縫合線、人造心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析組件、血液灌注組件、血漿置換組件及適于血管內(nèi)展開的濾器。
在某些根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中，形成聚合物的單體與RNAi構(gòu)建體組合，將二者混合，使該RNAi構(gòu)建體均勻分散在單體溶液中。繼而根據(jù)常規(guī)涂層方法，將該分散體系添加至支架或其它裝置，之后由常規(guī)引發(fā)劑，如UV光起動(dòng)交聯(lián)過程。在根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，聚合物組合物與RNAi構(gòu)建體組合，形成分散體系。繼而將該分散體系用于醫(yī)用裝置的表面，聚合物發(fā)生交聯(lián)便形成了固體涂層。在根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，聚合物和RNAi構(gòu)建體與合適的溶劑組合，形成分散體系，繼而以常規(guī)方式將該分散體系用于支架。之后通過常規(guī)方法，如熱蒸發(fā)，便可除去溶劑，而聚合物和RNAi構(gòu)建體(共同形成持續(xù)釋放藥物送遞體系)則作為涂層保留在支架上。在將RNAi構(gòu)建體溶解在聚合物組合物中的情況里也可應(yīng)用類似方法。
在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，體系包含相對(duì)硬的聚合物。另一些實(shí)施方案中，體系包含柔軟且可伸展的聚合物。還有一些實(shí)施方案中，體系包含具有粘附特性的聚合物。聚合物的硬度、彈性、粘性及其它特性是廣泛可變的，如下文更為具體論述的，這些特性取決于體系的特定最終形態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的體系的實(shí)施方案具有多種不同形式。某些實(shí)施方案中，體系由懸浮或分散在聚合物中的RNAi構(gòu)建體組成。其它某些實(shí)施方案中，體系由RNAi構(gòu)建體和半固體或凝膠聚合物組成，可經(jīng)由注射器被注射進(jìn)體內(nèi)。在根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，體系由RNAi構(gòu)建體和柔軟可彎曲的聚合物組成，可通過適當(dāng)外科方法被插入或植入體內(nèi)。在根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，體系由硬的固體聚合物組成，可通過適當(dāng)外科方法被插入或植入體內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，體系包含懸浮或分散有RNAi構(gòu)建體的聚合物，其中RNAi構(gòu)建體和聚合物混合物在諸如螺釘、支架、起搏器等外科手術(shù)器械上形成了涂層。在根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，該裝置由硬的固體聚合物組成，被定型為外科手術(shù)器械的形式，如外科螺釘、板片、支架等，或這些器械的某一部分。在根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，體系包括縫合線形式，且分散或懸浮有RNAi構(gòu)建體的聚合物。
在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提供了含基質(zhì)的醫(yī)用裝置，該基質(zhì)具有一個(gè)表面，例如外表面及其上的涂層。該涂層含聚合物，而該聚合物中分散有RNAi構(gòu)建體，并且可使RNAi構(gòu)建體穿透，或者生物降解后釋放該RNAi構(gòu)建體。在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該裝置包含懸浮或分散在合適聚合物中的RNAi構(gòu)建體，其中該RNAi構(gòu)建體和聚合物被涂布在整個(gè)底物上，如外科手術(shù)器械。這種涂布可通過噴涂或浸涂方式實(shí)現(xiàn)。
在根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，該裝置包含RNAi構(gòu)建體和聚合物懸液或分散體系，其中該聚合物是硬的，并且形成了待插入或植入體內(nèi)的裝置的一個(gè)組成部分。例如，在根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)例中，該裝置為涂布有懸浮或分散在聚合物中的RNAi構(gòu)建體的外科螺釘、支架、起搏器等。在根據(jù)本發(fā)明的另一些特定實(shí)施方案中，懸浮有RNAi構(gòu)建體的聚合物形成了外科螺釘?shù)募舛嘶蝾^部，或其部分。在根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，懸浮或分散有RNAi構(gòu)建體的聚合物被涂布在諸如外科用管狀物(如結(jié)腸造口術(shù)、腹腔灌洗導(dǎo)管和靜脈內(nèi)管)的外科器械上。在根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該裝置為涂布有聚合物和RNAi構(gòu)建體的靜脈注射針。
如上所論述，根據(jù)本發(fā)明的涂層包含生物可侵蝕或非生物可侵蝕的聚合物。對(duì)生物可侵蝕和非生物可侵蝕聚合物的選擇是基于體系或裝置的計(jì)劃最終用途。在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該聚合物可以被有利地生物侵蝕。例如，當(dāng)體系為諸如螺釘、支架、起搏器等外科可植入裝置上的涂層時(shí)，該聚合物是可以被有利地生物侵蝕的。根據(jù)本發(fā)明，聚合物可以被有利地生物侵蝕的其它實(shí)施方案包括某些裝置，該裝置是RNAi構(gòu)建體于聚合物中形成的可植入、吸入或注射的懸液或分散體系，其中該裝置未利用其它組件(如螺釘或錨定物)。
在根據(jù)本發(fā)明，聚合物難以穿透和難以生物侵蝕的某些實(shí)施方案中，該聚合物的生物侵蝕速率有利地充分低于RNAi構(gòu)建體的釋放速率，因此該聚合物在RNAi構(gòu)建體被釋放后的一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)仍保留在原位，但最終還是被生物侵蝕并重新吸收進(jìn)周圍組織中。例如，在裝置為包含懸浮或分散在生物可侵蝕聚合物中的RNAi構(gòu)建體的生物可侵蝕縫合線的情況中，該聚合物的生物侵蝕速率有利地充分低，該RNAi構(gòu)建體以線性方式在大約3到大約14天的時(shí)間內(nèi)被釋放，而縫合線仍存留大約3周到大約6月。根據(jù)本發(fā)明的類似裝置包括含有懸浮或分散在生物可侵蝕聚合物中的RNAi構(gòu)建體的外科手術(shù)卡釘。
在根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，聚合物的生物侵蝕速率有利地與RNAi構(gòu)建體的釋放速率位于同一數(shù)量級(jí)。例如，在體系含有懸浮或分散在聚合物中的RNAi構(gòu)建體，而該聚合物涂布在外科手術(shù)器械，諸如矯形螺釘、支架、起搏器或非生物可侵蝕縫合線上的情況中，該聚合物有利地以某一速率被生物侵蝕，該速率情況下，直接暴露于周圍機(jī)體組織的RNAi構(gòu)建體的表面積隨著時(shí)間基本上保持恒定。
在根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，聚合物載體可被周圍組織，如血漿中的水份穿透。在這些情況中，水溶液可穿透該聚合物，從而接觸到RNAi構(gòu)建體。該溶出速率可能受一組復(fù)雜的變量控制，如聚合物的滲透性、RNAi構(gòu)建體的溶解度、pH、離子強(qiáng)度，以及生理性流體的蛋白質(zhì)組成等。
在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，聚合物為非生物可侵蝕的。在體系包含有待于被涂布在某些外科手術(shù)器械上，并形成其一個(gè)組成部分的聚合物的情況中，其中這些外科手術(shù)器械適合被永久地，或者半永久地插入或植入體內(nèi)，則非生物可侵蝕聚合物是尤其有效的。有聚合物有利地形成外科手術(shù)器械上的永久性涂層的典型裝置包括矯形螺釘、支架、假體關(guān)節(jié)、人工瓣膜、永久性縫合線、起搏器等。
在經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)之后，可能利用到多種不同的支架。盡管根據(jù)本發(fā)明可能利用到許多支架，為簡(jiǎn)化起見，本發(fā)明的典型實(shí)施方案中將描述到有限數(shù)量的支架。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到與本發(fā)明有關(guān)的許多支架均可能被利用到。另外，如上所述，也可能利用其它醫(yī)用裝置。
支架通常被用作導(dǎo)管腔左內(nèi)側(cè)的管狀結(jié)構(gòu)以緩解梗阻癥狀。通常，支架以未展開形式被插入管腔內(nèi)，并繼而自動(dòng)地，或者在原位第二裝置的幫助下伸展開。典型伸展方法的實(shí)現(xiàn)是通過利用安裝在導(dǎo)管上的血管成形術(shù)球囊，該球囊在變窄的血管或機(jī)體通道內(nèi)膨脹，可剪切并破壞與血管壁組成相連的阻塞，從而獲得擴(kuò)大的管腔。
利用多種方法均可制作本發(fā)明的支架。例如，從可能利用激光、電火花加工、化學(xué)侵蝕或其它方式機(jī)械加工過的空心或成形的不銹鋼管可以制作該支架。將未伸展的支架插入機(jī)體，并將其置于預(yù)期位點(diǎn)。一種典型實(shí)施方案中，通過球囊導(dǎo)管可使支架在血管內(nèi)展開，其中該支架的最終直徑隨所用球囊導(dǎo)管的直徑不同而變化。
應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的支架可由形狀記憶材料體現(xiàn)，這種形狀記憶材料包括，例如鎳和鈦或不銹鋼的適當(dāng)合金。
通過使不銹鋼以預(yù)定方式成形的方法，例如將其扭曲成麻花狀構(gòu)型，可以將不銹鋼形成的構(gòu)型制成自伸展性的。在該實(shí)施方案中，形成支架后，可將其壓縮，以使其占用的空間充分小到可通過插入方式被插入在血管或其它組織內(nèi)，其中該插入方式包括合適的導(dǎo)管或彈性桿。
從導(dǎo)管中脫出時(shí)，可使支架成形伸展為預(yù)期構(gòu)型，該伸展是自動(dòng)或通過壓力、溫度或電刺激的改變引發(fā)的。
無論支架的設(shè)計(jì)如何，優(yōu)選的是含RNAi構(gòu)建體的支架，其中該RNAi構(gòu)建體具有足夠的特異性，以及可于損傷區(qū)提供有效劑量的充分濃度。在這點(diǎn)上，涂層中的“貯存尺寸”優(yōu)選地經(jīng)過估量，以在預(yù)定位點(diǎn)充分提供預(yù)期量的RNAi構(gòu)建體。
