專(zhuān)利名稱(chēng)：伴隨有aop-1基因或aop-1的表達(dá)減少的疾病的治療方法以及該疾病的治療藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到疾病的預(yù)防方法、治療方法或診斷方法、疾病預(yù)防藥或治療藥、與制劑的有效成分有關(guān)的物質(zhì)的篩選方法、非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物以及轉(zhuǎn)化組織。
背景技術(shù)：
很多疾病隨著病態(tài)的進(jìn)展，組織細(xì)胞中發(fā)生代償變化，變成暫時(shí)的平衡狀態(tài)。在病態(tài)進(jìn)一步惡化的過(guò)程中，代償結(jié)構(gòu)出現(xiàn)失敗，細(xì)胞功能降低甚至引起細(xì)胞死亡。由于這樣的細(xì)胞脫落，疾病治愈變得更困難，預(yù)后不良，會(huì)再?gòu)?fù)發(fā)。特別是在以心臟為首的腦、腎臟等自己不能再生臟器的疾病治療中抑制細(xì)胞的壞死脫落是重要的治療方針。
(1)心臟疾病1.心衰竭心衰竭定義為由于心肌收縮力低下，心臟向各個(gè)臟器不能博出充足量的血液的狀態(tài)。作為達(dá)到心衰竭的前階段，心臟為了使全身血液流通保持正常進(jìn)行代償再調(diào)節(jié)。在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，心肌細(xì)胞持續(xù)肥大伸展，心博出壓保持很高水平同時(shí)，保持心博出量，但同時(shí)心組織內(nèi)的纖維化在進(jìn)行，對(duì)收縮細(xì)胞的負(fù)荷增加。對(duì)心肌細(xì)胞的負(fù)荷和由于肥大化引起的代償?shù)钠胶膺_(dá)到極限時(shí)，心功能出現(xiàn)失敗，變成心衰竭。已知處于心衰竭狀態(tài)的心肌細(xì)胞收縮力低下(Am JPhysiol 1997 Vol.273(1 Pt 2)，H183-91)。到目前為止慢性心衰竭治療在心衰竭狀態(tài)，即導(dǎo)致患者正常的日常生活障礙時(shí)起，使用使心肌收縮力增加的洋地黃制劑和黃嘌呤制劑等強(qiáng)心劑。然而人們都清楚，這些藥物由于心肌能量的過(guò)量消耗，長(zhǎng)期服用會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡，使生存率惡化。最近，可使在代償再調(diào)節(jié)期亢進(jìn)的交感神經(jīng)和高血壓蛋白原酶-血管素引起的對(duì)心臟的過(guò)量負(fù)荷減輕的β阻斷劑和ACE抑制劑用于治療正成為主流。然而，不能說(shuō)在作用機(jī)制上具有防止心肌細(xì)胞肥大化的藥物對(duì)所有陷于心衰竭狀態(tài)的患者的治療都有效，在慢性心衰竭預(yù)防劑方面更好。另外這些藥物銷(xiāo)售后也依然不能改善慢性心衰竭患者的長(zhǎng)期生存率的事實(shí)表明這些藥物的作用機(jī)制的局限。因此打破代償期后，就使改善處于慢性心衰竭期的生活質(zhì)量、生存率兩方面的新的慢性心衰竭治療藥的開(kāi)發(fā)成為當(dāng)務(wù)之急。人們期待著對(duì)作為隨著由代償期向衰竭期過(guò)渡引起的失敗機(jī)制的本質(zhì)原因的細(xì)胞死亡、細(xì)胞功能低下進(jìn)行治療的新的治療藥的開(kāi)發(fā)。
2.缺血性心臟病缺血性心臟病是以包括心絞痛和心肌梗塞癥在內(nèi)的冠狀血管性血流不良為特征的疾病類(lèi)。例如，心絞痛被分為安靜性心絞痛和勞作性心絞痛?，F(xiàn)在對(duì)于重癥患者實(shí)施外科手術(shù)，進(jìn)行對(duì)血管實(shí)施物理擴(kuò)張后的移植片固定模留置等。對(duì)于比較輕的患者，作為發(fā)作時(shí)的治療藥使用硝酸藥、硝酸甘油、尼可地爾等血管擴(kuò)張劑。而降低膽固醇制劑以及抗血液凝固劑被用作預(yù)防梗塞目的的處方中。這樣一來(lái)急性期治療和以改善血液循環(huán)為目的的治療方法正被確立。最初發(fā)作被認(rèn)為是起因于由于無(wú)癥狀期的慢性缺血引起的傷害積蓄使得心肌適應(yīng)能力降低。然而現(xiàn)在對(duì)于這一點(diǎn)的治療方法還未確立。另外由心絞痛轉(zhuǎn)向重癥心肌梗塞的患者多，雖然希望對(duì)由于心絞痛發(fā)病引起的大規(guī)模缺血進(jìn)行預(yù)防治療，但適合預(yù)防治療的治療方法還沒(méi)有找到。
(2)神經(jīng)變性疾病神經(jīng)變性疾病是以神經(jīng)細(xì)胞的變性為特征的一類(lèi)疾病，具體來(lái)說(shuō)，如腦梗塞、阿耳茨海默病、帕金森病、頭部外傷、亨廷頓舞蹈病、腦血管性癡呆、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)變性癥、賓斯旺格氏病等的白質(zhì)傷害等。腦梗塞、腦血管性癡呆、頭部外傷、阿耳茨海默病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)變性癥、帕金森病等有共同點(diǎn)作為神經(jīng)遞質(zhì)的谷氨酸在細(xì)胞外濃度過(guò)量上升。(Eur J Neurosci 2000 Vol.12(8)，2735-45)(BrainRes 1994 Vol.11，No.642(1-2)，117-122)(Acta NeurochirSuppl.2000 Vol.76，437-8；Neurosci Lett 2001 Vol.299(1-2)，37-40；J Neurosci Res 2001 Vol.63(5)，377-87；Drugs Aging 2001Vol.18(10)，717-24)。過(guò)量的谷氨酸刺激神經(jīng)細(xì)胞表面的谷氨酸受體(NMDA受體)，誘導(dǎo)神經(jīng)的過(guò)渡興奮。由于過(guò)渡的神經(jīng)興奮誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)離子環(huán)境的破壞，引起細(xì)胞死亡，這種說(shuō)法是有說(shuō)服力的?，F(xiàn)在作為腦梗塞治療劑可以使用抗血小板藥、血栓溶解劑，但由于是以血流的再開(kāi)、維持為目的的，所以具有對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞本身的保護(hù)作用的治療方法還沒(méi)有確立。作為試驗(yàn)階段的治療藥，NMDA受體拮抗藥、谷氨酸釋放抑制劑、活性氧消除劑正在開(kāi)發(fā)中，其有效性還沒(méi)有被確認(rèn)。有關(guān)阿耳茨海默病的治療，最近膽堿酯酶抑制劑被確認(rèn)為是唯一治療劑，其機(jī)制是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞間信息傳遞改善學(xué)習(xí)功能，不是直接抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡。作為對(duì)一系列的神經(jīng)變性疾病的有效治療方法希望開(kāi)發(fā)以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞為作用機(jī)制的治療藥。
(3)風(fēng)濕病風(fēng)濕病中特別是慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)滑膜的連續(xù)增殖為特征的慢性關(guān)節(jié)炎，可以說(shuō)其原因來(lái)自自身免疫作用。人們認(rèn)為除了老化、基因的因素以外，還有復(fù)合生活環(huán)境因素形成的危險(xiǎn)因素，以感染癥為代表的任一種關(guān)節(jié)炎作為開(kāi)端，對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫致敏。就發(fā)展的慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎來(lái)說(shuō)有報(bào)道認(rèn)為在軟骨破壞、骨破壞的同時(shí)，成軟骨細(xì)胞死亡、成骨細(xì)胞死亡(Arthritis Rheum 1999Vol.42(7)，1528-37；Z Rheumatol 2000 Vol.59，Suppl.1，10-20)。認(rèn)為由于成軟骨細(xì)胞死亡、成骨細(xì)胞死亡引起的疾病是進(jìn)入到不可逆的階段?，F(xiàn)在利用類(lèi)固醇、非類(lèi)固醇制劑實(shí)施以免疫抑制作用作為基礎(chǔ)的治療，但該治療效果不持續(xù)，不能根治。因此，希望開(kāi)發(fā)以保護(hù)關(guān)節(jié)、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞為機(jī)制的新的治療劑。
(4)腎病腎病中特別是慢性腎衰竭是以腎臟內(nèi)的腎小球、腎小管的傷害為特征的疾病，具體來(lái)說(shuō)，可舉出糖尿病性腎病、高血壓性腎病、狼瘡性腎病等。作為具有過(guò)濾血液中廢物功能的腎小球和從尿中再吸收為其功能的腎小管中功能發(fā)生異常的原因可以舉出由于高血糖引起的糖化蛋白造成的細(xì)胞傷害、由于高血壓引起的血液循環(huán)不良造成的細(xì)胞傷害、自身免疫性慢性腎炎?，F(xiàn)在還沒(méi)有找到對(duì)慢性腎衰竭的有效治療方法，對(duì)于以狼瘡性腎炎為首的主要炎癥作為處方療法適合用類(lèi)固醇系、非類(lèi)固醇系抗炎藥，對(duì)于高血壓性腎衰竭時(shí)適合用降壓劑。現(xiàn)在，希望開(kāi)發(fā)對(duì)腎小球構(gòu)成細(xì)胞、腎小管構(gòu)成細(xì)胞有直接保護(hù)作用的藥物。
(5)肝病肝病從病毒性、過(guò)量飲酒、藥物性等肝炎，直至肝硬化、肝衰竭。在治療方法中，作為對(duì)癥治療法有熊脫氧膽酸、甘草亭酸制劑、中藥療法等。對(duì)于病毒性肝炎，作為病因療法有干擾療法，不過(guò)副作用也大，治療效果也不完全。肝臟是可再生臟器，但由于肝衰竭從肝硬變開(kāi)始肝功能陷于不能再生的狀態(tài)，所以超過(guò)再生能力的應(yīng)激慢慢地累加成為病因。因此，要保護(hù)肝細(xì)胞、當(dāng)然要有預(yù)防肝衰竭效果。而現(xiàn)在還沒(méi)有找到副作用小的有效治療方法。
而AOP-1基因作為在通過(guò)DMSO使小鼠紅白血病細(xì)胞分化誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量增加的因子被鑒定(Gene 1989 Vol.80，337-343當(dāng)初稱(chēng)之為MER-5，后來(lái)改稱(chēng)為AOP-1)。之后判明AOP-1蛋白質(zhì)屬于peroxiredoxin家族，文獻(xiàn)一般記述為peroxiredoxin 3(PRx3)(以下，在本說(shuō)明書(shū)中將AOP-1蛋白質(zhì)記載為AOP-1)。Peroxiredoxin家族通過(guò)使用純化蛋白質(zhì)進(jìn)行生物化學(xué)解析，他是以具有巰基(thiol)特異的抗氧化活性(Pro.Natl.Acad.Sci.USA 1994Vol.91，7017-7021)為特征的一類(lèi)蛋白質(zhì)，廣泛存在于從原核生物到包括人在內(nèi)的高等生物中。另外最近使用bacteria peroxiredoxin進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)在peroxiredoxin中具有除去過(guò)氧亞硝酸(peroxynitrite)的能力(Nature 2000 vol.407，No.14,211)。
即使在peroxiredoxin家族中由于AOP-1局限于線粒體中，所以與其他的peroxiredoxin不同(Methods inenzymology，vol.300)。作為抗氧化蛋白質(zhì)廣泛為人所知的超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶由于在表現(xiàn)抗氧化活性時(shí)不需要巰基，不能除去過(guò)氧化亞硝酸等，可以預(yù)見(jiàn)peroxiredoxin家族與SOD、過(guò)氧化氫酶在生理功能方面也不同。最近發(fā)現(xiàn)作為存在于細(xì)胞質(zhì)的peroxiredoxin 1型以及2型的生理功能對(duì)培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞中過(guò)氧化氫傷害有保護(hù)作用(J.BiologicalChemistry 2000 Vol.275，No.24，18266-18270)。但還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)分布于線粒體的AOP-1(peroxiredoxin 3型)的生理功能。另外包括AOP-1的peroxiredoxin家族究竟與哪種疾病有直接關(guān)系還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明正是想提供伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病，例如心臟病(慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病等)、神經(jīng)變性疾病(腦梗塞、阿耳茨海默病、帕金森病、頭部外傷、亨廷頓舞蹈病、腦血管性癡呆、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)變性癥、賓斯旺格氏病等)、風(fēng)濕病(慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)、腎病(腎衰竭)、肝病(肝炎、肝硬變、肝衰竭等)的預(yù)防方法、治療方法或診斷方法、該疾病的預(yù)防藥或治療藥、與該制劑的有效成分有關(guān)的物質(zhì)的篩選方法、對(duì)AOP-1進(jìn)行表達(dá)抑制或進(jìn)行缺失的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物以及轉(zhuǎn)化組織等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到以下事項(xiàng)。
(1)在伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防或治療方法中，有由(1)導(dǎo)入編碼AOP-1的核酸、或?qū)刖幋aAOP-1的氨基酸序列中的氨基酸附加、缺失、置換一個(gè)以上的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)給予增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)或(3)給予AOP-1蛋白質(zhì)或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽構(gòu)成的該預(yù)防或治療方法。另外所謂AOP-1基因通常是指編碼AOP-1的核酸序列(外顯子序列)和在其間的核酸序列(內(nèi)含子序列)，還包括抑制AOP-1基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列，但在本發(fā)明中除了特別指明時(shí)，所謂AOP-1基因是指AOP-1 mRNA。
(2)由將編碼AOP-1基因的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸導(dǎo)入患部組織的細(xì)胞構(gòu)成的上述(1)記載的預(yù)防或治療方法。
(3)由給予增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)構(gòu)成的上述(1)記載的預(yù)防或治療方法。
(4)由給予增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)構(gòu)成的上述(1)記載的預(yù)防或治療方法。
(5)上述(4)記載的預(yù)防或治療方法，其中具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)是編碼AOP-1的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
(6)由給予增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)構(gòu)成的上述(1)記載的預(yù)防或治療方法。
(7)上述(1)至(6)記載的預(yù)防或治療方法，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
(8)伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有(1)編碼AOP-1的核酸、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)，或(3)AOP-1蛋白質(zhì)或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽。
(9)上述(8)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有編碼AOP-1基因的核酸、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
(10)上述(8)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)。
(11)上述(8)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)。
(12)上述(11)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)是編碼AOP-1的核酸、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
(13)上述(8)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
(14)上述(8)至(13)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
(15)伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的診斷方法，對(duì)AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量進(jìn)行測(cè)定，以該表達(dá)量或產(chǎn)生量作為指標(biāo)進(jìn)行診斷。
(16)上述(15)記載的診斷方法，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
(17)伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的診斷劑或診斷試劑盒，其中包括以AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定的手段。
(18)上述(17)記載的診斷劑或診斷試劑盒，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
(19)可以作為由于抑制AOP-1產(chǎn)生、抑制AOP-1基因的表達(dá)或缺失AOP-1基因?qū)е碌陌殡S有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的疾病模型使用的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物。
(20)上述(19)記載的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
(21)可以作為由于抑制AOP-1產(chǎn)生、抑制AOP-1基因的表達(dá)或缺失AOP-1基因?qū)е碌陌殡S有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的疾病模型使用的轉(zhuǎn)化組織或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(22)上述(21)記載的轉(zhuǎn)化組織或轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