另一種典型實(shí)施方案中，支架的全部?jī)?nèi)外表面均可涂布治療劑量的RNAi構(gòu)建體。不過，重點(diǎn)是指出該涂層技術(shù)的變動(dòng)可能取決于RNAi構(gòu)建體。同樣，該涂層技術(shù)的變動(dòng)也可能取決于包含支架或其它腔內(nèi)醫(yī)用裝置的材料。
腔內(nèi)醫(yī)用裝置具有持續(xù)釋放藥物送遞涂層。借助常規(guī)涂層方法，如浸漬涂布、噴涂和浸涂，可將RNAi構(gòu)建體涂層涂布在支架上。
一種實(shí)施方案中，腔內(nèi)醫(yī)用裝置包括延長(zhǎng)的放射狀伸展的管狀支架，該支架具有一個(gè)腔內(nèi)表面和一個(gè)沿支架縱軸線伸展的相對(duì)的外表面。該支架可以包括永久可植入支架、可植入移植支架或臨時(shí)性支架，其中臨時(shí)性支架被定義為可于血管內(nèi)伸展，之后可由血管取回的支架。支架構(gòu)形可以包括盤繞支架、記憶盤繞支架、Nitinol支架、網(wǎng)狀支架、腳手支架、套筒支架、可滲透支架、含溫度傳感器的支架、多孔支架等。根據(jù)常規(guī)方法，如通過可膨脹球囊導(dǎo)管、通過自展開機(jī)制(從導(dǎo)管釋放之后)，或者通過其它適當(dāng)方式，均可使支架展開。該延長(zhǎng)的放射狀伸展的管狀支架可以是移植支架，其中該移植支架是在移植物內(nèi)或外部具有支架的一個(gè)復(fù)合裝置。該移植物可以是血管植入物，諸如ePTFE移植物、生物學(xué)移植物或編織移植物。
有若干方法可將RNAi構(gòu)建體整合到或附著在支架上。典型實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被直接整合進(jìn)聚合基質(zhì)中，并被噴涂在支架外表面。RNAi構(gòu)建體隨時(shí)間從聚合基質(zhì)中釋放，進(jìn)入周圍組織。RNAi構(gòu)建體優(yōu)選地保留在支架上至少3天直至大約6個(gè)月，更優(yōu)選為7-30天。
某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括生物學(xué)耐受聚合物，即其可使RNAi構(gòu)建體透過，而其具有的滲透性并非RNAi構(gòu)建體從聚合物中釋放速率的主要速率決定因素。
在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，聚合物是非生物可侵蝕的。本發(fā)明利用的非生物可侵蝕聚合物的實(shí)例包括聚(乙烯聚-共-乙酸乙烯酯)(EVA)、聚乙烯醇和聚氨酯，如以聚碳酸酯為基礎(chǔ)的聚氨酯。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，聚合物為生物可侵蝕的。本發(fā)明利用的生物可侵蝕聚合物的實(shí)例包括聚酐、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚原酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯或其衍生物和共聚物。如下文更具體描述的，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)聚合物的生物侵蝕性或非生物侵蝕性的選擇取決于體系的最終物理形態(tài)。其它典型聚合物包括有機(jī)硅聚合物和透明質(zhì)酸衍生的聚合物。有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明的聚合物是在適合賦予滲透性的條件下制備而得，因此其并非RNAi構(gòu)建體從聚合物中釋放的主要速率決定因素。
此外，合適的聚合物包括與體液及哺乳動(dòng)物組織生物可相容，并且基本上不溶于與之接觸的體液的天然存在(膠原、透明質(zhì)酸等)或合成的材料。另外，合適的聚合物基本上可以阻止分散/懸浮于該聚合物中的RNAi構(gòu)建體與體液中蛋白質(zhì)組成之間的相互作用。某些情況中，鑒于聚合物可能溶解，或者與能夠影響藥物釋放恒定性的蛋白質(zhì)組成相互作用，因此應(yīng)避免采用快速溶解的聚合物、高度可溶于體液或容許RNAi構(gòu)建體與蛋白質(zhì)組成相互作用的聚合物。
其它合適的聚合物包括聚丙烯、聚酯、聚乙烯乙酸乙烯酯(PVA或EVA)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚環(huán)氧丙烷、聚羧酸、聚烷基丙烯酸酯、纖維素醚、硅酮、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)、多種Eudragrit(例如NE30D、RS PO和RL PO)、聚烷基-烷基丙烯酸酯共聚物、聚酯-聚氨酯嵌段共聚物、聚醚-聚氨酯嵌段共聚物、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、聚β羥基丁酸酯、聚乳酸(PLA)、聚已內(nèi)酯、聚羥基乙酸和PEO-PLA共聚物。
形成本發(fā)明的涂層可通過如下方法進(jìn)行，即將一種或多種合適的單體與合適的RNAi構(gòu)建體混合，繼而使單體聚合形成聚合物體系。通過該方式，RNAi構(gòu)建體便被溶解或分散在聚合物中。另一些實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體被混合進(jìn)液體聚合物或聚合物分散體系中，繼而進(jìn)一步加工該聚合物以形成本發(fā)明的涂層。合適的其它加工步驟可以包括與合適的交聯(lián)RNAi構(gòu)建體交聯(lián)、液體聚合物或聚合物分散體系的進(jìn)一步聚合、與合適的單體共聚、與合適的聚合物塊嵌段共聚等。進(jìn)一步的加工步驟使RNAi構(gòu)建體陷于聚合物中，從而使該RNAi構(gòu)建體懸浮或分散在聚合物載體中。
許多非可侵蝕的聚合物均可與RNAi構(gòu)建體結(jié)合應(yīng)用。可被用于本申請(qǐng)中涂層的成膜聚合物可以是可吸收或非可吸收的，并且必須是生物相容的，以最小化對(duì)血管壁的刺激。該聚合物可以是生物穩(wěn)定或生物可吸收的，取決于聚合物的預(yù)期釋放速率或預(yù)期穩(wěn)定性程度，但生物可吸收聚合物可能是優(yōu)選的，因?yàn)榕c生物穩(wěn)定聚合物不同，生物可吸收聚合物不會(huì)在植入后長(zhǎng)期存在并引起任何有害、慢性局部反應(yīng)。此外，生物可吸收聚合物不存在如下所述的風(fēng)險(xiǎn)，即由于可能排斥涂層并且甚至在支架被封入組織后仍然可能引入進(jìn)一步的難題的生物環(huán)境的壓力，導(dǎo)致支架與涂層之間的附著隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而喪失。
可采用的合適成膜生物可吸收聚合物包括選自脂肪族聚酯、聚氨基酸、共聚醚-酯、聚草酸亞烷基酯、聚酰胺、聚亞氨基碳酸酯、聚原酸酯、polyoxaester、聚酰氨基酯、含酰氨基團(tuán)的polyoxaester、聚酐、聚磷腈、生物分子及其混合物的聚合物。對(duì)本發(fā)明目的而言，脂肪族聚酯包括交酯的均聚物和共聚物(包括乳酸d-，l-和內(nèi)消旋交酯)、ε-己內(nèi)酯、乙交酯(包括羥基乙酸)、羥基丁酸酯、羥基戊酸酯、對(duì)二氧六環(huán)酮、碳酸亞丙酯(及其烷基衍生物)、1，4-dioxepan-2-酮、1，5-dioxepan-2-酮、6，6-二甲基-1，4-二噁烷-2-酮及其聚合物混合物。對(duì)本發(fā)明而言，聚亞氨基碳酸酯包括Kemnitzer和Kohn在Domb，Kost和Wisemen編輯的the Handbook of Biodegradable Polymers，Hardwood Academic Press，1997，251-272頁所描述的聚合物。對(duì)本發(fā)明而言，共聚醚-酯包括Cohn and Younes在Journal ofBiomaterials Research，Vol.22，993-1009頁，1988，以及Cohn在Polymer Preprints(ACS Division of Polymer Chmistry)Vol.30(1)，498頁，1989(如PEO/PLA)所描述的共聚醚-酯。對(duì)本發(fā)明而言，聚草酸亞烷基酯包括美國專利Nos.4,208,511；4,141,087；4,130,639；4,140,678；4,105,034；和4,205,399(在此引入作為參考)中描述的那些。如Allcock在The Encyclopedia of Polymer Science，Vol.13，31-41頁，Wiley Intersciences，John Wiley&Sons，1988以及Vandorpe，Schacht，Dejardin和Lemmouchi在Domb，Kost和Wisemen編輯的Handbook of Biodegradable Polymers，HardwoodAcademic Press，1997，161-182頁(在此引入作為參考)所描述的由L-丙交酯、D，L-丙交酯、乳酸、乙交酯、羥基乙酸、對(duì)二氧六環(huán)酮、碳酸亞丙酯和ε-己內(nèi)酯制成的聚磷腈，共-、三元-和基于更高級(jí)數(shù)混合的單體的聚合物。由HOOC-C6H4-O-(CH2)m-O-C6H4-COOH形式的二酸形成的聚酐，其中m為2-8中的一個(gè)整數(shù)，及其與直至12個(gè)碳的脂肪族α-ω二酸形成的共聚物。在美國專利Nos.5,464,929；5,595,751；5,597,579；5,607,687；5,618,552；5,620,698；5,645,850；5,648,088；5,698,213和5,700,583(在此引入作為參考)中的一個(gè)或多個(gè)專利中均描述了polyoxaester polyoxaamides和含胺和/或酰胺基的polyoxaester。聚原酸酯如Heller在Domb，Kost和Wisemen編輯的Handbook of Biodegradable Polymers，Hardwood AcademicPress，1997，99-118頁(在此引入作為參考)所描述。對(duì)本發(fā)明而言，成膜聚合生物分子包括可于人體內(nèi)被酶降解，或者在人體內(nèi)水解不穩(wěn)定的天然存在的物質(zhì)，如纖維蛋白、纖維蛋白原、膠原、彈性蛋白，以及可吸收的生物相容多糖，如殼聚糖、淀粉、脂肪酸(及其酯類)、葡糖聚糖和透明質(zhì)酸。
具有相對(duì)低的慢性組織反應(yīng)的合適成膜生物穩(wěn)定聚合物，如聚氨酯、硅酮、聚(甲)丙烯酸酯、聚酯、聚環(huán)氧烷(聚環(huán)氧乙烷)、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，以及那些諸如由交聯(lián)的聚乙烯基吡咯烷酮和聚酯形成的水凝膠也可以被采用。也可采用其它聚合物，只要其可以溶解、固化或聚合在支架上即可。這些聚合物包括聚烯烴、聚異丁烯和乙烯-α烯烴共聚物；丙烯酸聚合物(包括甲基丙烯酸酯)和共聚物、乙烯基鹵聚合物和共聚物，如聚氯乙烯；聚乙烯基醚，如聚乙烯基甲基醚；聚偏二鹵乙烯，如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯；聚丙烯腈、聚乙烯基酮；聚乙烯芳香烴，如聚苯乙烯；聚乙烯酯，如聚乙酸乙烯酯；乙烯基單體彼此和烯烴所形成的共聚物，如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS樹脂和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺，如尼龍66和聚己內(nèi)酰胺；醇酸樹脂；聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亞胺；聚醚；環(huán)氧樹脂、聚氨酯；人造纖維；人造纖維-三乙酸酯、纖維素、乙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素；賽璐玢；硝酸纖維素；丙酸纖維素；纖維素醚(即羧甲基纖維素和羥烷基纖維素)；及其組合。對(duì)本申請(qǐng)而言，聚酰胺也包括-NH-(CH2)n-CO-和NH-(CH2)x-NH-CO-(CH2)y-CO形式的聚酰胺，其中n優(yōu)選的為6-13中的一個(gè)整數(shù)；x為6-12中的一個(gè)整數(shù)；y為4-16中的一個(gè)整數(shù)。以上所列聚合物僅為舉例，不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