(23)包括向上述(18)至(21)記載的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物、轉(zhuǎn)化組織或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中給予或添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物，對(duì)AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量進(jìn)行檢測(cè)，從增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)以及增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)組成的物質(zhì)中選出至少一種物質(zhì)的篩選方法。
(24)包括使通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物與(1)含有AOP-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和AOP-1基因或報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或試管內(nèi)表達(dá)系接觸，對(duì)AOP-1基因或報(bào)告基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，或與(2)AOP-1或AOP-1的靶分子接觸，對(duì)AOP-1或AOP-1的靶分子的量進(jìn)行檢測(cè)的從增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)以及增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)組成的物質(zhì)中選出至少一種物質(zhì)的篩選方法。
(25)上述(24)記載的篩選方法，其中包括構(gòu)建將AOP-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)連接在報(bào)告基因的翻澤區(qū)的上游或下游的表達(dá)載體后，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，向該培養(yǎng)細(xì)胞中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物，一定時(shí)間后檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)量或報(bào)告蛋白的產(chǎn)生量的變化。
(26)上述(25)記載的篩選方法，其中包括使通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物與AOP-1或AOP-1的靶分子接觸，檢測(cè)與該物質(zhì)結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。
(27)上述(24)記載的篩選方法，其中包括將AOP-1或AOP-1的靶分子固定在載體上，然后向該固定的AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物以及AOP1或AOP-1的靶分子，檢測(cè)與該物質(zhì)結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。
(28)上述(24)記載的篩選方法，其中包括將通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物固定在載體(substrate)上，然后向該固定的物質(zhì)中添加AOP-1或AOP-1的靶分子，檢測(cè)與該物質(zhì)結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。
(29)增強(qiáng)AOP-1的功能的物質(zhì)的篩選方法，其中包括使通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物與AOP-1或AOP-1的靶分子接觸，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
(30)上述(29)記載的篩選方法，其中包括向AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物和AOP-1或AOP-1的靶分子，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
(31)上述(29)記載的篩選方法，其中包括將AOP-1或AOP-1的靶分子固定在載體上，然后向該固定的AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物和AOP-1或AOP-1的靶分子，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
(32)上述(29)記載的篩選方法，其中包括將通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物固定在載體上，然后向該固定的物質(zhì)中添加AOP-1或AOP-1的靶分子，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
(33)(1)編碼AOP-1基因的核酸、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)，或(3)AOP-1蛋白質(zhì)或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽在制造伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防藥或治療藥中的應(yīng)用。
(34)上述(33)記載的應(yīng)用，含有作為有效成分的編碼AOP-1基因的核酸、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
(35)上述(33)記載的應(yīng)用，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)。
(36)上述(35)記載的應(yīng)用，其中具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生作用的物質(zhì)是編碼AOP-1的核酸、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
(37)上述(33)記載的應(yīng)用，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)。
(38)上述(33)記載的應(yīng)用，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
(39)上述(33)至(38)記載的應(yīng)用，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1表示各慢性心衰竭病態(tài)模型大鼠的AOP-1蛋白質(zhì)在心肥大期以及心衰竭期的表達(dá)變化。
圖2表示各慢性心衰竭病態(tài)模型大鼠的AOP-1基因在心肥大期以及心衰竭期的表達(dá)變化。
圖3表示在心肌梗塞后慢性心衰竭模型大鼠的AOP-1、TSA、CuZn-SOD、Mn-SOD以及Catalase基因的表達(dá)變化。
圖4表示AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
圖5表示AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)細(xì)胞自律博動(dòng)率的影響。
圖6表示AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)MTT分解活性的影響。
圖7表示反義AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的影響。
圖8中，8a腎炎模型中引起炎癥后第7天時(shí)AOP-1基因表達(dá)量與正常對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)果。8b注入微量鵝羔氨酸(ibotenic acid)引起神經(jīng)變性疾病模型中AOP-1、過(guò)氧化氫酶(Catalase)以及CuZn-SOD基因的表達(dá)量與正常對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)果。
圖9傳染性肝炎模型中AOP-1基因表達(dá)量與正常對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)果。
圖10表示AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸傷害的保護(hù)作用。
圖11表示AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突觸伸展的促進(jìn)和保護(hù)作用。
圖12，圖12a表示分別導(dǎo)入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的細(xì)胞于無(wú)氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)(Hypoxia)的存活率，圖12b表示分別導(dǎo)入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的細(xì)胞于暴露于過(guò)氧化氫條件下的存活率，圖12c表示分別導(dǎo)入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的細(xì)胞于高葡萄糖培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)的存活率。
圖13，圖13a表示AOP-1于缺血再灌注時(shí)的心功能保護(hù)作用，圖13b表示AOP-1于缺血再灌注時(shí)的缺血僵硬抑制作用，圖13c表示AOP-1于缺血再灌注時(shí)對(duì)心肌壞死的抑制作用。
圖14，圖14a表示AOP-1保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)果，PTBBS的量減少的結(jié)果，圖14b表示由于AOP-1保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，與對(duì)照相比，存活的神經(jīng)細(xì)胞增加。圖14b中的箭頭表示對(duì)照組中的損傷部位以及AOP-1基因?qū)虢M中的同一部位。
圖15，圖15a表示各組血中尿素氮量隨時(shí)間的變化，圖15b表示炎癥發(fā)生第7天AOP-1抑制血中尿素氮量的上升，圖15c為炎癥發(fā)生后第28天的腎臟組織照片，表明AOP-1保護(hù)腎小管、腎小球。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，所謂「AOP-1的功能」指的是以心臟和心肌細(xì)胞代謝活化作用、心臟和心肌細(xì)胞功能保護(hù)作用以及心臟和心肌細(xì)胞死亡抑制作用、神經(jīng)細(xì)胞活化作用、神經(jīng)細(xì)胞死亡抑制作用、腎功能保護(hù)作用為代表的臟器、細(xì)胞的活化和保護(hù)作用。因此在本發(fā)明中所謂「具有AOP-1的功能」指的是具有臟器、細(xì)胞的活化和保護(hù)作用。是否「具有AOP-1的功能」的判定可以使用(6)篩選方法中的方法以及下面實(shí)施例中敘述的各種方法進(jìn)行。
在本發(fā)明中，所謂心臟疾病指的是心衰竭(包括慢性心衰竭、缺血性心衰竭、糖尿病性心衰竭等)、缺血性心臟病(包括心絞痛、心肌梗塞等)等。在本發(fā)明中所謂神經(jīng)性變性疾病指的是腦梗塞、阿耳茨海默病、帕金森病、頭部外傷、亨廷頓舞蹈病、腦血管性癡呆、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)變性癥、賓斯旺格氏病等。本發(fā)明提到的風(fēng)濕病包括慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。本發(fā)明中所謂腎病指的是糖尿病性腎病、高血壓性腎病、狼瘡性腎病等腎衰竭等。本發(fā)明中所謂肝病指的是肝炎(包括病毒性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎)、肝硬變、肝衰竭等。
發(fā)明人等為了找到作為心臟疾病、神經(jīng)變性疾病、風(fēng)濕病、腎病、肝病的共同現(xiàn)象的細(xì)胞功能低下、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的共同原因，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。
(1)心臟疾病首先為了查明慢性心衰竭的代償期的失敗原因，對(duì)伴隨有由心肥大發(fā)展到慢性心衰竭的組織中的各種蛋白質(zhì)的表達(dá)變化進(jìn)行了測(cè)定。將組織提取液中的蛋白質(zhì)混合液粗分為水溶性級(jí)分和表面活性劑溶性級(jí)分，分別通過(guò)雙向電泳進(jìn)行解析。作為慢性心衰竭病態(tài)模型使用大動(dòng)脈狹窄鼠(心臟壓負(fù)荷模型)、動(dòng)靜脈分流鼠(心臟容量負(fù)荷模型)、遺傳性高血壓鼠(SHR)、Dah1食鹽感受性鼠進(jìn)行比較解析。對(duì)在許多模型共同的代償期的失敗以及表達(dá)量變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢索，得到普遍的慢性心衰竭關(guān)連蛋白質(zhì)組。發(fā)現(xiàn)其中之一的AOP-1蛋白質(zhì)隨著代償期的失敗表達(dá)減少。
為了研究隨著慢性心衰竭的發(fā)展，該蛋白質(zhì)的變化是否受到基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行了解析。由于解析結(jié)果在研究的所有模型中都看到該基因的表達(dá)抑制，表明隨著慢性心衰竭的發(fā)展，AOP-1的減少是受到基因表達(dá)調(diào)節(jié)的結(jié)果。而使用作為缺血性慢性心衰竭模型的心肌梗塞后心衰竭大鼠進(jìn)行基因表達(dá)解析時(shí)，看到該基因的表達(dá)抑制。由此表明在由各種各樣原因引起的慢性心衰竭中普遍存在AOP-1基因表達(dá)低下、而且AOP-1減少。另外進(jìn)一步對(duì)作為2型peroxiredoxin的Thiol-specific antioxidant(TSA)的基因表達(dá)變化和在抗氧化活性功能中具有共同性的CuZn-superoxidedismutase(CuZn-SOD)，Mn-superoxide dismutase(Mn-SOD)，catalase的基因表達(dá)進(jìn)行解析時(shí)，判明TSA、CuZn-SOD、Mn-SOD、catalase在基因表達(dá)量上沒(méi)有變化。由此判明AOP-1在peroxiredoxin家族、代表性的抗氧化蛋白中特征性地隨著向心衰竭過(guò)渡表達(dá)減少。這表明AOP-1基因受到了與其他抗氧化蛋白質(zhì)不同的基因調(diào)節(jié)。
接下來(lái)，進(jìn)行了AOP-1是否對(duì)心臟功能改善或進(jìn)一步惡化有某些作用的驗(yàn)證。首先分離出大鼠AOP-1基因的全長(zhǎng)基因，構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體后，將AOP-1基因?qū)氪笫笈囵B(yǎng)心肌細(xì)胞中。在無(wú)氧條件下對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的無(wú)氧處理、無(wú)氧培養(yǎng)后再氧化，進(jìn)行一定時(shí)間培養(yǎng)的再氧化處理、在通常氧濃度下進(jìn)行培養(yǎng)的未處理的各種實(shí)驗(yàn)條件中，AOP-1基因?qū)虢M與為了增加由于強(qiáng)制性基因表達(dá)、蛋白質(zhì)生產(chǎn)造成的影響，導(dǎo)入作為無(wú)害無(wú)益基因的β-半乳糖苷酶基因的對(duì)照組進(jìn)行比較解析。作為比較方法1進(jìn)行存活細(xì)胞數(shù)的確認(rèn)、作為比較方法2進(jìn)行存活細(xì)胞中表現(xiàn)出自律博動(dòng)的細(xì)胞數(shù)的確認(rèn)、作為比較方法3進(jìn)行通過(guò)MTT法(J.Immunol.Methods 1983 Vol.65，55-63)的存活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞代謝活性的確認(rèn)。對(duì)以上3點(diǎn)進(jìn)行比較研究的結(jié)果表明相對(duì)于對(duì)照組，AOP-1基因?qū)虢M存活細(xì)胞數(shù)經(jīng)無(wú)氧處理、再氧化處理有意義上升，同時(shí)具有自律博動(dòng)能力的細(xì)胞數(shù)也有意義增加。而在MTT法中，相對(duì)于對(duì)照組，AOP-1基因?qū)虢M經(jīng)無(wú)氧處理、再氧化處理、未處理中表現(xiàn)出高值，表現(xiàn)出損傷時(shí)的存活活細(xì)胞數(shù)的增加和在損傷時(shí)、正常時(shí)的代謝活性的亢進(jìn)。就是說(shuō)，判明對(duì)于無(wú)氧傷害、再氧化傷害，AOP-1在維持細(xì)胞存活率、細(xì)胞功能兩個(gè)方面都表現(xiàn)出很高的有效性。另外，我們構(gòu)建了將AOP-1基因的互補(bǔ)鏈設(shè)計(jì)成能進(jìn)行表達(dá)的反義AOP-1表達(dá)腺病毒載體(反義AOP-1載體)。有報(bào)道由這種載體表達(dá)的mRNA與由內(nèi)源性AOP-1基因表達(dá)的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，一般都抑制翻譯成蛋白質(zhì)(Gene 1990 Vol.91，261-265)。我們將反義AOP-1載體、AOP-1表達(dá)載體、β-半乳糖苷酶表達(dá)載體導(dǎo)入心肌細(xì)胞，與未導(dǎo)入的細(xì)胞一起培養(yǎng)3天。對(duì)這些細(xì)胞分別進(jìn)行MTT分析，觀察到導(dǎo)入反義AOP-1載體的細(xì)胞抑制色素生成，宏觀可以看到存活細(xì)胞數(shù)的減少。就是說(shuō)，可以判明由于反義AOP-1載體抑制內(nèi)源性AOP-1的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的存活產(chǎn)生惡劣的影響。為了對(duì)AOP-1、TSA、CuZn-SOD在細(xì)胞保護(hù)作用中的有效性進(jìn)行直接比較驗(yàn)證，進(jìn)行可以強(qiáng)制表達(dá)這些基因的腺病毒載體的構(gòu)建。利用該載體增強(qiáng)大鼠心肌細(xì)胞中各個(gè)蛋白質(zhì)、對(duì)以下應(yīng)激的耐性進(jìn)行了解析。結(jié)果表明在過(guò)氧化氫、Hypoxia、高葡萄糖應(yīng)激中，AOP-1表現(xiàn)出最有效的細(xì)胞保護(hù)作用。這表明在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)中AOP-1起著特別重要的作用。而發(fā)現(xiàn)在高葡萄糖損傷中的細(xì)胞保護(hù)作用表明AOP-1對(duì)糖尿病性心臟疾病(起因于糖尿病的心衰竭以及缺血性心臟疾病(心絞痛、心肌梗塞等))的有效性。
以上表明各種心臟疾病中的AOP-1的減少成了代償結(jié)構(gòu)失敗(病態(tài)惡化)的一個(gè)主要原因。
特別應(yīng)當(dāng)注目的地方是AOP-1不僅對(duì)再氧化的活性氧傷害、而且對(duì)無(wú)氧狀態(tài)下的各種傷害，即對(duì)能力枯竭傷害和細(xì)胞內(nèi)酸性化傷害都能保護(hù)，還能活化通常氧濃度培養(yǎng)下的細(xì)胞代謝功能。即，清楚地表明AOP-1的細(xì)胞功能保護(hù)作用以及細(xì)胞死亡抑制作用不僅源于抗氧化作用還包括細(xì)胞代謝活化作用(線粒體活化作用)在內(nèi)的新的功能。