被用作涂層的聚合物可以是分子量足夠高而不會(huì)蠟化或發(fā)粘的成膜聚合物。該聚合物也應(yīng)當(dāng)能附著在支架上，并在沉積于支架上后，不應(yīng)當(dāng)易變形而在血液動(dòng)力的壓力下被移走。該聚合物分子量應(yīng)足以提供充分的韌性，從而在支架的輸送或伸展期間，該聚合物不被摩擦掉，并且在支架伸展期間不破裂。某些實(shí)施方案中，該聚合物的融化溫度在40℃以上，優(yōu)選的大約45℃以上，更為優(yōu)選的50℃以上，最為優(yōu)選的55℃以上。
通過將一種或多種治療性RNAi構(gòu)建體與涂層聚合物混合形成涂層混合物便可配制出涂層。RNAi構(gòu)建體的存在形式可為液體、細(xì)碎固體，或其它任意適當(dāng)物理形態(tài)。該混合物可任意包括一種或多種添加物，如無毒輔助性物質(zhì)，諸如稀釋劑、載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等。其它合適的添加物可連同聚合物和RNAi構(gòu)建體一起配制。例如，可以將選自上文所列生物相容成膜聚合物中的親水聚合物添加至生物相容疏水涂層中，以改進(jìn)釋放特性(或可將疏水聚合物添加至親水涂層中，以改進(jìn)釋放特性)。一個(gè)實(shí)例是將選自聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素及其組合的親水聚合物添加至脂肪族聚酯涂層中，以改良釋放特性。合適的相對(duì)量可通過監(jiān)測(cè)治療性RNAi構(gòu)建體的體外和/或體內(nèi)釋放特性而得以確定。
涂層厚度可決定RNAi構(gòu)建體從基質(zhì)釋放的速率?；旧?，RNAi構(gòu)建體是通過經(jīng)由聚合物基質(zhì)擴(kuò)散的方式從基質(zhì)中釋放。聚合物為可滲透的，從而允許固體、液體和氣體從其中釋放。聚合物基質(zhì)的總厚度范圍在大約1微米到大約20微米之間，或者更大范圍。重要的是指出可以在將聚合基質(zhì)附著在醫(yī)用裝置上之前，利用引物層和金屬表面處理，例如，酸洗、堿洗、鹽化和聚對(duì)亞苯基二甲基沉積均可被用作所述全部過程中的一部分。
進(jìn)一步舉例證明，有許多方式可以將聚(乙烯-共-乙烯乙酸酯)、聚甲基丙烯酸丁酯和RNAi構(gòu)建體溶液摻入支架內(nèi)或外。例如，可以將該溶液噴涂在支架上，或者將支架浸入該溶液內(nèi)。其它方法包括旋涂和RF等離子聚合。一種典型實(shí)施方案中，該溶液被噴涂在支架上，繼而使其干燥。另一種典型實(shí)施方案中，可將該溶液通電而加以一個(gè)極性，而支架被通電加以另一個(gè)相反極性。以該方式，溶液和支架將彼此吸引。在采用這種類型的噴涂方法中，可減少損耗，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)涂層厚度更為精確的控制。
另一個(gè)典型實(shí)施方案中，RNAi構(gòu)建體可以被摻入成膜聚氟共聚物中，該共聚物含一定量的選自聚合的亞乙烯基氟和聚合的四氟乙烯的第一個(gè)部分，和一定量的不同于第一個(gè)部分的第二個(gè)部分，第二個(gè)部分與第一個(gè)部分共聚后，可產(chǎn)生聚氟共聚物，第二個(gè)部分能夠提供該聚氟共聚物的韌性或彈性性能，其中第一個(gè)部分與第二個(gè)部分的相對(duì)量可有效賦予該涂層和其所產(chǎn)生的膜某些特性，可將這些特性有效地應(yīng)用在處理可植入醫(yī)用裝置的過程中。
在根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的腔內(nèi)醫(yī)用裝置中，可伸展管狀支架的外表面包含根據(jù)本發(fā)明的涂層。具有涂層的支架外表面為接觸組織表面，并且是生物相容的?！俺掷m(xù)釋放RNAi構(gòu)建體送遞體系涂布的表面”與“涂布的表面”同義，其中表面被涂布、覆蓋或浸滲有根據(jù)本發(fā)明的持續(xù)釋放RNAi構(gòu)建體送遞體系。
一種可選實(shí)施方案中，本發(fā)明的腔內(nèi)醫(yī)用裝置中，延長(zhǎng)的迅速可伸展管狀支架的腔內(nèi)表面或整個(gè)表面(即內(nèi)和外表面)均具有涂布的表面。含本發(fā)明持續(xù)釋放RNAi構(gòu)建體送遞體系的腔內(nèi)表面也是接觸流體的表面，并且是生物相容和血液相容的。
V.典型應(yīng)用在一個(gè)方面，本發(fā)明方法被用于抑制，或至少減少體內(nèi)不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法利用RNAi選擇性地抑制編碼增殖調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)。例如，可采用本發(fā)明方法抑制某些基因產(chǎn)物的表達(dá)，該基因產(chǎn)物對(duì)靶細(xì)胞的有絲分裂，和或阻止靶細(xì)胞凋亡而言是必不可少的。本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體可以被設(shè)計(jì)成與編碼靶定的增殖調(diào)節(jié)蛋白的mRNA的編碼序列或其它部分對(duì)應(yīng)。當(dāng)采用該RNAi構(gòu)建體進(jìn)行處理時(shí)，靶細(xì)胞中出現(xiàn)的表達(dá)喪失表型將致使該細(xì)胞處于休眠或者開始凋亡。
某些實(shí)施方案中，選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體以抑制可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和有絲分裂的基因產(chǎn)物的表達(dá)?？赏ㄟ^本發(fā)明方法靶定的基因種類是那些已知的致癌基因。此處所用術(shù)語“致癌基因”指刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，并且當(dāng)其在該細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平降低時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率便降低或者該細(xì)胞開始休眠。本發(fā)明的上下文中，致癌基因包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，以及可能通過自分泌或旁分泌功能刺激細(xì)胞增殖的細(xì)胞外生長(zhǎng)因子。RNAi構(gòu)建體可以被設(shè)計(jì)針對(duì)的人類致癌基因?qū)嵗╟-myc、c-myb、mdm2、PKA-I(I型蛋白質(zhì)激酶A)、Abl-1、Bcl2、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、src、以上僅列舉了少數(shù)幾種。本發(fā)明的上下文中，致癌基因也包括染色體易位導(dǎo)致的融合基因，例如，Bcr/Abl融合致癌基因。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，是根據(jù)抑制對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的增殖必不可少的基因表達(dá)的能力選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體?？梢圆捎眠@種RNAi構(gòu)建體作為針對(duì)體內(nèi)贅生的、未分化的和/或增生性細(xì)胞生長(zhǎng)的治療或預(yù)防的一部分，包括作為腫瘤治療的一部分。c-myc蛋白質(zhì)在多種形式的癌癥中不受調(diào)節(jié)，導(dǎo)致表達(dá)增加。體外c-myc RNA水平的降低將誘導(dǎo)凋亡。因此互補(bǔ)于c-myc的siRNA可能可以被用作抗癌癥治療的治療劑。優(yōu)選地，可將本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體應(yīng)用在慢性淋巴細(xì)胞性白血病的治療中。慢性淋巴細(xì)胞性白血病通常是由于染色體9和12易位產(chǎn)生Bcr/Abl融合產(chǎn)物導(dǎo)致的。所獲得的融合蛋白被用作致癌基因；因此，對(duì)Bcr/Abl融合mRNA的特異性排除便可能導(dǎo)致白血病細(xì)胞的死亡。實(shí)際上，將特異于Bcr/Abl融合mRNA的siRNA分子轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)的白血病細(xì)胞中，不僅可以減少融合mRNA及相應(yīng)的腫瘤蛋白，還可以誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡(見，例如Wilda et al.，Oncogene，2002，215716-5724)。
另一些實(shí)施方案中，是根據(jù)抑制對(duì)淋巴細(xì)胞的活化，如B細(xì)胞或T細(xì)胞的增殖，尤其是抗原介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化必不可少的基因表達(dá)的能力選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體?？刹捎眠@種RNAi構(gòu)建體作為免疫抑配方，如作為對(duì)免疫介導(dǎo)的炎性疾病的治療或預(yù)防的一部分。
某些實(shí)施方案中，可應(yīng)用此處描述的方法治療自身免疫疾病。例如，根據(jù)抑制編碼或調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的基因表達(dá)的能力選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體。相應(yīng)地，可以采用導(dǎo)致細(xì)胞因子，如THFα、IL-1α、IL-6或IL-12或其組合的表達(dá)受抑制或減少的構(gòu)建體作為治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一部分。類似地，可以將導(dǎo)致炎癥所涉及細(xì)胞因子表達(dá)受抑制或減少的構(gòu)建體應(yīng)用在炎癥和炎癥相關(guān)疾病，如多發(fā)性硬化的治療或預(yù)防中。