另外我們?yōu)榱蓑?yàn)證AOP-1在生物體內(nèi)是否表現(xiàn)保護(hù)作用，將AOP-1基因?qū)胄呐K內(nèi)，進(jìn)行以下解析。將基因?qū)牒?，等到蛋白質(zhì)表達(dá)，立刻摘出心臟連接在灌流裝置上。通過(guò)用含有與血液同等量的氣體的溶液灌流心臟，努力做到減少由于摘出造成的傷害、保持與生物體內(nèi)同等條件下的心臟功能。為了將該心臟作成缺血狀態(tài)，暫時(shí)停止灌流，為了研究由于再氧化產(chǎn)生的影響進(jìn)行再灌注。使AOP-1強(qiáng)制表達(dá)的心臟相對(duì)于作為陰性對(duì)照只進(jìn)行導(dǎo)入基因操作的心臟(Sham)，缺血時(shí)的缺血性心僵硬有意義延長(zhǎng)，再灌注時(shí)的功能恢復(fù)有意義良好，進(jìn)一步看到再灌注時(shí)對(duì)細(xì)胞壞死的有意義抑制作用。表明缺血僵硬與心肌細(xì)胞ATP枯竭密切相關(guān)(J Mol Cell Cardiol1996，Vol.28，1045-1057)。AOP-1延長(zhǎng)缺血至缺血僵硬的時(shí)間表明通過(guò)培養(yǎng)心肌細(xì)胞我們發(fā)現(xiàn)的AOP-1的線粒體活化作用在體內(nèi)心臟也發(fā)揮作用。這一結(jié)果表明AOP-1不僅在培養(yǎng)細(xì)胞，而且在生物體內(nèi)除了通過(guò)抗氧化作用以外，還通過(guò)新的線粒體活化作用共同保護(hù)缺血傷害、再灌注傷害。以上表明AOP-1基因的導(dǎo)入、AOP-1的表達(dá)增強(qiáng)劑、AOP-1功能增強(qiáng)劑是缺血性心衰竭、缺血性心臟疾病的有效的治療方法。有報(bào)道不僅在缺血性心衰竭、缺血性心臟疾病，而且在慢性心衰竭中也有起因心肥大的心肌組織內(nèi)血液循環(huán)衰竭(Chin.Med.Sci.J.1995 Vol.10(3)，151-157)，所以認(rèn)為缺血、缺血再灌注是慢性心衰竭病態(tài)中普遍的傷害要因。因此將該蛋白質(zhì)補(bǔ)充到表現(xiàn)出慢性心衰竭或慢性心衰竭征兆的病態(tài)心臟中在保護(hù)防止心肌細(xì)胞死亡的同時(shí)，預(yù)料可以作為對(duì)于使心臟博出功能維持的慢性心衰竭的有效治療方法。
(2)心臟以外的疾病形成部位以下以調(diào)查AOP-1的功能在心臟以外的臟器中是否是疾病形成的原因?yàn)槟康脑谄渌疾∨K器中進(jìn)行基因表達(dá)解析。結(jié)果表明腎炎模型的腎臟、神經(jīng)變性病模型的腦、以及傳染性肝炎(Septic shock)的肝臟中AOP-1的表達(dá)都低下。因此清楚表明AOP-1的表達(dá)低下是許多疾病中普遍病態(tài)形成和惡化的一個(gè)因素。另外不僅心衰竭模型，而且在神經(jīng)變性疾病模型的腦組織對(duì)于CuZn-SOD，catalase基因都看不到表達(dá)變化，但AOP-1基因表現(xiàn)出表達(dá)低下。因此即使在心臟以外的臟器中AOP-1基因的表達(dá)也表現(xiàn)出受到與其他抗氧化蛋白質(zhì)不同的調(diào)節(jié)。
1.神經(jīng)變性疾病在腦梗塞、腦血管性癡呆、頭部外傷、阿耳茨海默病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)變性癥、帕金森病等病中由于細(xì)胞外谷氨酸濃度的上升使得谷氨酸受體(Glutamate receptor，NMDA受體)過(guò)度活化(Eur J Neurosci2000 Vol.12(8)，2735-45；Brain Res 1994 Vol.11，No.642(1-2)，117-122；Acta Neurochir Suppl.2000 Vol.76，437-8；NeurosciLett 2001 Vol.299(1-2)，37-40；J Neurosci Res 2001Vol.63(5)，377-87；Drugs Aging 2001 Vol.18(10)，717-24)。受到NMDA受體活化的細(xì)胞使其鈣通道打開(kāi)，引起鈣流向細(xì)胞內(nèi)。過(guò)量NMDA受體的活化給細(xì)胞帶來(lái)鈣過(guò)負(fù)荷狀態(tài)。由于這樣的鈣過(guò)負(fù)荷引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死，神經(jīng)功能損傷變成不可逆的損傷。象前面所示那樣由于AOP-1在腦神經(jīng)變性疾病中表達(dá)低下，所以與心臟疾病同樣補(bǔ)充AOP-1可能是有效的。實(shí)際上在對(duì)AOP-1對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元的谷氨酸傷害是否能夠保護(hù)進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果是，AOP-1基因?qū)爰?xì)胞可以有意義地抑制細(xì)胞死亡。進(jìn)一步判明在無(wú)負(fù)荷狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)突觸的伸展，激活作為神經(jīng)元功能的網(wǎng)絡(luò)形成。因此判明AOP-1在神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)鈣過(guò)負(fù)荷表現(xiàn)出細(xì)胞保護(hù)作用以及神經(jīng)細(xì)胞活化作用這樣的很高的有用性。
為了確認(rèn)在神經(jīng)變性疾病動(dòng)物模型中的有效性，對(duì)鵝羔氨酸的腦損傷模型進(jìn)行解析。鵝羔氨酸是NMDA受體的激動(dòng)劑，引起鈣過(guò)量流入細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡。將AOP-1表達(dá)基因?qū)肽X的海馬，誘導(dǎo)AOP-1表達(dá)后，于同一部位注入鵝羔氨酸。2日后摘出腦，觀察神經(jīng)細(xì)胞。將沒(méi)有導(dǎo)入AOP-1基因的作為對(duì)照組進(jìn)行比較解析，顯然在導(dǎo)入AOP-1基因的腦中神經(jīng)細(xì)胞死亡被抑制。另外對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)進(jìn)行定量解析，結(jié)果表明與對(duì)照組相比看到明顯的抑制。由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)與神經(jīng)細(xì)胞死亡的量表現(xiàn)出相關(guān)性(Journal of Neuroimmunology 2000 Vol.1009，105-111；BrainResearch 1991，Vol.565，312-320)，該結(jié)果表明由于AOP-1基因的導(dǎo)入，神經(jīng)細(xì)胞被保護(hù)。因此判明AOP-1對(duì)組織內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞也有保護(hù)作用。因此認(rèn)為補(bǔ)充AOP-1對(duì)腦梗塞、腦血管性癡呆、頭部外傷、阿耳茨海默病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)變性癥、帕金森病等神經(jīng)變性疾病是有效的。
2.腎病就象前面所示那樣，由于AOP-1在腎衰竭模型中表達(dá)低下，所以與心臟疾病、神經(jīng)變性疾病同樣，補(bǔ)充AOP-1可能是有效的。實(shí)際上為了確認(rèn)AOP-1基因?qū)β阅I衰竭的有效性，對(duì)Thy-1腎炎模型進(jìn)行了解析。所謂Thy-1腎炎模型是通過(guò)注入針對(duì)在作為腎的腎小球細(xì)胞的腎小球膜細(xì)胞中特異表達(dá)的Thy-1細(xì)胞表面抗原(Thy-1)蛋白的抗體，對(duì)Thy-1進(jìn)行自身免疫致敏，通過(guò)自身免疫作用，會(huì)發(fā)生腎小球膜細(xì)胞的細(xì)胞死亡，接著是尿小管的傷害。一般認(rèn)為T(mén)hy-1腎炎模型是以炎癥作為主體的腎衰竭模型。在注入Thy-1抗體的同時(shí)注入AOP-1基因，經(jīng)時(shí)以血中尿素氮作為指標(biāo)測(cè)定腎功能。以未導(dǎo)入AOP-1的組作為對(duì)象進(jìn)行比較解析，結(jié)果表明AOP-1基因?qū)虢M有意義地抑制腎功能低下。因此我們認(rèn)為AOP-1對(duì)慢性腎衰竭是有效的。
3.肝病肝病包括病毒性、過(guò)量飲酒、藥物性等肝炎，直至肝硬變、肝衰竭。肝臟雖然是可再生臟器，但由于肝衰竭從肝硬變開(kāi)始，肝功能就陷于不能再生的狀態(tài)，所以超過(guò)再生能力的應(yīng)激慢慢地累加成為病因。因此，顯然要保護(hù)肝細(xì)胞就是要有預(yù)防肝衰竭效果。就象前面所示那樣，由于AOP-1在肝炎模型中表達(dá)低下，所以與心臟疾病、神經(jīng)變性疾病、腎病同樣補(bǔ)充AOP-1可能是有效的。
4.風(fēng)濕病風(fēng)濕病中，向免疫細(xì)胞分化、增殖的滑膜的細(xì)胞、向關(guān)節(jié)浸潤(rùn)的外周血中的炎癥細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)軟骨和骨破壞，對(duì)關(guān)節(jié)造成不可逆破壞。最近，已經(jīng)了解到由于過(guò)氧亞硝酸等應(yīng)激，成軟骨細(xì)胞凋亡，使得軟骨不能再生(Arthritis & Rheumatism 1999Vol.42，No.7，1528-1537；J Agric Food Chem.2001 Vol.49(8)，3614-21)。由心臟疾病、神經(jīng)變性疾病、腎衰竭、肝衰竭的解析結(jié)果認(rèn)為在與細(xì)胞的生死相關(guān)的應(yīng)激狀態(tài)下AOP-1的表達(dá)低下。因此可以預(yù)料到處于風(fēng)濕病病態(tài)的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中AOP-1的表達(dá)低下。線粒體與細(xì)胞內(nèi)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)有密切關(guān)系。而線粒體的功能低下成了凋亡的直接“扳機(jī)”(概述最新醫(yī)學(xué)1999年54卷4號(hào))。從我們的解析可以看到AOP-1對(duì)各種各樣的細(xì)胞、組織具有保護(hù)作用。向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞補(bǔ)充AOP-1可以對(duì)線粒體功能進(jìn)行保護(hù)、活化，抑制成軟骨細(xì)胞死亡和成骨細(xì)胞死亡。由此使軟骨和骨的再生能力維持成為可能。
通過(guò)以上工作，作為新的AOP-1功能我們發(fā)現(xiàn)了以心肌細(xì)胞代謝活化作用、心肌細(xì)胞功能保護(hù)作用以及心肌細(xì)胞死亡抑制作用、神經(jīng)細(xì)胞活化作用、神經(jīng)細(xì)胞死亡抑制作用為代表的細(xì)胞保護(hù)和活化作用。我們還發(fā)現(xiàn)AOP-1的補(bǔ)充對(duì)慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性腎衰竭、神經(jīng)變性疾病、風(fēng)濕病等為首的伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的治療是有效的，完成了本發(fā)明。
而在本發(fā)明中所謂伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)低下的疾病指的是在患部組織(例如，如果是心衰竭則是心臟、如果是腦則是神經(jīng)細(xì)胞、如果是風(fēng)濕病則是關(guān)節(jié)等)含有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)低下的細(xì)胞。而所謂AOP-1的量減少是與細(xì)胞內(nèi)的AOP-1功能減少同義，因此由于遺傳變異引起的AOP-1的功能低下的疾病也包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
作為本發(fā)明涉及到的伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防藥或治療藥的有效成分可以使用的物質(zhì)如以下(1)至(4)涉及到的物質(zhì)。
(1)具有增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)作用的物質(zhì)具有增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)作用的物質(zhì)無(wú)論是通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的化合物或他們的衍生物中任一種都可以，作為這樣的物質(zhì)如作用于AOP-1基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)區(qū)，具有增強(qiáng)AOP-1基因向mRNA轉(zhuǎn)錄作用的物質(zhì)，或借助于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子等表現(xiàn)出同樣作用的物質(zhì)(例如，與轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)同激活劑(co-activator)結(jié)合，促進(jìn)與DNA、其他轉(zhuǎn)錄因子、協(xié)同激活劑的結(jié)合的物質(zhì)，或與轉(zhuǎn)錄抑制因子或協(xié)同阻遏劑結(jié)合，抑制對(duì)DNA、其他轉(zhuǎn)錄因子、協(xié)同阻遏劑的結(jié)合的物質(zhì)等)。
(2)具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生作用的物質(zhì)具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生作用的物質(zhì)無(wú)論是通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的化合物或他們的衍生物中任一種都可以，作為這樣的物質(zhì)如編碼AOP-1的核酸(RNA或DNA序列號(hào)1至3)、或編碼在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸(RNA或DNA)。也包括在嚴(yán)格條件下與編碼AOP-1的核酸(RNA或DNA序列1至3)的互補(bǔ)鏈雜化的，而且編碼具有AOP-1功能的多肽的核酸(RNA或DNA)。例如也包括作為標(biāo)準(zhǔn)方法如文獻(xiàn)(Molecular CloningA LaboratoryMannual，Sambrook et al.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)所記載的那樣，在6xSSC，0.5％SDS，10mM EDTA，5xDenhardt’s solution，10mg/ml denatured salmon sperm DNA的溶液中于68℃下進(jìn)行雜化的雜化核酸。這樣的核酸與編碼AOP-1的核酸(RNA或DNA，序列號(hào)1至3)具有90％、優(yōu)選具有95％以上的序列同源性。將這些核酸插入到病毒改變載體等其他的生物基因中的物質(zhì)也同樣。例如病毒載體、優(yōu)選是慢病毒載體、腺苷伴隨病毒載體、更優(yōu)選的是腺病毒載體，或化學(xué)合成的脂質(zhì)體、病毒包膜、或病毒包膜與合成脂質(zhì)體的復(fù)合體等中整合在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的那樣啟動(dòng)子序列、例如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV promoter)等的下游連接AOP-1基因的核酸序列的載體。
另外對(duì)于TNF-α，已知TNF-α產(chǎn)生受到轉(zhuǎn)錄后mRNA的穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，由于HuR蛋白質(zhì)的結(jié)合被穩(wěn)定化，同樣在與AOP-1 mRNA結(jié)合的物質(zhì)或蛋白質(zhì)、或核酸中，還可以舉出如抑制AOP-1 mRNA分解的物質(zhì)或具有使翻譯效率提高的活性的物質(zhì)。
(3)具有增強(qiáng)AOP-1功能作用的物質(zhì)AOP-1通過(guò)酶促使活性部位半胱氨酸殘基的氧化還原可逆化，消除氧化以及過(guò)氧亞硝酸活性。增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)，通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的化合物或他們的衍生物中任一種都可以，作為這樣的物質(zhì)如與該活性部位半胱氨酸殘基結(jié)合、促進(jìn)氧化還原循環(huán)的物質(zhì)，或與AOP-1的活性部位以外部位結(jié)合，通過(guò)別構(gòu)效應(yīng)促進(jìn)活性部位的氧化還原循環(huán)的物質(zhì)。另外如促進(jìn)AOP-1和AOP-1作用的AOP-1靶分子(例如受體)的結(jié)合或細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞、對(duì)亢進(jìn)AOP-1具有的活性的物質(zhì)。例如已知硫氧還蛋白(thioredoxin)可以與AOP-1結(jié)合，使生物化學(xué)的抗氧化活性上升。借助于這樣的使AOP-1功能增強(qiáng)的蛋白質(zhì)本身或基因的導(dǎo)入、利用化學(xué)合成物質(zhì)等誘導(dǎo)，間接地增強(qiáng)AOP-1功能，發(fā)揮有效性的物質(zhì)。另外，特異分解AOP-1的蛋白酶的活性抑制物質(zhì)等也包括在內(nèi)。
(4)AOP-1蛋白質(zhì)和具有AOP-1功能的多肽在本發(fā)明中作為伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防藥或治療藥的有效成分可以使用AOP-1蛋白質(zhì)本身或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽。
(5)制劑作為有效成分含有上述那樣的物質(zhì)的制劑可以使用通常制劑時(shí)用的載體或賦形劑、以及其他的添加劑進(jìn)行制備。
本發(fā)明涉及到的醫(yī)藥組合物的有效成分無(wú)論是游離型，還是該藥物容許的鹽都可以。作為與無(wú)機(jī)酸的鹽如與鹽酸、硫酸、磷酸的鹽，或與有機(jī)酸的鹽，如可以使用與甲酸、醋酸、丁酸、琥珀酸、檸檬酸等有機(jī)酸鹽。鹽無(wú)論是鈉、鉀、鋰、鈣等金屬鹽、還是由有機(jī)堿形成的鹽的形態(tài)都可以。
有效成分最好是通過(guò)與眾所周知的藥理學(xué)上容許的載體、賦形劑、稀釋劑等混合后，使用醫(yī)藥上一般使用的給藥方法、例如優(yōu)選經(jīng)口服給藥，或靜脈給藥、肌肉給藥或皮下給藥等非口服給藥方法給藥。本發(fā)明的藥物組合物，例如有效成分可以與生理學(xué)上容許的載體、香味劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、乳化劑、溶液劑、混懸液、糖漿劑等適當(dāng)混合進(jìn)行制造，可以做成片劑、散劑、顆粒劑、溶液劑等。作為可以混合到片劑等制劑的添加劑如明膠那樣的粘合劑、玉米淀粉那樣的潤(rùn)滑劑等，另外也可以用糖衣或易溶性或腸溶性物質(zhì)的膜被膜。劑型為膠囊時(shí)，在上述組合物中還可以含有液體狀載體。用于注射的無(wú)菌組合物也適合利用通常處方進(jìn)行制造。作為注射用的水性液體如含有葡萄糖等的等滲液等，也可以與聚乙二醇那樣的適當(dāng)?shù)娜芙廨o助劑等合用。另外，也可以配合緩沖劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防止氧化劑、無(wú)痛劑等。有效成分是肽時(shí)，由于經(jīng)口給藥在消化道中受到分解，所以這種給藥方法一般來(lái)說(shuō)效果不好，也可以做成在消化道中難于分解的制劑、例如將活性成分肽包在脂質(zhì)體中的微囊，進(jìn)行經(jīng)口給藥。另外也可以使用從直腸、鼻腔內(nèi)、舌下等消化道以外的粘膜吸收的給藥方法。此時(shí)以栓劑、滴鼻噴霧劑、舌下片的形態(tài)給藥。
而在用于基因治療的情況下，可以使用向病毒載體、優(yōu)選是慢病毒載體、腺苷伴隨病毒載體、更優(yōu)選的是腺病毒載體，或化學(xué)合成的脂質(zhì)體、病毒包膜、或病毒包膜與合成脂質(zhì)體的復(fù)合體等眾所周知的適合基因治療的介質(zhì)中整合在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能那樣的啟動(dòng)子序列、例如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV promoter)等的下游連接AOP-1基因或與增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)有關(guān)的核酸后的載體。