另一些實(shí)施方案中，根據(jù)抑制糖尿病發(fā)作或進(jìn)行所牽涉基因表達(dá)的能力選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體。例如，實(shí)驗(yàn)性糖尿病被發(fā)現(xiàn)與腎小球肥大所涉及的p21WAF1/CIP1(p21)和TGF-β1表達(dá)增加相關(guān)(見例如Al-Douahji，et al.Kidney Int.561691-1699)。相應(yīng)地，可以將導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)表達(dá)受抑制或減少的構(gòu)建體應(yīng)用在糖尿病的治療或預(yù)防中。
另一些實(shí)施方案中，根據(jù)抑制ICAM-1(細(xì)胞內(nèi)粘附分子)表達(dá)的能力選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體。抑制ICAM-1表達(dá)的反義核酸是由Isispharmaceutics公司針對(duì)牛皮癬研發(fā)的。另外，針對(duì)ICAM-1基因的反義核酸被認(rèn)為可以預(yù)防急性腎衰竭和再灌注損傷，并延長(zhǎng)腎臟同基因移植的存活期(見例如，Haller et al.(1996)Kidney Int.50473-80；Dragun et al.(1998)Kidney Int.54590-602；Dragun et al.(1998)Kidney Int.542113-22)。相應(yīng)地，本發(fā)明考慮了RNAi構(gòu)建體在上述疾病中的用途。
另一些實(shí)施方案中，根據(jù)抑制對(duì)平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮的其它細(xì)胞增殖，諸如新內(nèi)膜形成涉及的增殖細(xì)胞必不可少的基因表達(dá)的能力選擇本發(fā)明的RNAi構(gòu)建體。這些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可作為治療或預(yù)防再狹窄的一部分。
僅舉例說明，于血管成形術(shù)后應(yīng)用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的RNAi構(gòu)建體可以在手術(shù)后減少這些細(xì)胞的增殖。僅舉例說明，特定實(shí)例是互補(bǔ)于c-myc(一種致癌基因)的siRNA。c-myc的下調(diào)抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，可以通過合成下列寡核苷酸制備siRNA5′-UCCCGCGACGAUGCCCCUCATT-3′3′-TTAGGGCGCUGCUACGGGGAGU-5′除了粗體顯示的脫氧核糖核酸，即胸腺嘧啶核苷以外，所有堿基均為核糖核酸(為了更高的穩(wěn)定性)。通過將等摩爾濃度的寡核苷酸混合在含10mM Tris-Cl(pH7.0)和20mM NaCl的溶液中，加熱至95℃后，然后緩慢冷卻至37℃，便可獲得雙鏈RNA。繼而通過瓊脂糖凝膠電泳可以純化所獲siRNA，并將其送遞至游離的或者與送遞體系，諸如基于環(huán)糊精的聚合物復(fù)合的細(xì)胞。對(duì)體外實(shí)驗(yàn)而言，通過生長(zhǎng)曲線分析、RT-PCR或?qū)-myc蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析可以監(jiān)測(cè)siRNA的效果。
已證實(shí)直接針對(duì)c-myc基因的反義寡脫氧核苷酸，當(dāng)于冠狀支架移植之后被立即局部送遞時(shí)，能夠抑制再狹窄(見例如Kutryk et al.(2002)J Am Coll Cardiol.39281-287；Kipshidze et al.(2002)J Am Coll Cardiol.391686-1691)。因此，本發(fā)明者慮將針對(duì)c-Myc基因的RNAi構(gòu)建體(即c-Myc RNAi構(gòu)建體)連同滲透物送遞體系送遞至支架移植位點(diǎn)(Interventional Technologies，San Diego，California)。優(yōu)選地，將該c-Myc RNAi構(gòu)建體直接涂布在支架上，以抑制再狹窄。類似地，可以局部送遞c-Myc RNAi構(gòu)建體，以抑制經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管形成術(shù)(PTCA)之后出現(xiàn)的肌內(nèi)膜增生，這種局部送遞的典型方法在例如Kipshidze et al.(2001)Catheter CardiovascInterv.54247-56中有所描述。優(yōu)選的，采用例如硫代磷酸酯或氨基磷酸酯化學(xué)修飾RNAi構(gòu)建體。
早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(即Egr-1)是于機(jī)械性損傷期間被激活，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移所涉及的許多基因的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。因此，該蛋白質(zhì)的下調(diào)也可能是預(yù)防再狹窄的途徑。通過合成下列寡核苷酸可以制備針對(duì)Egr-1的siRNA5′-UCGUCCAGGAUGGCCGCGGTT-3′3′-TTAGCAGGUCCUACCGGCGCC-5′同樣，除了粗體顯示的脫氧核糖核酸，即胸腺嘧啶核苷以外，所有堿基均為核糖核酸。從這些寡核苷酸便可制備siRNA，并如上所述將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。
實(shí)施例上文一般性地描述了本發(fā)明，參考下述實(shí)施例便可以更容易地理解本發(fā)明，將這些實(shí)施例包括在內(nèi)僅為例證本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
1.編碼siRNA的質(zhì)粒DNA的體外送遞將人類胚胎腎細(xì)胞(HEK 293-EcR)以每孔200,000個(gè)細(xì)胞接種進(jìn)6孔培養(yǎng)板中。這些HEK 293-EcR細(xì)胞已經(jīng)由編碼蛻皮激素受體的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。2-3天后，采用pIND-rev-GFP(一種編碼可誘導(dǎo)元件以及綠色熒光蛋白質(zhì)的質(zhì)粒)和pTZU6+1/siRNA(一種編碼siRNA寡核苷酸的有義和反義鏈的質(zhì)粒)共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。于0.5ml opti-MEM中，以15N/P的比例將該質(zhì)粒(見Lee et al.(2002)Nature Biotechnology，20500-505)與支鏈PEI25k-hi-CD聚合物(高環(huán)糊精接枝度)復(fù)合。4小時(shí)后，以2ml完全培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基。第24小時(shí)，由5μM松甾酮A誘導(dǎo)細(xì)胞，以誘導(dǎo)GFP靶細(xì)胞表達(dá)。第72小時(shí)，通過versene移出細(xì)胞，將其收集，并通過流式細(xì)胞儀分析其GFP表達(dá)。如圖1所示，siRNA的轉(zhuǎn)染以劑量依賴方式下調(diào)GFP表達(dá)。采用2微克siRNA時(shí)，觀測(cè)到GFP表達(dá)下降大約50％，而當(dāng)采用4微克siRNA時(shí)，則觀測(cè)到GFP表達(dá)下降大約40％。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，借助于β環(huán)糊精聚合物可以成功地將RNAi構(gòu)建體送遞進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞中，并通過RNA干擾機(jī)制減弱基因表達(dá)。
2.體外的DNA質(zhì)粒送遞與熒光素酶表達(dá)將BHK-21細(xì)胞接種進(jìn)24孔培養(yǎng)板中，并于無血清條件下，采用以多種不同配比與β環(huán)糊精聚合物(βCDPs)復(fù)合的1μg pGL3-CV質(zhì)粒(一種含熒光素酶基因的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染。通過對(duì)熒光素酶蛋白質(zhì)活性的檢定以確定轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果用相對(duì)光單位(RLUs)表示(見圖2)。以轉(zhuǎn)染后48小時(shí)所獲得細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)量衡量細(xì)胞存活力。通過Biorad’s DC蛋白分析(Hercules，CA)確定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平，并采用由裸DNA轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)裂解緩沖液中的牛IgG(Biorad)的不同濃度標(biāo)繪出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過調(diào)節(jié)β環(huán)糊精聚合物與RNAi構(gòu)建體之間的配比可以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率。
3.小鼠體內(nèi)的DNA質(zhì)粒送遞及熒光素酶表達(dá)除了DNA是通過0.2μm濾器過濾除菌，并于使用前凍干以外，其它材料不變。于10％葡萄糖中制備線性環(huán)糊精聚合物，并將其添加至等體積含pGL3-CV質(zhì)粒(一種含熒光素酶基因的質(zhì)粒)的水中，使最終溶液為5％葡萄糖溶液。制備5+/-的粒子，且最終DNA濃度為0.5mg/mL。采用200μL含100μg熒光素酶DNA的聚合物溶液經(jīng)由門靜脈注射進(jìn)雌性Balb/C小鼠體內(nèi)。DNA給藥4小時(shí)后，麻醉小鼠，將熒光素注射進(jìn)其腹膜內(nèi)腔，并利用Xenogen照相機(jī)成像以獲得熒光素酶蛋白質(zhì)活性。質(zhì)粒給藥后4小時(shí)內(nèi)，在肝臟內(nèi)觀測(cè)到熒光素酶表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)與β環(huán)糊精聚合物復(fù)合的RNAi構(gòu)建體可以被送遞進(jìn)體內(nèi)(如小鼠體內(nèi))。
4.siRNA寡核苷酸的體外送遞將人類急性白血病K562懸浮細(xì)胞(具有p210Bcr-Abl融合物的內(nèi)源表達(dá))以每孔1,000,000個(gè)細(xì)胞接種進(jìn)每孔含0.5ml opti-MEM的6孔培養(yǎng)板中。多聚體是采用0.25ml opti-MEM中的2μM dsRNA(DharmaconResearch，Inc.)與也在0.25ml opti-MEM中的線性PEI-hi-CD聚合物，以15N/P的比例形成。下列dsRNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)成可以識(shí)別Bcr-Abl融合體mRNA剪接物1靶5′-GCAGAGUUCAAAAGCCCUUdTdT-3′3′-dTdTCGUCUCAAGUUUUCGGGAA-5′將0.5ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基添加在0.5ml細(xì)胞中。4小時(shí)后，每孔補(bǔ)充4ml完全培養(yǎng)基。第48小時(shí)，收集細(xì)胞，洗滌，并裂解。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并將20μg蛋白質(zhì)上樣至SDS-PAGE凝膠中，開始電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，由1％BSA封閉，并由抗Bcr抗體印跡。通過化學(xué)發(fā)光(Amersham)檢測(cè)p210信號(hào)，并通過與未經(jīng)處理樣品比較，條帶強(qiáng)度的降低以觀測(cè)下調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)被配制在超分子復(fù)合物(如β環(huán)糊精聚合物)中的siRNA可以被送遞并用于急性白血病的基因治療。
5.小鼠體內(nèi)的DNA酶送遞將采用250μL含1mg熒光標(biāo)記DNA酶的D5W配制的粒子注射進(jìn)攜帶瘤裸鼠體內(nèi)。配方含有如上所述[Bellocq，2002#459]的CD聚合物、AD-PEG和AD-PEG-轉(zhuǎn)鐵蛋白(用于靶定腫瘤)。注射后24小時(shí)處死小鼠，并通過熒光立體顯微鏡分析所提取的腫瘤。細(xì)胞內(nèi)DNA酶定位是通過共焦顯微鏡肉眼觀察。越過腫瘤冠而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的穿透是借助于轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的粒子才實(shí)現(xiàn)的。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)β環(huán)糊精聚合物可以被用于體內(nèi)送遞其它表達(dá)構(gòu)建體(如DNA酶)，以進(jìn)行基因治療。
6.小鼠體內(nèi)的長(zhǎng)RNA送遞除了RNA是通過0.2μm濾器過濾除菌，并于使用前凍干以外，其它材料不變。于10％葡萄糖中制備線性環(huán)糊精聚合物，并將其添加至等體積含熒光素酶RNA的水中，使最終溶液為5％葡萄糖溶液。制備5+/-的粒子，且最終RNA濃度為0.5mg/mL。將200μL含100μg熒光素酶RNA的聚合物溶液經(jīng)由門靜脈注射進(jìn)雌性Balb/C小鼠體內(nèi)。RNA給藥4小時(shí)后，麻醉小鼠，將熒光素注射進(jìn)其腹膜內(nèi)腔，并利用Xenogen照相機(jī)成像以獲得熒光素酶蛋白質(zhì)活性。熒光素酶RNA給藥后4小時(shí)內(nèi)，在肝臟內(nèi)觀測(cè)到熒光素酶表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)與β環(huán)糊精聚合物復(fù)合的長(zhǎng)RNA可以被送遞進(jìn)體內(nèi)(如小鼠體內(nèi))。
權(quán)利要求
1.一種包含RNAi構(gòu)建體的穩(wěn)定呼吸配方，該RNAi構(gòu)建體被配制為用于將治療有效量的RNAi構(gòu)建體通過肺部或鼻部送遞至患者肺部。
2.權(quán)利要求1的配方，其中RNAi構(gòu)建體被配制為平均直徑小于20微米的微粒。
3.權(quán)利要求2的配方，其中微粒的平均直徑為0.5-10微米。
4.權(quán)利要求2的配方，其中微粒由生物可降解聚合物形成。
5.權(quán)利要求2的配方，其中微粒由選自多糖、二酮哌嗪、聚羥酸、聚酐、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷撐、聚乙烯基化合物、聚硅氧烷、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物、聚氨酯、纖維素、聚丁酸、聚戊酸、聚(交酯-共-己內(nèi)酯)或其共聚物中的一種或多種聚合物形成。
6.權(quán)利要求2的配方，其中微粒是通過溶劑蒸發(fā)、噴霧干燥、溶劑萃取或熱融封裝的方法形成。
7.權(quán)利要求2的配方，其中微粒為干燥或凍干形式。
8.權(quán)利要求1或2的配方，其中RNAi構(gòu)建體被配制為包括多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子復(fù)合物。
9.權(quán)利要求8的配方，其中超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成。
10.權(quán)利要求9的配方，其中陽離子聚合物選自聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
11.權(quán)利要求8的配方，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成。
12.權(quán)利要求11的配方，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚氮丙啶形成，且具有下式的結(jié)構(gòu) 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
13.權(quán)利要求1或2的配方，其中RNAi構(gòu)建體被配制在脂質(zhì)體中。
14.權(quán)利要求1的配方，包括推進(jìn)劑。
15.權(quán)利要求1的配方，被容納在計(jì)量劑量吸入器、干粉吸入器或噴氣式霧化器內(nèi)。
16.權(quán)利要求1的配方，其中RNAi構(gòu)建體的配制量以1-10個(gè)計(jì)量劑量提供治療有效量。
17.權(quán)利要求1的配方，其中RNAi構(gòu)建體包括對(duì)磷酸-糖主鏈或核苷的修飾。
18.權(quán)利要求17的配方，其中RNAi構(gòu)建體包括選自硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合膦酸甲酯-磷酸二酯、肽核酸以及含5-丙炔基-嘧啶的寡聚物的主鏈修飾。
19.一種計(jì)量劑量氣溶膠分配器，含有用于肺部或鼻部送遞的、包含RNAi構(gòu)建體的可呼吸配方的氣溶膠藥物組合物。
20.一種實(shí)現(xiàn)RNAi構(gòu)建體的全身給藥的方法，該方法包括通過肺部給藥方式，將RNAi構(gòu)建體的可呼吸配方給予患者，其中該RNAi構(gòu)建體被深肺部吸收的量可實(shí)現(xiàn)該RNAi構(gòu)建體全身劑量的送遞。
21.一種包含權(quán)利要求1的配方，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑。
22.權(quán)利要求21的藥物制劑，其中藥學(xué)可接受載體選自藥學(xué)可接受鹽、酯、及這些酯的鹽。
23.一種包含權(quán)利要求21的藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝。
24.一種組合物，包含一種或多種被配制在超分子復(fù)合物中，且配制量足以通過RNA干擾機(jī)制減弱所處理細(xì)胞中靶基因的表達(dá)的RNAi構(gòu)建體。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中siRNA的長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
27.權(quán)利要求24的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
28.權(quán)利要求24的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
29.權(quán)利要求24的組合物，用于處理體內(nèi)細(xì)胞。
30.權(quán)利要求24的組合物，用于處理體外細(xì)胞。
31.權(quán)利要求24-28中任意一項(xiàng)的組合物，其中超分子復(fù)合物為包括線性聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
32.權(quán)利要求24-28中任意一項(xiàng)的組合物，其中超分子復(fù)合物為包括支鏈聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
33.權(quán)利要求24的組合物，其中超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中陽離子聚合物選自聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
35.權(quán)利要求24的組合物，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚氮丙啶形成，且具有下式的結(jié)構(gòu) 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
37.權(quán)利要求24-36中任意一項(xiàng)的組合物，聚集為平均直徑為20-500nm的粒子。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中粒子的平均直徑為20-200nm。
39.一種減弱體內(nèi)細(xì)胞靶基因表達(dá)的方法，該方法包括給予被配制在超分子復(fù)合物中的RNAi構(gòu)建體，給藥量足以通過RNA干擾機(jī)制減弱靶基因的表達(dá)，從而改變所處理細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化。
40.權(quán)利要求39的方法，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中siRNA的長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
42.權(quán)利要求39的方法，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
43.權(quán)利要求39的方法，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
44.權(quán)利要求39的方法，用于處理體內(nèi)細(xì)胞。