本發(fā)明藥物組合物的給予量取決于治療中使用情況、對(duì)治療有效的給藥量，由于給藥量因給藥對(duì)象的年齡、體重、癥狀的程度以及給藥途徑等而有所不同，應(yīng)根據(jù)各種情況確定。通常經(jīng)口給藥時(shí)，成年人一天的給藥量為0.1～1000mg左右，可以分為1至數(shù)次給藥。
(6)篩選方法可以用作本發(fā)明涉及到的預(yù)防藥或治療藥的有效成分的物質(zhì)的篩選法如以下列舉的方法。
在增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)的篩選中使用的AOP-1基因或AOP-1、或其衍生物無(wú)論是來(lái)自哪種來(lái)源都可以，例如來(lái)自人(AOP-1基因序列1、AOP-1序列4)、來(lái)自大鼠(AOP-1基因序列2、AOP-1序列5)、小鼠(AOP-1基因序列3、AOP-1序列6)等哺乳動(dòng)物的。其中，在對(duì)人的預(yù)防藥或治療藥的研究、開(kāi)發(fā)中利用上優(yōu)選使用來(lái)自人的AOP-1的。另外動(dòng)物模型、即、從使用由于AOP-1基因進(jìn)行表達(dá)抑制或缺失引起慢性心衰竭癥狀等的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物的研究、開(kāi)發(fā)的必要性考慮，優(yōu)選使用例如來(lái)自小鼠、大鼠等動(dòng)物的模型。但是，在使用動(dòng)物模型對(duì)藥物進(jìn)行篩選時(shí)，希望使用來(lái)自人的模型。
在增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)、或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)的篩選方法中，一般使用利用報(bào)告基因的方法。作為報(bào)告基因例如可以使用氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、熒光素酶等。增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)，例如構(gòu)建將AOP-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子區(qū)等)連接到報(bào)告基因的翻譯區(qū)的上游或下游的表達(dá)載體，導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞中，向該培養(yǎng)細(xì)胞添加作為樣品的物質(zhì)(該物質(zhì)可以是通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物中的任一種)，可以于一定時(shí)間后通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)量、或報(bào)告蛋白質(zhì)的量進(jìn)行篩選。AOP-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子區(qū)等)可以通過(guò)以AOP-1 cDNA的片段為探針從銷(xiāo)售的基因文庫(kù)進(jìn)行噬斑雜交等得到。報(bào)告蛋白質(zhì)的量可以以酶活性進(jìn)行測(cè)定，作為蛋白質(zhì)的表達(dá)量可以使用抗體等進(jìn)行測(cè)定。
對(duì)于增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)包括含有AOP-1序列的DNA或RNA，即使是將他們整合到脂質(zhì)體、或病毒改變載體也可以得到同樣的效果。
作為增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)的篩選方法，例如可以通過(guò)將純化AOP-1、或細(xì)胞溶解液、最好是線粒體級(jí)分與過(guò)氧化氫、含有巰基的還原劑(例如二硫蘇糖醇)、可測(cè)定酶活性的檢測(cè)酶這4種混合，測(cè)定一定時(shí)間后的檢測(cè)酶的活性來(lái)進(jìn)行(Biochemical andBiophysical Research Communications 1994 Vol.199，No.1，199-206；Journal of Biological Chemistry 1996 Vol.271，No.26，15315-15321)。而在使用過(guò)氧亞硝酸(peroxynitrite例如可以通過(guò)酸性亞硝酸鹽與過(guò)氧化氫混合得到)時(shí)，將純化AOP-1、或細(xì)胞溶解液、最好是線粒體級(jí)分與過(guò)氧亞硝酸和可測(cè)定酶活性的檢測(cè)酶或過(guò)氧亞硝酸修飾的物質(zhì)(例如DNA)這3種試劑混合，測(cè)定一定時(shí)間后的檢測(cè)酶的活性或物質(zhì)的修飾量來(lái)進(jìn)行(Nature 2000Vol.407，No.14，211-215)。即，通過(guò)測(cè)定AOP-1對(duì)由于自由基傷害檢測(cè)酶失活的保護(hù)活性，可以篩選增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
(7)診斷方法、診斷劑以及診斷試劑盒AOP-1基因，其表達(dá)量隨著各種疾病的惡化而減少的事實(shí)本發(fā)明人已經(jīng)搞清楚了。使用患者的活組織樣品，通過(guò)測(cè)定AOP-1基因的表達(dá)量，可以了解到慢性心衰竭的進(jìn)一步惡化程度。例如使用ISOGEN(日本基因公司生產(chǎn))從患者活組織樣品100mg提取總RNA，經(jīng)DNase處理后合成cDNA，用適當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增AOP-1基因，通過(guò)凝膠電泳判定相當(dāng)于AOP-1的帶的濃度等方法可以測(cè)定AOP-1基因的表達(dá)量。AOP-1基因表達(dá)的定量不限于該方法，例如實(shí)施例3記載的方法或northern雜交法、cDNA數(shù)組法(cDNAarray)等，只要是RNA、DNA的定量法無(wú)論哪一種方法都可以利用。
另外，本發(fā)明已經(jīng)表明AOP-1基因是各種疾病的改善因子，所以AOP-1基因以及其調(diào)控區(qū)中存在任一種變異使AOP-1的功能低下，基因表達(dá)量減少的情況下，很容易想到具有該變異的個(gè)體易得慢性心衰竭等疾病，或具有容易進(jìn)一步惡化的傾向。因此通過(guò)對(duì)這些基因上的變異進(jìn)行試驗(yàn)，危險(xiǎn)因素的診斷成為可能。作為了解基因上變異的方法，例如可以根據(jù)常規(guī)方法從患者的血液中分離DNA，按照實(shí)施例1-5記載的方法確定其堿基序列，與正常的序列進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行。另外一旦變異與慢性心衰竭的關(guān)系明確，可以利用只檢測(cè)該變異的DNA芯片法、SSCP法等方法。
另外，使用伴隨慢性心衰竭疾病的很多患者的活組織樣品，通過(guò)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)AOP-1的濃度，可以了解慢性心衰竭或上述疾病的進(jìn)一步惡化程度。作為測(cè)定方法可以利用例如使用抗AOP-1抗體的ELISA或RIA法、通過(guò)HPLC和質(zhì)譜的定量法等。此時(shí)AOP-1不必是完全形態(tài)，只要是可測(cè)定，即使是其片段也可以。
另外本發(fā)明包含包括使用上述測(cè)定手段等對(duì)AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量進(jìn)行測(cè)定的手段的慢性心衰竭的診斷劑和診斷試劑盒。
(8)AOP-1基因?qū)朕D(zhuǎn)化動(dòng)物以及轉(zhuǎn)化人細(xì)胞和組織等本發(fā)明涉及到的物質(zhì)的鑒定在上述(6)篩選方法中已經(jīng)有記載，也可以利用具有通過(guò)抑制AOP-1的表達(dá)引起的慢性心衰竭癥狀等的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物進(jìn)行。作為宿主動(dòng)物的非人動(dòng)物除了小鼠、大鼠、兔子等小動(dòng)物以外，狗、豬、羊、牛等大動(dòng)物也可以成為選擇的對(duì)象，只要是對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)、可以確認(rèn)功能和生理作用的動(dòng)物無(wú)論什么樣的動(dòng)物都可以。對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行抑制通過(guò)在AOP-1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入變異或缺失等是可能的，只要是抑制基因表達(dá)，無(wú)論用什么方法都可以。另外，AOP-1的產(chǎn)生抑制，通過(guò)向AOP-1 mRNA導(dǎo)入互補(bǔ)的DNA或RNA或?qū)刖幋a該互補(bǔ)序列的基因可以得到，只要是能夠抑制AOP-1的產(chǎn)生，無(wú)論使用什么方法都可以。另外作為基因缺失的方法如使用胚胎干細(xì)胞的人工破壞特定基因鼠技術(shù)，只要是抑制基因的表達(dá)的系統(tǒng)使用什么樣系統(tǒng)都可以。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳法檢索AOP-11-1慢性心衰竭病態(tài)模型大鼠的制作和左心室樣品的采集A.Dah1慢性心衰竭模型大鼠
Dah1大鼠是通過(guò)在Spague-Dawley系大鼠中用含有8％高食鹽食物飼養(yǎng)，進(jìn)行繼代交配在第3代分離為高血壓易發(fā)性的食鹽感受性大鼠(Dah1-S)和不產(chǎn)生高血壓的食鹽抗性大鼠(Dah1-R)。Dah1-S大鼠通過(guò)京都大學(xué)木原等人的研究，經(jīng)從6周齡開(kāi)始用含有8％高食鹽食物飼養(yǎng)，出現(xiàn)代償性左心室肥大后，向伴有收縮衰竭的左心室擴(kuò)大、即非代償性慢性心衰竭過(guò)渡，由于肺充血而死亡(Am.J.Physuol.1994 Vol.267，H2471-2482)。本模型在模型制作中不需要特殊的手法，在短時(shí)期內(nèi)可以引發(fā)慢性心衰竭癥，而在一個(gè)體中可以很清楚區(qū)分為代償肥大期和非代償慢性心衰竭期，類(lèi)似于人的高血壓性慢性心衰竭和發(fā)病過(guò)程。
雄性Dah1食鹽感受性大鼠(Dah1-S)(清水實(shí)驗(yàn)材料)從6周齡開(kāi)始用含有8％高食鹽食物飼養(yǎng)，在心肥大期(11周齡)和慢性心衰竭期(14周齡)采取左心室。
B.腹部大動(dòng)脈狹窄大鼠(壓負(fù)荷模型由于壓負(fù)荷引起的大鼠心肥大模型AOB)的制作以及左心室樣品的采取實(shí)驗(yàn)中使用Sprague-Dawley系的9周齡雄性大鼠。通過(guò)向腹腔內(nèi)注入戊巴比妥鈉(40mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，然后腹臥位固定，開(kāi)腹后，使腹部大動(dòng)脈露出，剝離左右的腎動(dòng)脈間的部分。沿著大動(dòng)脈，使21G注射針在左右的腎動(dòng)脈間與大動(dòng)脈一起用絲線結(jié)扎，然后通過(guò)拔出注射針，進(jìn)行大動(dòng)脈狹窄。本模型中通過(guò)這樣的腹部大動(dòng)脈狹窄使得收縮期血壓上升，心臟的后負(fù)荷增大，產(chǎn)生左心室肥大。對(duì)于假手術(shù)(Sham-operation(Sham))組只實(shí)施腹部大動(dòng)脈的剝離。
由于動(dòng)脈的狹窄收縮期血壓在手術(shù)后3個(gè)月、17個(gè)月分別達(dá)到比通常高的232mmHg，188mmHg值。在3個(gè)月時(shí)確認(rèn)心臟重量/體重比有意義上升，而17個(gè)月的大鼠與3個(gè)月相比，作為心功能指標(biāo)的Fractional Shortening(FS)由52％降低到26％。因此將狹窄手術(shù)后3個(gè)月作為代償性肥大期，17個(gè)月作為非代償性慢性心衰竭期，分別采取它們的左心室和假手術(shù)組的左心室。
C.腹部動(dòng)靜脈分流大鼠(容量負(fù)荷模型由于容量負(fù)荷引起的大鼠心肥大模型ACS)的制作以及左心室樣品的采取實(shí)驗(yàn)中使用Sprague-Dawley系的9周齡雄性大鼠。通過(guò)向腹腔內(nèi)注入戊巴比妥鈉(40mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，然后腹臥位固定，開(kāi)腹后，使腹部大動(dòng)脈露出，在大動(dòng)脈的腎動(dòng)脈分支部位以及大腿動(dòng)脈分支部位分別用夾子止住血流。在止血部位將18G注射針插入大動(dòng)脈內(nèi)，使大靜脈貫通，制作動(dòng)靜脈分離。拔出注射針，用手術(shù)用粘合劑塞住動(dòng)脈部位的傷口，松開(kāi)夾子。在確認(rèn)在分流部動(dòng)脈血流入靜脈內(nèi)后，進(jìn)行開(kāi)腹。在本模型中通過(guò)這樣的腹部大動(dòng)靜脈分流的形成，靜脈壓上升，心臟的前負(fù)荷增大，按照右心房、右心室、左心房、左心室順序施加負(fù)荷，產(chǎn)生肥大。進(jìn)而，由于靜脈系的伸縮率(compliance)低，所以血液貯流，呈現(xiàn)出肺充血。在假手術(shù)[Sham-operation(Sham)]組中只實(shí)施腹部大動(dòng)靜脈的剝離。
在術(shù)后3個(gè)月、11個(gè)月通過(guò)超聲心動(dòng)進(jìn)行心功能測(cè)定后，對(duì)解剖、心重量以及解剖所見(jiàn)進(jìn)行了確認(rèn)。與手術(shù)后3個(gè)月相比，11個(gè)月的大鼠的血細(xì)胞比容值低下，同時(shí)所有例子都產(chǎn)生肺水腫，認(rèn)為是容量負(fù)荷進(jìn)行的結(jié)果。另外右心系的心重量/體重比和肺重量/體重比增加，表明充血由右心室擴(kuò)展到肺。FS由57％降低到31％。因此，判斷分流手術(shù)后3個(gè)月為代償期，11個(gè)月為非代償性慢性心衰竭期，分別采取它們的左心室和假手術(shù)組的左心室。
D.自然發(fā)病高血壓大鼠(壓負(fù)荷模型)的制作以及左心室樣品的采取對(duì)已知的作為自然發(fā)病高血壓大鼠的SHR大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，隨時(shí)測(cè)定血壓、超聲心動(dòng)。3個(gè)月齡的SHR的血壓以及心重量/體重比比通常的高，表現(xiàn)出由于高血壓引起的心肥大。在19個(gè)月齡，除了立毛、坐等外在表觀外，F(xiàn)S由56％降低到32％，收縮期血壓也低下，表現(xiàn)出慢性心衰竭。另外還看到胸水、浮腫等癥狀。分別通過(guò)解剖采取左心室。
E.心肌梗塞后心衰竭模型大鼠的制作以及左心室樣品的采取使用體重180g-200g的Sprague-Dawley(SD)大鼠，進(jìn)行冠動(dòng)脈結(jié)扎。結(jié)扎4周后進(jìn)行心功能測(cè)定，心臟摘出后測(cè)定心肺重量(左右心室、肺)。對(duì)于心功能進(jìn)行擴(kuò)張末期壓、最大收縮期壓的測(cè)定。擴(kuò)張末期壓隨著心衰竭的惡化上升，就該模型來(lái)說(shuō)，相對(duì)于sham組，Vehicle組上升3.1倍。最大收縮期壓，相對(duì)于sham組，Vehicle組降低29％。右心室重量與體重的比隨著心肥大而上升，就該模型來(lái)說(shuō)，相對(duì)于sham組，Vehicle組上升2.2倍。肺重量隨著心功能的低下，由于充血而上升，就該模型來(lái)說(shuō)，相對(duì)于sham組，Vehicle組上升2.3倍。由此認(rèn)為本模型是經(jīng)歷心肌梗塞后的心肥大引起的代償期達(dá)到心衰竭的典型的心衰竭模型。
通過(guò)解剖采取左心室非梗塞區(qū)域。
1.2蛋白質(zhì)樣品的制作相對(duì)于大鼠心臟1/4量，加入1ml的勻漿緩沖液1(20mM TrisHCl pH7.4，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM PMSF)。用勻漿機(jī)將組織破壞后再進(jìn)行超聲處理。經(jīng)離心得到上清，作為可溶性蛋白級(jí)分。將沉淀用同樣勻漿緩沖液洗凈后，加入與沉淀同體積的勻漿緩沖液2(勻漿緩沖液1+2％triton X100)，再次混合后將離心后的上清作為膜蛋白和膜相互作用蛋白級(jí)分。
1.3蛋白質(zhì)的定量使用利用了蛋白質(zhì)中肽鍵與銅的二價(jià)離子螯合，與Bicinchoninic acid(BCA)反應(yīng)呈紫色現(xiàn)象的BCA法簡(jiǎn)化的Pierce公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白使用試劑盒附帶的牛血清白蛋白。
1.4雙向電泳A.第一向電泳將相當(dāng)于125～750μg的蛋白質(zhì)懸浮于樣品緩沖液(8M Urea，0.5％Triton X-100，10mM DTT，Orange G微量)中，用該懸浮液使干燥膠(Pharmacia Biotech.公司生產(chǎn)Immobiline Drystrip)膨潤(rùn)。使用Pharmacia Biotech.公司生產(chǎn)的MultiphorII，按照制造者的標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行電泳。電泳后于-20℃下可以保存一周左右，隨時(shí)供第二向電泳用。
B.第二向電泳將上述凝膠用平衡緩沖液(50mM Tris-HCl，6M Urea，30％glycerol，1％SDS)進(jìn)行前處理后，放置在聚丙烯酰胺凝膠上。使用Biorad公司生產(chǎn)的電泳裝置進(jìn)行電泳。電泳后立即將蛋白固定于凝膠中，同時(shí)用銀染色法進(jìn)行染色，得到雙向電泳圖。
1-5蛋白表達(dá)比較解析對(duì)同一樣品最少進(jìn)行2次電泳，將在各個(gè)模型中與組內(nèi)的最低2個(gè)個(gè)體有關(guān)的表達(dá)變化具有再現(xiàn)性的蛋白吸出。在被吸出的這些蛋白中，將多數(shù)的模型中共同變化的因子與慢性心衰竭相關(guān)蛋白質(zhì)確立位置關(guān)系。其中通過(guò)下面實(shí)施例1-6對(duì)鑒定為AOP-1的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行數(shù)值化的圖如圖1所示。在圖1中Dah1、AOB、ACS、SHR分別稱(chēng)為上述的1-1.A至D.中制作的慢性心衰竭病態(tài)模型大鼠。
1-6蛋白質(zhì)的鑒定A.目的蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠中的回收將凝膠片用適當(dāng)?shù)木彌_液洗凈后，除去SDS。使胰蛋白酶(trypsin)(PROMEGA公司生產(chǎn))浸透凝膠內(nèi)，通過(guò)對(duì)凝膠中的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，使其片段化，然后從凝膠網(wǎng)孔中洗脫出來(lái)。
B.通過(guò)質(zhì)量分析鑒定AOP-1將上述A中得到的目的蛋白質(zhì)的片段組混合物直接用MicroMass公司生產(chǎn)的質(zhì)量分析儀(電噴射離子化法/飛行型質(zhì)量分析儀)進(jìn)行解析，得到目的蛋白質(zhì)片段組的質(zhì)量信息。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)一部分片段照射氦氣，使肽鍵斷裂，得到蛋白質(zhì)片段的內(nèi)部序列N末端[H(I/L)SVNDL]]C末端和質(zhì)量信息(親離子分子量1206.6、子離子分子量1069.481，956.428，869.418，770.379，656.336，541.324，428.244)。以這些信息為基礎(chǔ)對(duì)網(wǎng)上公開(kāi)的基因序列數(shù)據(jù)資料進(jìn)行檢索，對(duì)AOP-1進(jìn)行鑒定(SwissProt Accession No.P20108序列6)。
實(shí)施例2AOP-1基因的表達(dá)解析用通過(guò)實(shí)施例1-1-A～D記載的方法得到的左心室作為樣品。