45.權(quán)利要求39的方法，用于處理體外細(xì)胞。
46.權(quán)利要求39-43中任意一項(xiàng)的方法，其中超分子復(fù)合物為包括線性聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
47.權(quán)利要求39-43中任意一項(xiàng)的方法，其中超分子復(fù)合物為包括支鏈聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
48.權(quán)利要求39的方法，其中超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成。
49.權(quán)利要求48的方法，其中陽離子聚合物選自聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
50.權(quán)利要求39的方法，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成。
51.權(quán)利要求50的方法，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚氮丙啶形成，且具有下式的結(jié)構(gòu) 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
52.權(quán)利要求39-51中任意一項(xiàng)的方法，其中超分子復(fù)合物聚集為平均直徑為0.5-200微米的粒子。
53.權(quán)利要求52的方法，其中粒子的平均直徑為0.5-10微米。
54.一種包含權(quán)利要求39-43的組合物，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑。
55.權(quán)利要求54的藥物制劑，其中藥學(xué)可接受載體包括或多種可接受鹽、酯和這些酯的鹽中的一種或多種。
56.一種包含權(quán)利要求54的藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝。
57.一種被應(yīng)用于醫(yī)用裝置表面的涂層，該涂層包含內(nèi)部分散有RNAi構(gòu)建體的聚合物基質(zhì)，當(dāng)被植入患者體內(nèi)的位點(diǎn)時(shí)，RNAi構(gòu)建體從基質(zhì)內(nèi)釋放，并改變植入的裝置附近細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化。
58.權(quán)利要求57的涂層，其中醫(yī)用裝置選自螺釘、板片、墊圈、縫合線、假體錨定裝置、平頭釘、卡釘、電導(dǎo)聯(lián)、瓣膜、膜、導(dǎo)管、可植入血管通路端口、儲(chǔ)血袋、輸血管、中央靜脈導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管、血管植入物、主動(dòng)脈內(nèi)球囊泵、心臟瓣膜、心血管縫合線、人造心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析組件、血液灌注組件、血漿置換組件以及適于血管內(nèi)展開的濾器。
59.權(quán)利要求57的涂層，其中醫(yī)用裝置為支架。
60.權(quán)利要求60的涂層，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
61.權(quán)利要求60的涂層，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
62.權(quán)利要求57的涂層，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
63.權(quán)利要求57的涂層，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
64.權(quán)利要求57的涂層，其中RNAi構(gòu)建體減弱選自細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、c-myb、c-myc、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、BRCA、Bcl-2、VEGF、MDR、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、IRE、C-fos、HSP27、C-raf及金屬硫蛋白基因中至少一種靶基因的表達(dá)。
65.一種采用一種或多種RNAi構(gòu)建體涂布醫(yī)用裝置的方法，該方法包括a)配制用于涂布裝置表面的RNAi構(gòu)建體，使得該裝置被植入患者體內(nèi)的位點(diǎn)時(shí)，該RNAi構(gòu)建體從表面釋放；及b)將配制的RNAi構(gòu)建體涂布在醫(yī)用裝置表面，其中涂布有RNAi構(gòu)建體的醫(yī)用裝置減弱了植入的裝置附近細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。
66.權(quán)利要求65的方法，其中醫(yī)用裝置選自螺釘、板片、墊圈、縫合線、假體錨定裝置、平頭釘、卡釘、電導(dǎo)聯(lián)、瓣膜、膜、導(dǎo)管、可植入血管通路端口、儲(chǔ)血袋、輸血管、中央靜脈導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管、血管植入物、主動(dòng)脈內(nèi)球囊泵、心臟瓣膜、心血管縫合線、人造心臟、起搏器、心室輔助泵、體外裝置、血液濾器、血液透析組件、血液灌注組件、血漿置換組件以及適于血管內(nèi)展開的濾器。
67.權(quán)利要求65的方法，其中醫(yī)用裝置為支架。
68.權(quán)利要求65的方法，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
69.權(quán)利要求68的方法，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
70.權(quán)利要求65的方法，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
71.權(quán)利要求65的方法，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
72.權(quán)利要求65的方法，其中RNAi構(gòu)建體減弱選自細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、c-myb、c-myc、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、BRCA、Bcl-2、VEGF、MDR、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、IRE、C-fos、HSP27、C-raf及金屬硫蛋白基因中至少一種靶基因的表達(dá)。
73.權(quán)利要求65的方法，其中RNAi構(gòu)建體減弱基因表達(dá)，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖和/或遷移減少。
74.一種包含一種或多種RNAi構(gòu)建體的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被配制為用于經(jīng)皮心包內(nèi)送遞至動(dòng)物。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中RNAi構(gòu)建體減弱基因表達(dá)，導(dǎo)致梗塞心肌內(nèi)及周圍的血管產(chǎn)生增加并/或減少局部缺血性損傷。
76.權(quán)利要求74的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為全身可利用的，并減弱心包腔遠(yuǎn)端細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。
77.權(quán)利要求73的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被配制為包括多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子復(fù)合物。
78.權(quán)利要求77的組合物，其中超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成。
79.權(quán)利要求78的組合物，其中陽離子聚合物選自聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
80.權(quán)利要求77的組合物，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚氮丙啶形成，且具有下式的結(jié)構(gòu) 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
82.權(quán)利要求73的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合。
83.權(quán)利要求82的組合物，其中脂質(zhì)體是由陽離子囊泡形成脂質(zhì)所形成的陽離子脂質(zhì)體。
84.權(quán)利要求82的組合物，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
85.權(quán)利要求73的組合物，其中動(dòng)物為人類。
86.權(quán)利要求73的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
87.權(quán)利要求86的組合物，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
88.權(quán)利要求73的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
89.權(quán)利要求73的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
90.一種用于經(jīng)皮心包內(nèi)體內(nèi)送遞一種或多種RNAi構(gòu)建體的方法，該方法包括將RNAi構(gòu)建體配方給藥至動(dòng)物的心包腔，其中存在的RNAi構(gòu)建體的量足以減弱所治療動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)。
91.權(quán)利要求90的方法，其中心包腔被用作RNAi構(gòu)建體的送遞貯存處。
92.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體被局部送遞至心臟及其周圍血管系統(tǒng)中。
93.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于減少平滑肌細(xì)胞的增殖和/或遷移。
94.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療心肌梗塞。