使用ISOGEN(日本基因公司生產(chǎn))按照說(shuō)明書(shū)記載的方法從各左心室制備總RNA，進(jìn)行DNase處理。使用TaqMan(登錄商標(biāo))Reverse Transcription Reagents(PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))從DNase處理的總RNA各1μg于50μl反應(yīng)液中合成cDNA?；虻谋磉_(dá)解析通過(guò)使用ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))的real time PCR定量系統(tǒng)進(jìn)行定量。AOP-1檢測(cè)用的引物和TaqMan探針是使用引物設(shè)計(jì)軟件ABI PRISM Primer Express以小鼠AOP-1 cDNA堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。正向引物5’TGCAGTTTCAGTGGATTCCCA3’(序列7)、反向引物5’TTCATGTGGCCCAAACCA3’(序列8)、TaqMan探針5’TCTTGCCTGGATCAACACACCAAGAAAG3’(序列9)。
real time PCR定量反應(yīng)以上述cDNA 1μl作為模板，于40μl反應(yīng)液中，使用TaqMan(登錄商標(biāo))Universal PCR Mater Mix(PEApplied Biosystems公司生產(chǎn))，按照說(shuō)明書(shū)記載的方法進(jìn)行。使用同樣的方法對(duì)GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行解析，用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。GAPDH向引物5’TGCACCACCAACTGCTTAG3’(序列24)反向引物5’GGATGCAGGGATGATGTTC3’(序列25)、TaqMan探針5’CAGAAGACTGTGGATGGCCCCTC3’(序列26)。GAPDH是構(gòu)成的蛋白質(zhì)之一，一般都用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。解析結(jié)果如圖2所示。結(jié)果在所有模型中都發(fā)現(xiàn)伴隨慢性心衰竭病態(tài)的發(fā)展，AOP-1基因的表達(dá)低下。
實(shí)施例3TSA(PRx2)，CuZn-SOD，Mn-SOD，過(guò)氧化氫酶基因的表達(dá)解析用通過(guò)實(shí)施例1-1，E記載的方法得到的左心室作為樣品。
使用ISOGEN(日本基因公司生產(chǎn))按照說(shuō)明書(shū)記載的方法從左心室制備總RNA，進(jìn)行DNase處理。使用TaqMan(登錄商標(biāo))ReverseTranscription Reagents(PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))從DNase處理的總RNA各1μg于50μl反應(yīng)液中合成cDNA?；虻谋磉_(dá)解析通過(guò)使用ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))的real time PCR定量系統(tǒng)進(jìn)行定量。檢測(cè)用的引物和TaqMan探針是使用引物設(shè)計(jì)軟件ABI PRISM Primer Express以大鼠TSA，CuZn-SOD，Mn-SOD，catalase cDNA的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。大鼠TSA正向引物5’CCCTCTGCTTGCTGATGTGACT3’(序列10)、反向引物5’CCTGTAAGCGATGCCCTCAT3’(序列11)、TaqMan探針5’AGCTTGTCCCAGAATTACGGCGTGTTGAA3’(序列12)。CuZn-SOD正向引物5’GCGGATGAAGAGAGGCATG3’(序列13)、反向引物5’GCCACACCGTCCTTTCCA3’(序列14)、TaqMan探針5’TGGAGACCTGGGCAATGTGGCTG3’(序列15)。catalase正向引物5’ACGGGTGCTCAGCCTCC3’(序列16)、反向引物5’AGGCTTGTGCCCTGCTTC3’(序列17)、TaqMan探針5’CAGCCTGCACTGAGGAGATCCCTCA3’(序列18)。Mn-SOD正向引物5’TTACAGATTGCCGCCTGCTC3’(序列21)、反向引物5’CCAGCAGTGGAATAAGGCCT3’(序列22)、TaqMan探針5’AATCACGACCCACTGCAAGGAACCA3’(序列23)。
real time PCR定量反應(yīng)以上述cDNA 1μl作為模板，于40l反應(yīng)液中，使用TaqMan(登錄商標(biāo))Universal PCR Mater Mix(PEApplied Biosystems公司生產(chǎn))，按照說(shuō)明書(shū)記載的方法進(jìn)行。使用同樣的方法對(duì)GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行解析，用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。解析結(jié)果如圖3所示。該結(jié)果在相對(duì)于sham組的Vehicle組中可以看到AOP-1基因的有意義的表達(dá)低下(p＝0.05)、而在TSA，CuZn-SOD，Mn-SOD，過(guò)氧化氫酶中沒(méi)有看到基因表達(dá)變化。
實(shí)施例4大鼠AOP-1 cDNA的克隆4-1大鼠AOP-1PCR片段的克隆用實(shí)施例2制作的cDNA作為模板，使用正向引物為5’AACCGCGGTCGTGGCTCTTGCGTTCTCT3’(序列19)、反向引物為5’GCGCTAGCTTATTGATGGACCTTCTCAAAG3’(序列20)進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆到PCRII載體(Invitrogen公司生產(chǎn))。
4-2堿基序列的確定堿基序列使用THERMO SequenaseTMII dye terminator cyclesequencing kit(Amersham Pharmacia公司生產(chǎn))通過(guò)型號(hào)為373A的自動(dòng)DNA序列讀取儀(Applied Biosystems公司生產(chǎn))解析確定。對(duì)得到的基因序列查詢GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果判明1個(gè)菌落(pFH1)是與大鼠AOP-1(Genebank Accession No.AF106944序列2)一致的基因。
實(shí)施例5AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體的構(gòu)建5-1粘粒的構(gòu)建使用寶酒造株式會(huì)社生產(chǎn)的腺病毒表達(dá)載體試劑盒(AdenovirusExpression Vector Kit)構(gòu)建腺病毒改變載體。從實(shí)施例3中構(gòu)建的pFH1中切出含有AOP-1基因的SacII，NheI片段，克隆到pQBI25(寶酒造株式會(huì)社生產(chǎn))。然后通過(guò)使用NheI，BamHI使GFP基因缺失，構(gòu)建在CMV啟動(dòng)子的下游帶有AOP-1基因，該基因下游帶有來(lái)自牛生長(zhǎng)激素的poly A信號(hào)的AOP-1表達(dá)單元。將該表達(dá)單元用Bg1II，DraIII切出，使用DNA Blunting試劑盒(寶酒造株式會(huì)社生產(chǎn))使末端變平，克隆到腺病毒表達(dá)載體試劑盒附帶的粘粒pAxcW的SwaI位點(diǎn)。
5-2使用了293細(xì)胞的AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體的制作和擴(kuò)增用上述粘粒和腺病毒表達(dá)載體試劑盒附帶的DNA-TPC共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(Bio Whittaker公司生產(chǎn))。在293細(xì)胞中AOP-1粘粒和引起DNA-TPC同源重組、AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體被構(gòu)建，借助于293細(xì)胞恒定表達(dá)的E1蛋白的作用，作為病毒增殖。而由于作成的AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體缺失了E1基因，只能在人為地組成表達(dá)E1基因那樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)(例如293細(xì)胞)進(jìn)行增殖。
5-3 AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體的滴度檢測(cè)實(shí)施例4-2中構(gòu)建的AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體的滴度檢測(cè)按照腺病毒表達(dá)載體試劑盒附帶的說(shuō)明書(shū)記載的方法依次進(jìn)行。
實(shí)施例6大鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞的制作和AOP-1基因?qū)雽?duì)出生后1至3天的新生大鼠用乙醚麻醉，斷頭后摘出心臟。將心室剝離出來(lái)，通過(guò)膠原酶(warthington biomedicalcorporation公司生產(chǎn))消化，使細(xì)胞分散。用Percoll(amershampharmacia biotech公司生產(chǎn))進(jìn)行密度梯度離心，分別收集心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞。使用混合有終濃度為10％胎牛血清(EQUITECH-BIO公司生產(chǎn))的日研生物醫(yī)學(xué)研究所生產(chǎn)的D-MEM(低糖)培養(yǎng)基，對(duì)收集的心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。用實(shí)施例5制作的AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體以1.6×102(M.O.I.)感染1小時(shí)后，用培養(yǎng)基清洗2次。培養(yǎng)24小時(shí)后供實(shí)施例7使用。
實(shí)施例7對(duì)導(dǎo)入基因的細(xì)胞進(jìn)行無(wú)氧培養(yǎng)、再氧化應(yīng)激應(yīng)答解析使用通過(guò)與實(shí)施例5同樣的方法制作的β-半乳糖苷酶表達(dá)腺病毒改變載體，用與實(shí)施例6同樣的方法制作β-半乳糖苷酶強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞。將強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞作為通過(guò)在基因?qū)胂凳篃o(wú)害無(wú)益蛋白質(zhì)強(qiáng)制表達(dá)的比較對(duì)照組，用于以下實(shí)驗(yàn)中。將實(shí)施例6制作的AOP-1強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞于無(wú)氧培養(yǎng)系中培養(yǎng)24小時(shí)，然后返回到大氣氧濃度、5％二氧化碳濃度的通常培養(yǎng)系(再氧化)，培養(yǎng)72小時(shí)。另外同時(shí)制作在通常氧濃度下進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)的通常氧濃度對(duì)照組。從通常氧濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞、無(wú)氧培養(yǎng)后再氧化培養(yǎng)后的細(xì)胞分別取樣，于顯微鏡下觀察。測(cè)定存活的細(xì)胞數(shù)、自律博動(dòng)的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。然后利用屬于線粒體呼吸鏈的琥珀酸-四唑氮還原酶(Succinate-tetrazolium reductase)系使MTT試劑(NacalaiTesque公司生產(chǎn))還原，使用細(xì)胞存活率、細(xì)胞代謝活性測(cè)定試劑進(jìn)行解析。
結(jié)果表明在通常氧濃度下培養(yǎng)的AOP-1導(dǎo)入組、對(duì)照組間，細(xì)胞存活率沒(méi)有差別，但在無(wú)氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，再氧化培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率在AOP-1基因?qū)虢M中表現(xiàn)出有意義的增加(圖4)。而在無(wú)氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)后、再氧化培養(yǎng)后的細(xì)胞自律博動(dòng)率在AOP-1基因?qū)虢M中表現(xiàn)出有意義的增加(圖5)。另外，在使用MTT的實(shí)驗(yàn)中，于無(wú)氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)后、再氧化培養(yǎng)后也觀察到在AOP-1基因?qū)虢M中MTT分解活性表現(xiàn)出有意義的上升(圖6)。特別是于通常氧濃度下培養(yǎng)，即由于無(wú)傷害狀態(tài)下使細(xì)胞代謝功能激活(圖6)，表明存在著AOP-1有使線粒體功能提高的可能性。
一般來(lái)說(shuō)，處于氧缺乏狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)，引起由需氧能量產(chǎn)生系統(tǒng)切換到厭氧能量產(chǎn)生系統(tǒng)，由于檸檬酸的蓄積等引起的細(xì)胞內(nèi)酸性化傷害、厭氧能量產(chǎn)生系統(tǒng)相對(duì)于需氧能量產(chǎn)生系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是無(wú)效率的，會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)能量的枯竭傷害。而再氧化時(shí)，在線粒體中表現(xiàn)出發(fā)生活性氧類(lèi)，通過(guò)蛋白質(zhì)、DNA、細(xì)胞膜磷脂等氧化，使細(xì)胞受到傷害。本實(shí)施例中的結(jié)果表明，AOP-1可以去除心肌細(xì)胞中的這些傷害，具有保持細(xì)胞正常功能的活性。
由于不僅在缺血型慢性心衰竭(心肌梗塞后慢性心衰竭)，而且在慢性心衰竭中也有報(bào)道起因于心功能低下、心肥大的對(duì)心肌細(xì)胞的血流不足(缺血)，通過(guò)將該蛋白質(zhì)補(bǔ)充到慢性心衰竭狀態(tài)的心肌細(xì)胞中，保護(hù)心肌細(xì)胞，進(jìn)而保持博出功能，可以成為慢性心衰竭治療藥。
實(shí)施例8反義AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體的構(gòu)建從帶有實(shí)施例5用的CMV啟動(dòng)子的下游連接AOP-1基因、該基因下游連接來(lái)自牛生長(zhǎng)激素的poly A信號(hào)的AOP-1表達(dá)單元切出AOP-1基因，切出的兩方的片段用DNA Blunting試劑盒(寶酒造株式會(huì)社生產(chǎn))進(jìn)行平末端化，再進(jìn)行連接。通過(guò)序列解讀確認(rèn)AOP-1被克隆的方向。用Bg1II、DraIII切出該表達(dá)單元，使用DNA Blunting試劑盒(寶酒造株式會(huì)社生產(chǎn))進(jìn)行平末端化，克隆到腺病毒表達(dá)載體試劑盒附帶的粘粒pAxcw的SwaI位點(diǎn)。象實(shí)施例5那樣，使用該粘粒制作病毒載體(腺病毒反義AOP-1粘粒)。
實(shí)施例9反義AOP-1基因強(qiáng)制表達(dá)對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的影響用與實(shí)施例6同樣的方法，制作反義AOP-1、AOP-1、β-半乳糖苷酶強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞。將未導(dǎo)入上述基因細(xì)胞以及導(dǎo)入上述基因細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行72小時(shí)培養(yǎng)后，利用屬于線粒體呼吸鏈的琥珀酸-四唑氮還原酶系使MTT試劑(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))還原，使用細(xì)胞存活率、細(xì)胞代謝活性測(cè)定試劑進(jìn)行解析。這樣操作后，只有在導(dǎo)入反義AOP-1組中有意義地抑制MTT試劑分解物的生成(圖7)。在于顯微鏡下進(jìn)行觀察后，結(jié)果可以看到在反義AOP-1組中存活細(xì)胞數(shù)有意義地減少。由此判明反義AOP-1的強(qiáng)制表達(dá)對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的存活有不利的作用。
實(shí)施例10其他病態(tài)模型的制作
A.腎炎模型制作使用8周齡的Wistar系雌性大鼠。在乙醚麻醉下摘出左腎臟。1小時(shí)后通過(guò)向靜脈內(nèi)注入抗Thy-1單克隆抗體(1-22-3)(500μg/鼠)引起腎炎(Acta Pathol.Jpn.361191，1986)。引起腎炎后一定時(shí)間間隔內(nèi)(1日、4日、7日、14日、28日后)摘出腎臟。
B.septic shock(傳染性肝炎)模型的制作向3只150～300g的同令大鼠腹腔注入脂多糖(lipopolysaccharide)10mg/kg，2小時(shí)后摘出腎臟。
C.腦損傷模型的制作在戊巴比妥鈉麻醉下將slc wistar雄性大鼠(11w)固定于腦定位固定裝置，頭蓋骨露出后，確認(rèn)前鹵、人字縫尖的水平，從前鹵后方4.5mm、側(cè)方2.7mm打開(kāi)一個(gè)直徑約為0.5mm左右的洞。使用微量注射器，從前鹵向下深3.0mm的部位注入鵝羔氨酸0.6μg。72小時(shí)后回收切片用樣品，供基因表達(dá)解析用。鵝羔氨酸是谷氨酸類(lèi)似物，是使NMDA受體具有特異性的化合物。因此，鵝羔氨酸引起的神經(jīng)細(xì)胞傷害是上述谷氨酸傷害的2個(gè)主要機(jī)制中通過(guò)NMDA受體的過(guò)度興奮引起神經(jīng)細(xì)胞傷害的。
實(shí)施例11其他病態(tài)模型中的AOP-1以及其他基因的表達(dá)解析使用ISOGEN(日本基因公司生產(chǎn))按照說(shuō)明書(shū)記載的方法從上述實(shí)施例10得到的各個(gè)臟器的組織制備總RNA，進(jìn)行DNase處理。使用TaqMan(登錄商標(biāo))Reverse Transcription Reagents(PEApplied Biosystems公司生產(chǎn))從DNase處理的總RNA各1μg于50μl反應(yīng)液中合成cDNA?；虻谋磉_(dá)解析通過(guò)使用ABI PRISM7700(PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))的real time PCR定量系統(tǒng)進(jìn)行定量。AOP-1以及其它基因檢測(cè)用的引物以及TaqMan探針是使用引物設(shè)計(jì)軟件ABI PRISM Primer Express以小鼠AOP-1 cDNA堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。AOP-1向引物(序列7)、反向引物(序列8)、TaqMan探針(序列9)。TSA正向引物(序列10)、反向引物(序列11)、TaqMan探針(序列12)。CuZn-SOD正向引物(序列13)、反向引物(序列14)、TaqMan探針(序列15)。過(guò)氧化氫酶正向引物(序列16)、反向引物(序列17)、TaqMan探針(序列18)。Mn-SOD正向引物(序列19)、反向引物(序列20)、TaqMan探針(序列21)。