95.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體被配制為包括多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子復(fù)合物。
96.權(quán)利要求95的方法，其中超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成。
97.權(quán)利要求96的方法，其中陽離子聚合物選自聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
98.權(quán)利要求95的方法，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成。
99.權(quán)利要求98的方法，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚氮丙啶形成，且具有下式的結(jié)構(gòu) 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
100.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合。
101.權(quán)利要求100的方法，其中脂質(zhì)體是由陽離子囊泡形成脂質(zhì)所形成的陽離子脂質(zhì)體。
102.權(quán)利要求100的方法，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
103.權(quán)利要求90的方法，其中動(dòng)物為人類。
104.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
105.權(quán)利要求104的方法，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
106.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
107.權(quán)利要求90的方法，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
108.一種包含權(quán)利要求90的組合物，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑。
109.權(quán)利要求108的藥物制劑，其中藥學(xué)可接受載體包括或多種可接受鹽、酯和這些酯的鹽中的一種或多種。
110.一種包含權(quán)利要求108的藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝。
111.一種包含一種或多種被配制在脂質(zhì)體中的RNAi構(gòu)建體的組合物，用于通過RNA干擾機(jī)制減弱體內(nèi)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。
112.權(quán)利要求111的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
113.權(quán)利要求112的組合物，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
114.權(quán)利要求111的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
115.權(quán)利要求111的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
116.權(quán)利要求111的組合物，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
117.權(quán)利要求116的組合物，其中細(xì)胞為人類細(xì)胞。
118.權(quán)利要求111的組合物，其中脂質(zhì)體為包括陽離子囊泡形成脂質(zhì)的陽離子脂質(zhì)體。
119.權(quán)利要求111的組合物，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
120.一種減弱患者細(xì)胞中靶基因的表達(dá)的方法，該方法包括將被配制在脂質(zhì)體中的RNAi構(gòu)建體給予患者，給藥量足以通過RNA干擾機(jī)制減弱靶基因的表達(dá)，從而改變所述細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化。
121.權(quán)利要求120的方法，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
122.權(quán)利要求121的方法，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
123.權(quán)利要求120的方法，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
124.權(quán)利要求120的方法，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
125.權(quán)利要求120的方法，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
126.權(quán)利要求125的方法，其中細(xì)胞為人類細(xì)胞。
127.權(quán)利要求120的方法，其中脂質(zhì)體為包括陽離子囊泡形成脂質(zhì)的陽離子脂質(zhì)體。
128.權(quán)利要求120的方法，其中脂質(zhì)體的平均直徑小于大約200nm。
129.一種包含權(quán)利要求111的組合物，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑。
130.權(quán)利要求129的藥物制劑，其中藥學(xué)可接受載體包括或多種可接受鹽、酯和這些酯的鹽中的一種或多種。
131.一種包含權(quán)利要求129的藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝。
132.一種包含一種或多種RNAi構(gòu)建體的組合物，該RNAi構(gòu)建體被配制用于電穿孔進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞。
133.權(quán)利要求132的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物或脂質(zhì)體中。
134.權(quán)利要求132的組合物，其中細(xì)胞為上皮細(xì)胞。
135.權(quán)利要求132的組合物，其中細(xì)胞為肌細(xì)胞。
136.一種通過電穿孔將一種或多種RNAi構(gòu)建體送遞給患者的方法，該方法包括通過電穿孔將足量的RNAi構(gòu)建體給予動(dòng)物，其中RNAi構(gòu)建體減弱患者體內(nèi)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。
137.權(quán)利要求136的方法，其中RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物或脂質(zhì)體中。
138.權(quán)利要求136的方法，其中細(xì)胞為上皮細(xì)胞。
139.權(quán)利要求136的方法，其中細(xì)胞為肌細(xì)胞。
140.一種包含權(quán)利要求132的組合物，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑。
141.權(quán)利要求140的藥物制劑，其中藥學(xué)可接受載體包括或多種可接受鹽、酯和這些酯的鹽中的一種或多種。
142.一種包含權(quán)利要求140的藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書(文字和/或圖示)的藥物包裝。
143.一種包含一種或多種配制的RNAi構(gòu)建體的組合物，用于抑制體內(nèi)不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)，其中通過RNA干擾機(jī)制，RNAi構(gòu)建體減少了對(duì)細(xì)胞有絲分裂和/或阻止該細(xì)胞凋亡而言必不可少的靶基因的表達(dá)。
144.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
145.權(quán)利要求144的組合物，其中siRNA長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
146.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
147.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
148.權(quán)利要求146的組合物，其中表達(dá)載體選自附加型表達(dá)載體、整合表達(dá)載體或病毒表達(dá)載體。
149.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體抑制細(xì)胞的增殖。
150.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
151.權(quán)利要求143的組合物，其中靶基因?yàn)橹掳┗颉?br> 152.權(quán)利要求151的組合物，其中致癌基因選自c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I、Abl-1、Bcl2、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、src或Bcr/Abl融合基因。
153.權(quán)利要求143、149和150的任意一項(xiàng)的組合物，其中細(xì)胞為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
154.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療增生性細(xì)胞生長(zhǎng)。
155.權(quán)利要求154的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療癌癥。
156.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于抑制淋巴細(xì)胞的活化。
157.權(quán)利要求156的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療或預(yù)防免疫介導(dǎo)的炎性疾病。
158.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。
159.權(quán)利要求158的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療或預(yù)防再狹窄。