real time PCR定量反應(yīng)以上述cDNA 1μl作為模板，于40μl反應(yīng)液中，使用TaqMan(登錄商標(biāo))Universal PCR Mater Mix(PEApplied Biosystems公司生產(chǎn))，按照說(shuō)明書(shū)記載的方法進(jìn)行。使用同樣的方法對(duì)GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行解析，用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。解析結(jié)果如圖所示(圖8a腎炎模型、8b腦障礙模型，圖9傳染性肝炎模型)。該結(jié)果在各個(gè)疾病模型的疾病器官中都發(fā)現(xiàn)伴隨病態(tài)的進(jìn)行AOP-1基因的表達(dá)低下。
實(shí)施例12來(lái)自胎仔大鼠的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的制作對(duì)Wistar系妊娠18～20日大鼠用乙醚麻醉后、開(kāi)腹。從子宮取出胎仔，再?gòu)奶プ兄腥〕瞿X，保存在冰冷HBSS(制備組織培養(yǎng)用緩沖液「Nissui」②(日水制藥公司生產(chǎn))9.8g/l、NaHCO30.35g/l，過(guò)濾滅菌)中。然后立即在實(shí)體顯微鏡下分離大腦，用蛋白分解酶木瓜蛋白酶(papain)(worthington公司生產(chǎn))使細(xì)胞分散。使用混合有終濃度為10％的馬血清的日研生物醫(yī)學(xué)研究所公司生產(chǎn)的D-MEM(高葡萄糖)培養(yǎng)基，對(duì)分離提取的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)開(kāi)始后第4天加入含上述血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3天?？傆?jì)培養(yǎng)7天后，通過(guò)AOP-1或β-半乳糖苷酶腺病毒載體導(dǎo)入基因。導(dǎo)入基因后培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行谷氨酸傷害、無(wú)血清化等刺激。
實(shí)施例13AOP-1對(duì)于培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的谷氨酸傷害保護(hù)作用的檢測(cè)對(duì)于實(shí)施例12制作的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)與實(shí)施例6同樣的方法導(dǎo)入AOP-1基因。象實(shí)施例7那樣將β-半乳糖苷酶強(qiáng)制表達(dá)的組作為比較對(duì)照組，用于以下的實(shí)驗(yàn)。加入谷氨酸(終濃度分別為0，100，500μM)，培養(yǎng)48小時(shí)后，供MTT分析。用不加谷氨酸的各個(gè)基因?qū)虢M的MTT值除谷氨酸傷害組的MTT值得到的值作為神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率進(jìn)行作圖(圖10)。另外在圖10中的MK-801是(+)-二苯并環(huán)庚烯亞胺(dibenzocyclohepteneimine)，是NMDA受體的拮抗劑，表現(xiàn)出使神經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞免于谷氨酸傷害(Eur J Pharmacol 1993Vol.248(4)303-312)。就象圖中所示那樣，導(dǎo)入AOP-1組與未添加MK-801組中導(dǎo)入β-半乳糖苷酶組比較，表現(xiàn)出有保護(hù)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞傾向。而與添加MK-801組中導(dǎo)入β-半乳糖苷酶組進(jìn)行比較，由于表現(xiàn)出有意義地保護(hù)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞作用，所以表明AOP-1對(duì)MK-801的保護(hù)作用有相加作用。在神經(jīng)細(xì)胞的谷氨酸傷害中，發(fā)現(xiàn)了通過(guò)上述的NMDA受體的鈣過(guò)負(fù)荷和借助于胱氨酸、谷氨酸的反向轉(zhuǎn)運(yùn)(cystine，glutamate-antiporter)活化的細(xì)胞內(nèi)胱氨酸(cystine)枯竭這兩種傷害(Neuroscience 1992 Vol.48(4)906-914)。由上述結(jié)果可以認(rèn)為AOP-1對(duì)上述兩種傷害都具有保護(hù)作用。
實(shí)施例14AOP-1對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)突觸伸展促進(jìn)作用的檢測(cè)對(duì)實(shí)施例12中未添加谷氨酸的細(xì)胞(10％FBS組)、添加谷氨酸(10％FBS組+100μM谷氨酸組)無(wú)血清(0％FBS組)進(jìn)行照像(圖11)。
在各種刺激存在下在導(dǎo)入AOP-1組中經(jīng)常觀察到神經(jīng)突觸伸展促進(jìn)、保護(hù)作用。
實(shí)施例15AOP-1、TSA、CuZn-SOD對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用的比較使用實(shí)施例4記載的方法獲得rat TSA，進(jìn)行序列確認(rèn)(序列27)。序列28表示由序列27翻譯的蛋白質(zhì)序列。另外CuZn-SOD使用從著者獲得的含有文獻(xiàn)(FEBS letter 1990 Vol.20269(1)89-92)記載的人CuZn-SOD基因(序列29)的質(zhì)粒(pYS0200)。序列30表示由序列29翻譯的蛋白質(zhì)序列。對(duì)于各個(gè)基因使用實(shí)施例5記載的方法，制作TSA表達(dá)腺病毒改變載體、CuZn-SOD表達(dá)腺病毒改變載體。另外在用實(shí)施例6記載的方法制作的培養(yǎng)心肌細(xì)胞中，使用實(shí)施例6記載的方法導(dǎo)入基因。有關(guān)應(yīng)激抗性的解析如下進(jìn)行。
①無(wú)氧條件培養(yǎng)(Hypoxia)時(shí)的細(xì)胞存活率導(dǎo)入基因后培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞暴露于無(wú)氧條件下再培養(yǎng)24小時(shí)。使用實(shí)施例7記載的MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。導(dǎo)入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的細(xì)胞分別相對(duì)于對(duì)照(導(dǎo)入β-半乳糖苷酶的細(xì)胞)表現(xiàn)出存活率有意義增加作用(p＜0.01)。導(dǎo)入AOP-1基因的細(xì)胞相對(duì)于導(dǎo)入TSA的細(xì)胞存活率有意義增加，相對(duì)于導(dǎo)入CuZn-SOD細(xì)胞存活率表現(xiàn)出增加傾向(圖12a)。
②暴露于過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞存活率導(dǎo)入基因后培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞暴露于0.1、1mM的過(guò)氧化氫再培養(yǎng)24小時(shí)。使用實(shí)施例7記載的MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。導(dǎo)入AOP-1基因的細(xì)胞的細(xì)胞存活率相對(duì)于對(duì)照有意義增加(p＜0.05)。但在導(dǎo)入TSA、CuZn-SOD組雖然表現(xiàn)出細(xì)胞存活率改善傾向，但從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看無(wú)意義(p＜0.05)(圖12b)。
③高葡萄糖培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活率導(dǎo)入基因后培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞暴露于30mM葡萄糖(是通常濃度的6倍左右)再培養(yǎng)24小時(shí)。使用實(shí)施例7記載的MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。導(dǎo)入AOP-1基因的細(xì)胞的細(xì)胞存活率相對(duì)于對(duì)照有意義增加(p＜0.05)。然而在導(dǎo)入CuZn-SOD組雖然表現(xiàn)出細(xì)胞存活率改善傾向，但從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看無(wú)意義。
另外在導(dǎo)入TSA基因的細(xì)胞中，相對(duì)于對(duì)照存活率沒(méi)有差別(圖12c)。高葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)類(lèi)似于糖尿病時(shí)高血糖狀態(tài)，AOP-1對(duì)與糖尿病有關(guān)的合并癥也有效。
實(shí)施例16AOP-1對(duì)心臟的保護(hù)作用對(duì)大鼠心臟進(jìn)行AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體感染。同時(shí)使用稀釋液(生理鹽水)制作只進(jìn)行感染操作的Sham組。感染方法按照文獻(xiàn)(circulation 2001 Vol.104 1424-1429)報(bào)道進(jìn)行。對(duì)導(dǎo)入后4-5天動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)后，供Langendorff法缺血再灌注實(shí)驗(yàn)用。用戊巴比妥鈉(50mg/kg，i.p.)麻醉，從尾靜脈注入肝素(heparin)(500U/kg)。開(kāi)胸后，心臟與肺一起摘出，將插管插入大動(dòng)脈后，利用Langendorff法(70mmHg定壓灌流)進(jìn)行灌流。將連接在壓力交換器的乳膠氣球從左心耳插入左心室內(nèi)，測(cè)定左心室壓。向氣球內(nèi)充水使左心室舒張末期壓約為5mmHg。灌流液使用modified KrebsHenseleit bicarbonate buffer(mMNaCl 118，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，葡萄糖11.0)。通過(guò)起博器將右心房在約280bpm下起博，使心博數(shù)保持一定。
通過(guò)使灌流液停止35分鐘，實(shí)施缺血，然后再灌注30分鐘，制作缺血再灌注損傷。在缺血前和再灌注30分鐘后測(cè)定左心室壓，求心功能恢復(fù)率。另外測(cè)定從缺血開(kāi)始直至產(chǎn)生缺血僵硬為止的時(shí)間。表明缺血僵硬與心肌細(xì)胞ATP枯竭有密切關(guān)系(J Mol Cell Cardiol1996，Vol.28，1045-1057)。通過(guò)測(cè)定釋放到心灌流液中乳酸脫氫酶(LDH)活性(再灌注后1～30分鐘)，比較心肌細(xì)胞壞死量。
使AOP-1強(qiáng)制表達(dá)的心臟相對(duì)于只進(jìn)行導(dǎo)入基因操作的Sham組的心臟，再灌注時(shí)的功能恢復(fù)有意義良好(圖13a)。對(duì)從缺血開(kāi)始直至產(chǎn)生缺血僵硬為止的時(shí)間進(jìn)行計(jì)測(cè)，結(jié)果AOP-1強(qiáng)制表達(dá)的心臟，相對(duì)于對(duì)照組(Sham組)具有有意義延長(zhǎng)效果(圖13b)。這表明AOP-1抑制缺血時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)的ATP減少。另外，測(cè)定缺血再灌注后釋放到心灌流液中的LDH活性量，結(jié)果在AOP-1組，相對(duì)于對(duì)照組有意義的抑制LDH釋放(圖13c)。LDH的釋放一般都作為與細(xì)胞傷害、細(xì)胞壞死相關(guān)的標(biāo)志蛋白(Am J Physiol2001，Vol.280，H2313-2320)。因此認(rèn)為AOP-1抑制再灌注時(shí)的細(xì)胞壞死。由上述結(jié)果可以判明AOP-1不僅對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞，而且在生物體內(nèi)，除了抗氧化作用以外，還通過(guò)新的線粒體活化作用，對(duì)缺血傷害、再灌注傷害都有保護(hù)作用。
實(shí)施例17AOP-1對(duì)腦的保護(hù)作用使用實(shí)施例10-c制作腦損傷模型的手法，向腦海馬內(nèi)注入8.5×106PFU的AOP-1表達(dá)腺病毒改變載體。注入72后小時(shí)，在同一部位象實(shí)施例10c那樣注入鵝羔氨酸。作為對(duì)照組，制作導(dǎo)入β-半乳糖苷酶基因組，同樣實(shí)施鵝羔氨酸處理。72小時(shí)后回收組織切片用樣品，12天后進(jìn)行periferal benzodiazephine binding site(PTBBS)解析用樣品回收。所謂PTBBS解析是以對(duì)benzodiazephine的結(jié)合性作為指標(biāo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和游走的定量解析方法。該方法一般都用作對(duì)由于神經(jīng)細(xì)胞死亡引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、游走增殖的所謂神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)行測(cè)定的方法(Journal of Neuroimmunology 2000 Vol.1009 105-111，BrainResearch 1991 Vol.565 312-320)。使用切片用的樣品，利用冷凍切片法制作厚10μm切片，供神經(jīng)細(xì)胞特異染色方法的尼斯耳氏染色用。PTBBS解析用的樣品通過(guò)密閉式組織破碎器破壞海馬，制作組織溶解液。用實(shí)施例1-3記載的方法求蛋白質(zhì)濃度。將氚標(biāo)記的benzodiazephine與組織溶解液混合，于37℃下進(jìn)行1小時(shí)結(jié)合反應(yīng)。然后將蛋白質(zhì)和與蛋白質(zhì)結(jié)合的氚標(biāo)記的benzodiazephine加到玻璃纖維濾膜收集，洗滌除去沒(méi)有結(jié)合的氚標(biāo)記的benzodiazephine。對(duì)上述玻璃纖維濾膜的放射能進(jìn)行定量。在PTBBS解析中相對(duì)于對(duì)照組(β-半乳糖苷酶表達(dá)組)，導(dǎo)入AOP-1基因組有意義地抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和游走(圖14a)。另外，對(duì)組織切片中神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行特異染色，可知相對(duì)于對(duì)照組，在導(dǎo)入AOP-1基因組，神經(jīng)細(xì)胞被定性保護(hù)(圖14b)。通過(guò)上述解析判明AOP-1具有保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的效果。
實(shí)施例18AOP-1對(duì)腎的保護(hù)作用從7周齡雌性Wister大鼠摘出一側(cè)腎，注入Thy-1抗體。注入Thy-1抗體后立即向部分動(dòng)物的靜脈內(nèi)注入強(qiáng)制表達(dá)AOP-1或β-半乳糖苷酶的腺病毒載體。每周進(jìn)行一次腺病毒載體感染，共計(jì)進(jìn)行3次。Thy-1致敏后，于第3天、7天、14天、28天回收血液樣品，進(jìn)行血中尿素氮量(BUN)的解析。于28天后進(jìn)行組織回收，通過(guò)糖蛋白染色法的PAS染色得到組織圖像。在組織圖像解析結(jié)果導(dǎo)入AOP-1基因組中的一個(gè)體中，由于與處于Thy-1腎炎的其他個(gè)體所見(jiàn)進(jìn)行比較之后發(fā)現(xiàn)人為的病因，并且在通過(guò)拋棄測(cè)定(Thompson)對(duì)Day7的BUN解析的結(jié)果進(jìn)行解析時(shí)也被拋棄，所以從解析中除去。
圖15a表示了血中BUN量隨時(shí)間的變化。在Day7，sham組(沒(méi)有引起Thy-1腎炎、沒(méi)有導(dǎo)入基因組)與Vehicle組(引起Thy-1腎炎、沒(méi)有導(dǎo)入基因組)之間存在有意義差別，而在其他所有時(shí)期內(nèi)Vehicle組、sham組間看不到有意義差別。關(guān)注Day7的結(jié)果(圖15b)，結(jié)果表明相對(duì)于Vehicle組在AOP-1基因?qū)虢M間看到有意義保護(hù)作用。而導(dǎo)入AOP-1組相對(duì)于Sham組沒(méi)有看到有意義差別。圖15c給出了典型的組織圖像。在Vehicle導(dǎo)入組，在方框圍起來(lái)的部位中看到大范圍的腎小管的萎縮圖像，正常腎小管幾乎不存在，而在Sham組中完全看不到傷害。在AOP-1導(dǎo)入組中用方框圍起來(lái)的部位也能看到腎小管萎縮，但由于其范圍與Vehicle組相比很局限，因此正常腎小管占絕對(duì)多數(shù)。用圓圈圍起來(lái)的部位表示腎小球。將Sham組和Vehicle組進(jìn)行比較，看到的色素沉著(深紫色的部位*標(biāo)記)范圍很大。將AOP-1導(dǎo)入組和Vehicle組進(jìn)行比較，該色素沉著在AOP-1組中少。該色素沉著表示腎小球膜細(xì)胞的增殖。表明腎小球膜細(xì)胞是伴隨有腎小球傷害出現(xiàn)的(Lab.Invest.1992 Vol.66485-497)，另外也表明過(guò)量的腎小球膜細(xì)胞增殖會(huì)誘導(dǎo)由于腎小球硬化引起的功能損傷(Kidney international 1995 Vol.48 111-117)。因此色素沉著的抑制，即腎小球膜細(xì)胞的增殖抑制可以認(rèn)為是AOP-1保護(hù)腎功能的結(jié)果。由以上結(jié)果可以判明AOP-1具有抑制腎損傷的能力。
序列表<110>第一三得利制藥株式會(huì)社株式會(huì)社第一三得利生物醫(yī)學(xué)研究所<120>伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的治療方法以及該疾病的治療藥<130>YCT-687<160>30<210>1<211>1542<212>mRNA<213>人類(lèi)(Homo sapiens)<400>1ctgaagatgg cggctgctgt aggacggttg ctccgagcgt cggttgcccg acatgtgagt 60gccattcctt ggggcatttc tgccactgca gccctcaggc ctgctgcatg tggaagaacg 120agcttgacaa atttattgtg ttctggttcc agtcaagcaa aattattcag caccagttcc 180tcatgccatg cacctgctgt cacccagcat gcaccctatt ttaagggtac agccgttgtc 240aatggagagt tcaaagacct aagccttgat gactttaagg ggaaatattt ggtgcttttc 300ttctatcctt tggatttcac ctttgtgtgt cctacagaaa ttgttgcttt tagtgacaaa 360gctaacgaat ttcacgatgt gaactgtgaa gttgtcgcag tctcagtgga ttcccacttt 420agccatcttg cctggataaa tacaccaaga aagaatggtg gtttgggcca catgaacatc 480gcactcttgt cagacttaac taagcagatt tcccgagact acggtgtgct gttagaaggt 540tctggtcttg cactaagagg tctcttcata attgacccca atggagtcat caagcatttg 600agcgtcaacg atctcccagt gggccgaagc gtggaagaaa ccctccgctt ggtgaaggcg 660ttccagtatg tagaaacaca tggagaagtc tgcccagcga actggacacc ggattctcct 720acgatcaagc caagtccagc tgcttccaaa gagtactttc agaaggtaaa tcagtagatc 780acccatgtgt atctgcacct tctcaactga gagaagaacc acagttgaaa cctgctttta 840tcattttcaa gatggttatt tgtagaaggc aaggaaccaa ttatgcttgt attcataagt 900attactctaa atgttttgtt tttgtaattc tggctaggac cttttaaaca tggttagttg 960ctagtacagg aatcgtttat tggtaacatc ttggtggctg gctagctagt ttctacagaa 1020cataatttgc ctctatagaa ggctattctt agatcatgtc tcaatggaaa cactcttctt 1080tcttagcctt acttgaatct tgcctataat aaagtagagc aacacacatt gaaagcttct 1140gatcaacggt cctgaaattt tcatcttgaa tgtctttgta ttaaactgaa ttttctttta 1200agctaacaaa gatcataatt ttcaatgatt agccgtgtaa ctcctgcaat gaatgtttat 1260gtgattgaag caaatgtgaa tcgtattatt ttaaaaagtg gcagagtgac ttaactgatc 1320atgcatgatc cctcatccct gaaattgagt ttatgtagtc attttactta ttttattcat 1380tagctaactt tgtctatgta tatttctaga tattgattag tgtaatcgat tataaaggat 1440
atttatcaaa tccagggatt gcattttgaa attataatta ttttctttgc tgaagtattc 1500attgtaaaac atacaaataa catatttaaa caaaaaaaaa aa1542<210>2<211>1433<212>mRNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2gctatcgtgg ctcttgcgtt ctctgaagat ggcggcagct gcgggaaggt tgctctggtc 60ctcggtggct cggcctgcga gcactatttt ccggagtatt tctgcctcaa cagttcttag 120gcctgttgct tctagaagaa cctgcttgac agacatgctg tggtctgcct gtccccaagc 180 aaagtttgcc tttagcaccagttcttcatt ccacacccct gctgtcaccc agcatgcgcc 240ccattttaaa ggtactgctg ttgtcaatgg agagttcaaa gagctgagtc tcgacgactt 300taaggggaaa tacttggtgc ttttcttcta ccctttggat ttcacatttg tgtgtcctac 360agaaattgtt gctttcagtg acaaagccaa tgagtttcat gacgtaaact gtgaagtagt 420tgcggtttct gtggattccc acttcagtca tcttgcctgg atcaacacgc caagaaagaa 480tggtggtttg ggccacatga acatcacgct gttgtcggac ttaactaagc agatatcccg 540agactacgga gtactgttgg aaagtgctgg cattgcgctc agaggtctct tcattattga 600ccctaatggt gtcatcaagc acctgagtgt caatgacctt ccggtgggcc gaagtgtgga 660agaaccactc cgtttggtaa aggcgttcca gtttgtggag acccatggag aagtctgccc 720acccaactgg acaccagagt cccctacgat caagccaagt ccaacagctt caaaagagta 780ctttgagaag gtccatcaat aataggtcat cctatgtctg ctggtttacc tgaagcttct 840catgccaaaa gagagcccca gctggaatcc tgaagattat ttatagaatg gcaaaaacct 900caccatgctt gtgtttataa gtactgctcc atgggctttg taattttaag acaggttcag 960gttaaaggtg gccagctcct tccatagctg tccttactag ggacttcttg atggctacca 1020attctctaca agtgcttggt ccccatttct tagatcatgt cttcagaggg ttaagatttc 1080ttagcctgcc ctgaagcttg gtctacagtg aagtagcaca tagcaccagt acttagtgaa 1140atgaagtagc acatagcgcc agcacttagt gaaatgaagt agcatatagt gccagcactt 1200agtgaaagct tctgatcaag gtcctgaaat ttcctcttgg atttttgtta attatgctga 1260atttcccatt attttttagt gtagtcatta actcacagtg tccttgtgtg ttctaaggta 1320ttgatgagtt ataatcatga aggactatgt ttctaaaaca ctatgtcatt ttcttttctt 1380caagtgctgg atgtaaagaa taaaaataaa cattaagata aaaaaaaaaa aaa1433<210>3<211>1382<212>mRNA<213>小鼠
<400>3ctactcctcg gtatctccgc ctatcgtgcc tcttgcgtgc tctgaagatg gcggcagctg 60cgggaaggtt gctctggtcc tcggttgctc gtcatgcaag tgctatttcc cggagtattt 120ctgcctcaac agttcttagg cctgttgctt ctagaagaac ctgtttgaca gacatactgt 180ggtctgcctc tgcccaagga aagtcagcct ttagcaccag ttcctctttc cacacccctg 240ctgtcaccca gcacgcgccc tattttaaag gtactgctgt tgtcaatgga gagttcaaag 300agctgagtct cgacgacttt aagggaaaat acttggtgct tttcttctac cctttggatt 360tcacatttgt gtgtcctaca gaaattgttg ctttcagtga caaagccaat gaatttcatg 420atgtaaactg tgaagtagtt gcagtttcag tggattccca cttcagtcat cttgcctgga 480tcaacacacc aagaaagaat ggtggtttgg gccacatgaa catcacactg ttgtcggata 540taactaagca gatatcccga gactacggag tgctgttgga aagtgctggc attgcactca 600gaggtctctt cattattgac cctaatggtg tcgtcaagca cctgagtgtc aacgaccttc 660cggtgggccg cagtgtggaa gaaacactcc gtttggtaaa ggcgttccag tttgtagaga 720cccatggaga agtctgccca gccaactgga caccagagtc ccctacgatc aagccaagtc 780caacagcttc caaagagtac tttgagaagg tccatcagta ggccatccta tgtctgcaat 840tacctgaagc ttttcaggcc aaaaaagagc cccagctgga atccttccaa tgccttgaag 900attatttata gaatggcaaa acctcattat gtttgtgttt ataagtactg ctccacaggc 960tttgtaattc taagacaggt tcaggctctc taaaggtggc tagctgcttc catagctgcc 1020cttactaggg acttcttggt ggctaaccaa ttctccccga gtgctttgcc cccatttctt 1080ggatcatgtc cttagagggt aagcattctt tcccttagcc tgccctgaac cttggtctac 1140agtgaagtag cacatagtgc cagtacttgg tgaaatgaag tagcacatag caccagcact 1200taatggaagc ttctgatcaa ggtcctaaaa tttcctcttg aatttttgtg aattatgctg 1260aatttccctt tttttttttt taaacagtgt ccttgtgtgt tctgaggtat tgaagaggta 1320taatcatgaa ggactatgtc taatccataa gtcattttct tcaagagctg gatatataga 1380at1382<210>4<211>256<212>PRT<213>人類(lèi)<400>4Met Ala Ala Ala Val Gly Arg Leu Leu Arg Ala Ser Val Ala Arg His5 10 15Val Ser Ala Ile Pro Trp Gly Ile Ser Ala Thr Ala Ala Leu Arg Pro20 25 30Ala Ala Cys Gly Arg Thr Ser Leu Thr Asn Leu Leu Cys Ser Gly Ser35 40 45
Ser Gln Ala Lys Leu Phe Ser Thr Ser Ser Ser Cys His Ala Pro Ala50 55 60Val Thr Gln His Ala Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Ala Val Val Asn Gly65 70 75 80Glu Phe Lys Asp Leu Ser Leu Asp Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu Val85 90 95Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile100 105 110Val Ala Phe Ser Asp Lys Ala Asn Glu Phe His Asp Val Asn Cys Glu115 120 125Val Val Ala Val Ser Val Asp Ser His Phe Ser His Leu Ala Trp Ile130 135 140Asn Thr Pro Arg Lys Asn Gly Gly Leu Gly His Met Asn Ile Ala Leu145 150 155 160Leu Ser Asp Leu Thr Lys Gln Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Leu165 170 175Glu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro Asn180 185 190Gly Val Ile Lys His Leu Ser Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser195 200 205Val Glu Glu Thr Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe Gln Tyr Val Glu Thr210 215 220His Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Thr Pro Asp Ser Pro Thr Ile225 230 235 240Lys Pro Ser Pro Ala Ala Ser Lys Glu Tyr Phe Gln Lys Val Asn Gln245 250 255<210>5<211>257<212>PRT<213>大鼠<400>5Met Ala Ala Ala Ala Gly Arg Leu Leu Trp Ser Ser Val Ala Arg Pro5 10 15Ala Ser Thr Ile Phe Arg Ser Ile Ser Ala Ser Thr Val Leu Arg Pro20 25 30Val Ala Ser Arg Arg Thr Cys Leu Thr Asp Met Leu Trp Ser Ala Cys
35 40 45Pro Gln Ala Lys Phe Ala Phe Ser Thr Ser Ser Ser Phe His Thr Pro50 55 60Ala Val Thr Gln His Ala Pro His Phe Lys Gly Thr Ala Val Val Asn65 70 75 80Gly Glu Phe Lys Glu Leu Ser Leu Asp Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu85 90 95Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu100 105 110Ile Val Ala Phe Ser Asp Lys Ala Asn Glu Phe His Asp Val Asn Cys115 120 125Glu Val Val Ala Val Ser Val Asp Ser His Phe Ser His Leu Ala Trp130 135 140Ile Asn Thr Pro Arg Lys Asn Gly Gly Leu Gly His Met Asn Ile Thr145 150 155 160Leu Leu Ser Asp Leu Thr Lys Gln Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu165 170 175Leu Glu Ser Ala Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro180 185 190Asn Gly Val Ile Lys His Leu Ser Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg195 200 205Ser Val Glu Glu Pro Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe Gln Phe Val Glu210 215 220Thr His Gly Glu Val Cys Pro Pro Asn Trp Thr Pro Glu Ser Pro Thr225 230 235 240Ile Lys Pro Ser Pro Thr Ala Ser Lys Glu Tyr Phe Glu Lys Val His245 250 255Gln<210>6<211>257<212>PRT<213>小鼠<400>6Met Ala Ala Ala Ala Gly Arg Leu Leu Trp Ser Ser Val Ala Arg His5 10 15Ala Ser Ala Ile Ser Arg Ser Ile Ser Ala Ser Thr Val Leu Arg Pro
20 25 30Val Ala Ser Arg Arg Thr Cys Leu Thr Asp Ile Leu Trp Ser Ala Ser35 40 45Ala Gln Gly Lys Ser Ala Phe Ser Thr Ser Ser Ser Phe His Thr Pro50 55 60Ala Val Thr Gln His Ala Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Ala Val Val Asn65 70 75 80Gly Glu Phe Lys Glu Leu Ser Leu Asp Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu85 90 95Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu100 105 110Ile Val Ala Phe Ser Asp Lys Ala Asn Glu Phe His Asp Val Asn Cys115 120 125Glu Val Val Ala Val Ser Val Asp Ser His Phe Ser His Leu Ala Trp130 135 140Ile Asn Thr Pro Arg Lys Asn Gly Gly Leu Gly His Met Asn Ile Thr145 150 155 160Leu Leu Ser Asp Ile Thr Lys Gln Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu165 170 175Leu Glu Ser Ala Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro180 185 190Asn Gly Val Val Lys His Leu Ser Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg195 200 205Ser Val Glu Glu Thr Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe Gln Phe Val Glu210 215 220Thr His Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Thr Pro Glu Ser Pro Thr225 230 235 240Ile Lys Pro Ser Pro Thr Ala Ser Lys Glu Tyr Phe Glu Lys Val His245 250 255Gln<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7tgcagtttca gtggattccc a
<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>8ttcatgtggc ccaaacca<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>9tcttgcctgg atcaacacac caagaaag<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10ccctctgctt gctgatgtga ct<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11cctgtaagcg atgccctcat<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>12agcttgtccc agaattacgg cgtgttgaa<210>13
<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>13gcggatgaag agaggcatg<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>14gccacaccgt cctttcca<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>15tggagacctg ggcaatgtgg ctg<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16acgggtgctc agcctcc<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>17aggcttgtgc cctgcttc<210>18<211>25<212>DNA
<213>人工序列<400>18cagcctgcac tgaggagatc cctca<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>19aaccgcggtc gtggctcttg cgttctct<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>20gcgctagctt attgatggac cttctcaaag<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21ttacagattg ccgcctgctc<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22ccagcagtgg aataaggcct<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>23