160.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于抑制上皮細(xì)胞的增殖。
161.權(quán)利要求160的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被用于化妝品制劑。
162.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物中。
163.權(quán)利要求162的組合物，其中超分子復(fù)合物包含至少一種聚合物。
164.權(quán)利要求163的組合物，其中聚合物為含環(huán)糊精的聚合物。
165.權(quán)利要求143的組合物，其中RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合。
166.權(quán)利要求165的組合物，其中脂質(zhì)體為由陽離子囊泡形成脂質(zhì)形成的陽離子脂質(zhì)體。
167.權(quán)利要求165的組合物，其中與RNAi構(gòu)建體復(fù)合的脂質(zhì)體具有典型地小于大約200nm的基本均一尺寸。
168.權(quán)利要求143的組合物，其中動(dòng)物為人類。
169.一種抑制體內(nèi)不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括給予動(dòng)物足量的配制的RNAi構(gòu)建體，其中通過RNA干擾機(jī)制，RNAi構(gòu)建體減少了對(duì)細(xì)胞有絲分裂和/或阻止該細(xì)胞凋亡而言必不可少的靶基因的表達(dá)。
170.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體為小的干擾RNA(siRNA)。
171.權(quán)利要求170的方法，其中RNAi構(gòu)建體長(zhǎng)度為19-30個(gè)堿基對(duì)。
172.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體為具有編碼序列的表達(dá)載體，所述編碼序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種或多種在所處理細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
173.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體為在所處理細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA的發(fā)夾RNA。
174.權(quán)利要求172的方法，其中表達(dá)載體選自附加型表達(dá)載體、整合表達(dá)載體或病毒表達(dá)載體。
175.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體抑制細(xì)胞的增殖。
176.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
177.權(quán)利要求169的方法，其中靶基因?yàn)橹掳┗颉?br> 178.權(quán)利要求169的方法，其中致癌基因選自c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I、Abl-1、Bcl2、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、src和Bcr/Abl融合基因之一。
179.權(quán)利要求169、175和176的任意一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
180.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療增生性細(xì)胞生長(zhǎng)。
181.權(quán)利要求180的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療癌癥。
182.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于抑制淋巴細(xì)胞的活化。
183.權(quán)利要求182的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療或預(yù)防免疫介導(dǎo)的炎性疾病。
184.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。
185.權(quán)利要求184的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于治療或預(yù)防再狹窄。
186.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于抑制上皮細(xì)胞的增殖。
187.權(quán)利要求186的方法，其中RNAi構(gòu)建體被用于化妝品制劑。
188.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體被配制在超分子復(fù)合物中。
189.權(quán)利要求188的方法，其中超分子復(fù)合物包含至少一種聚合物。
190.權(quán)利要求189的方法，其中聚合物為含環(huán)糊精的聚合物。
191.權(quán)利要求169的方法，其中RNAi構(gòu)建體被封裝于脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體締合。
192.權(quán)利要求191的方法，其中脂質(zhì)體為由陽離子囊泡形成脂質(zhì)形成的陽離子脂質(zhì)體。
193.權(quán)利要求191的方法，其中與RNAi構(gòu)建體復(fù)合的脂質(zhì)體具有典型地小于大約200nm的基本均一尺寸。
194.權(quán)利要求169的方法，其中動(dòng)物為人類。
195.一種包含權(quán)利要求143的組合物，以及藥學(xué)可接受載體的藥物制劑。
196.權(quán)利要求195的藥物制劑，其中藥學(xué)可接受載體選自藥學(xué)可接受鹽、酯和這些酯的鹽。
197.一種包含權(quán)利要求195的藥物制劑，以及指導(dǎo)將該制劑給予人類患者的說明書的藥物包裝。
198.一種包含權(quán)利要求143的組合物的化妝品制劑，其中RNAi構(gòu)建體抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化。
199.一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，該方法包括給予體內(nèi)靶細(xì)胞雙鏈RNA，或可轉(zhuǎn)錄具有足夠長(zhǎng)度以激活靶細(xì)胞中PKR應(yīng)答的雙鏈RNA的表達(dá)載體，該雙鏈RNA被配制為超分子復(fù)合物的一部分。
200.權(quán)利要求199的方法，其中雙鏈RNA的長(zhǎng)度超過35個(gè)堿基對(duì)。
201.權(quán)利要求200的方法，其中雙鏈RNA超過75個(gè)核苷酸。
202.權(quán)利要求199的方法，其中靶細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
203.權(quán)利要求199的方法，其中靶細(xì)胞為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
204.權(quán)利要求199-203中任意一項(xiàng)的方法，其中超分子復(fù)合物為包括線性聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
205.權(quán)利要求199-203中任意一項(xiàng)的方法，其中超分子復(fù)合物為包括支鏈聚合物的多維聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
206.權(quán)利要求199的方法，其中超分子復(fù)合物由陽離子聚合物形成。
207.權(quán)利要求206的方法，其中陽離子聚合物選自聚(L)賴氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β環(huán)糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。
208.權(quán)利要求199的方法，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚合物形成。
209.權(quán)利要求208的方法，其中超分子復(fù)合物由環(huán)糊精改性的聚氮丙啶形成，且具有下式的結(jié)構(gòu) 其中對(duì)每種情況而言，R獨(dú)立代表H、低級(jí)烷基、環(huán)糊精部分或 且對(duì)每種情況而言，m獨(dú)立代表2-10,000，優(yōu)選10-5,000，或者100-1,000中的一個(gè)整數(shù)。
210.一種進(jìn)行藥品商業(yè)的方法，該方法包括a)鑒定抑制體內(nèi)靶細(xì)胞增殖，并減小涉及不希望的靶細(xì)胞增殖的疾病的影響的RNAi構(gòu)建體；b)進(jìn)行步驟a)中所鑒定的RNAi構(gòu)建體的效力及毒性的治療特征分析；及c)配制包含一種或多種經(jīng)步驟b)鑒定為具有可接受治療特征的RNAi構(gòu)建體的藥物制劑。
211.權(quán)利要求210的方法，包括建立將該藥物制劑分裝以用于銷售的分裝系統(tǒng)，并(任選地)建立營銷該藥物制劑的銷售團(tuán)體的補(bǔ)充步驟。
212.一種進(jìn)行藥品商業(yè)的方法，該方法包括a)鑒定抑制體內(nèi)靶細(xì)胞增殖，并減小涉及不希望的靶細(xì)胞增殖的疾病的影響的RNAi構(gòu)建體；b)(任選地)進(jìn)行步驟a)中所鑒定的RNAi構(gòu)建體的效力及毒性的治療特征分析；及c)將進(jìn)一步開發(fā)RNAi構(gòu)建體的權(quán)利授予第三方。
全文摘要
本發(fā)明提供了減弱體內(nèi)靶基因表達(dá)所用的方法及組合物。通常，該方法包括以足以通過RNA干擾機(jī)制，如以序列依賴性、PKR不依賴性的方式減弱靶基因表達(dá)的量給予RNAi構(gòu)建體(如靶定特定mRNA序列的小的干擾RNA(即siRNA)，或可于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA的核酸物質(zhì))。特別是該方法可被用于改變細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活或分化，從而達(dá)到治療和美容的目的。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1771255SQ02826662
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2002年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者M·E·達(dá)維斯, G·S·詹森, S·H·潘 申請(qǐng)人:嵌入治療公司