aatcacgacc cactgcaagg aacca<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>24tgcaccacca actgcttag<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>25ggatgcaggg atgatgttc<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>26cagaagactg tggatggccc ctc<210>27<211>877<212>mRNA<213>大鼠<400>27gaattcggca cgagggtcgt ccgcgtgtcc ggctcttgcc cacgcagtca tggcctccgg 60caacgcgcac atcggaaagc ctgcccctga cttcacgggc accgccgtgg tggatggtgc 120ctttaaggaa atcaagcttt cagactacag agggaagtac gtggtcctct ttttctatcc 180actggacttc acttttgttt gccccacgga gatcatcgct tttagcgacc acgctgagga 240cttccgaaag ctaggctgcg aggtgctggg agtgtctgtg gactctcagt tcacccacct 300ggcctggatc aataccccac ggaaggaggg aggcttgggc ccactgaata tccctctgct 360tgctgatgtg actaaaagct tgtcccagaa ttacggcgtg ttgaaaaatg atgagggcat 420cgcttacagg ggcctcttta tcatcgatgc caagggtgtc cttcgccaga tcacagtcaa 480cgacctacct gtgggacgct ctgtagatga ggctctccgc ctcgtccagg cctttcagta 540
tacagatgag catggggaag tctgtcctgc tggctggaag cccggcagtg acaccatcaa 600acccaatgtg gatgacagca aggaatactt ctccaaacac aactgagatg ggtaaacatc 660ggtgagcctg aatcccggat ctcacctgcg cccttacctg gatgtcctgt gctggcccag 720aaaacgctag atcttcctct acattctaaa ggggctggag gctaggccga ggctttctca 780ttacccacct ggaatctggt gaatagtgac cctgccctga gcacacccag ctgggcccag 840gtctatagga aaccaataaa gtattaggga cagtgta 877<210>28<211>198<212>PRT<213>大鼠<400>28Met Ala Ser Gly Asn Ala His Ile Gly Lys Pro Ala Pro Asp Phe Thr5 10 15Gly Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Ile Lys Leu Ser Asp20 25 30Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr35 40 45Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp His Ala Glu Asp50 55 60Phe Arg Lys Leu Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln65 70 75 80Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu85 90 95Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Lys Ser Leu Ser100 105 110Gln Asn Tyr Gly Val Leu Lys Asn Asp Glu Gly Ile Ala Tyr Arg Gly115 120 125Leu Phe Ile Ile Asp Ala Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn130 135 140Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln145 150 155 160Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp165 170 175Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu180 185 190Tyr Phe Ser Lys His Asn
195<210>29<211>560<212>mRNA<213>人<400>29atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat 60ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact 120gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacggcagg ctgtaccagt 180gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt 300gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc 360catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac 420gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aataaacatt cccttggatg 480tagtctgagg ccccttaact catctgttat cctgctagct gtagaaatgt atcctgataa 540acattaaaca ctgtaatctt 560<210>30<211>154<212>PRT<213>人<400>30Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln5 10 15Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val20 25 30Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val35 40 45His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His50 55 60Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg65 70 75 80His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala85 90 95Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly115 120 125Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg130 135 140Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln145 1501/1權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療方法，伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防或治療方法中，由以下組成，(1)導(dǎo)入編碼AOP-1的核酸、或?qū)刖幋aAOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換了一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)給予增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1記載的預(yù)防或治療方法，其中，將編碼AOP-1的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸導(dǎo)入患部組織細(xì)胞內(nèi)。
3.權(quán)利要求1記載的預(yù)防或治療方法，其中，給予增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1記載的預(yù)防或治療方法，其中，給予增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)。
5.權(quán)利要求4記載的預(yù)防或治療方法，其中具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生作用的物質(zhì)是編碼AOP-1的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
6.權(quán)利要求1記載的預(yù)防或治療方法，其中，給予增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)記載的預(yù)防或治療方法，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
8.伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有(1)編碼AOP-1的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有編碼AOP-1的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
10.權(quán)利要求8記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)。
11.權(quán)利要求8記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)。
12.權(quán)利要求11記載的預(yù)防藥或治療藥，其中具有增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生作用的物質(zhì)是編碼AOP-1的核酸、或編碼AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置換一個(gè)以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。
13.權(quán)利要求8記載的預(yù)防藥或治療藥，其中作為有效成分含有增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)。
14.權(quán)利要求8至13任一項(xiàng)記載的預(yù)防藥或治療藥，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
15.伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的診斷方法，其由對(duì)AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量進(jìn)行測(cè)定，以該表達(dá)量或產(chǎn)生量作為指標(biāo)進(jìn)行診斷構(gòu)成。
16.權(quán)利要求15記載的診斷方法，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
17.伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的診斷劑或診斷試劑盒，其中包括以AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量作為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定的手段。
18.權(quán)利要求17記載的診斷劑或診斷試劑盒，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
19.可以作為通過(guò)抑制AOP-1產(chǎn)生、抑制AOP-1基因的表達(dá)或缺失AOP-1基因而伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的疾病模型使用的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物。
20.權(quán)利要求19記載的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
21.可以作為通過(guò)抑制AOP-1產(chǎn)生、抑制AOP-1基因的表達(dá)或缺失AOP-1基因而伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病的組織模型或細(xì)胞模型使用的轉(zhuǎn)化組織或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
22.權(quán)利要求20記載的轉(zhuǎn)化組織或轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中伴隨有AOP-1基因或AOP-1的表達(dá)減少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心臟病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)變性疾病、肝病或腎衰竭。
23.一種篩選方法，其中，包括向權(quán)利要求18至21記載的非人轉(zhuǎn)化動(dòng)物、轉(zhuǎn)化組織或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中注入或添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物，對(duì)AOP-1基因的表達(dá)量或AOP-1的產(chǎn)生量進(jìn)行檢測(cè)的從增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)以及增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)組成的物質(zhì)中至少選出一種物質(zhì)。
24.一種篩選方法，其中包括使通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物(1)與含有AOP-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)以及AOP-1基因或報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或試管內(nèi)表達(dá)系接觸，對(duì)AOP-1基因或報(bào)告基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，或(2)與AOP-1或AOP-1的靶分子接觸，對(duì)AOP-1或AOP-1的靶分子的量進(jìn)行檢測(cè)的從增強(qiáng)AOP-1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP-1產(chǎn)生的物質(zhì)以及增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)組成的物質(zhì)中至少選出一種物質(zhì)。
25.權(quán)利要求24記載的篩選方法，其中包括構(gòu)建將AOP-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)連接在報(bào)告基因的翻譯區(qū)的上游或下游的表達(dá)載體，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)，向該培養(yǎng)細(xì)胞中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物，一定時(shí)間后檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)量或報(bào)告蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量的變化。
26.權(quán)利要求24記載的篩選方法，其中包括使通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物與AOP-1或AOP-1的靶分子接觸，檢測(cè)與該物質(zhì)結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。
27.權(quán)利要求24記載的篩選方法，其中包括將AOP-1或AOP-1的靶分子固定在載體上，然后向該固定的AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物以及AOP-1或AOP-1的靶分子，檢測(cè)結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。
28.權(quán)利要求24 載的篩選方法，其中包括將通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物固定在載體上，然后向該固定的物質(zhì)中添加AOP-1或AOP-1的靶分子，檢測(cè)結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。
29.增強(qiáng)AOP-1功能的物質(zhì)的篩選方法，其中包括使通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物與AOP-1或AOP-1的靶分子接觸，測(cè)定AOP-1的抗氧化或過(guò)氧亞硝酸消去功能。
30.權(quán)利要求29記載的篩選方法，其中包括向AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物和AOP-1或AOP-1的靶分子，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
31.權(quán)利要求29記載的篩選方法，其中包括將AOP-1或AOP-1的靶分子固定在載體上，然后向該固定的AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物以及AOP-1或AOP-1的靶分子，，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
32.權(quán)利要求29記載的篩選方法，其中包括將通過(guò)合成或基因重組技術(shù)得到的物質(zhì)、來(lái)自天然的物質(zhì)或他們的衍生物固定在載體上，然后向該固定的物質(zhì)中添加AOP-1或AOP-1的靶分子，測(cè)定AOP-1的抗氧化或消去過(guò)氧亞硝酸能力。
全文摘要
在伴隨有AOP－1基因或AOP－1的表達(dá)減少的疾病的預(yù)防或治療方法中由至少(1)導(dǎo)入編碼AOP－1的核酸、或?qū)刖幋aAOP－1的氨基酸序列中的氨基酸附加、缺失、置換一個(gè)以上的具有AOP－1功能的多肽的核酸，或(2)給予增強(qiáng)AOP－1基因表達(dá)的物質(zhì)、增強(qiáng)AOP－1產(chǎn)生的物質(zhì)或增強(qiáng)AOP－1功能的物質(zhì)構(gòu)成的該預(yù)防或治療方法。
文檔編號(hào)A61P19/02GK1496271SQ0280658
公開(kāi)日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2002年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月16日
發(fā)明者服部文幸, 二郎, 杉村惠二郎, 優(yōu)美, 古谷真優(yōu)美 申請(qǐng)人:第一三得利制藥株式會(huì)社, 株式會(huì)社第一三得利生物醫(yī)學(xué)研究所