專利名稱：用于治療血管病的hmgb1蛋白抑制劑和/或拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是使用HMGB1蛋白抑制劑和HMGB1拮抗劑治療血管病，包括由于血管成形術(shù)引起的血管病。
HMGB1蛋白(在2001年前稱作HMG；Bustin，2001，TrendsBiochem.Sci.，26，152-153)是HMG盒家族的原形蛋白，其特征在于存在稱作HMG盒的DNA結(jié)合區(qū)。HMG1是一種小的25KD蛋白，有215個氨基酸，在哺乳動物中有一個高度保守的序列。HMGB1分子被組織劃分成三個區(qū)兩個DNA結(jié)合區(qū)，HMG盒A和盒B，它們后面是由30個谷氨酸和天冬氨酸的殘基組成的COOH酸性末端。盒A和盒B是具有80個氨基酸的片段(29％相同的，65％相似的)，有一個L形狀的三維結(jié)構(gòu)(Hardman等人，1995，biochemistry，3416596-16607；Read等人，1993，Nucleic Acids Res.，213427-3436；Weir等人，1993，EMBO J.，121311-1319)。
HMGB1原來被認(rèn)為是一種遍在表達(dá)的大量的核蛋白。它在每一個核里面超過了1百萬個拷貝，且非序列特異性結(jié)合雙鏈DNA。然而，HMGB1與特定的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合有很強(qiáng)的親和力，例如扭折或彎曲DNA和四向連接體(four-way junctions)。然HMGB1通過與幾個不同的DNA結(jié)合蛋白的相互作用能被招募到雙鏈DNA上。當(dāng)結(jié)合到雙鏈DNA上時，它誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)變形，允許核蛋白復(fù)合物的形成，在這種情況下，幾個DNA結(jié)合蛋白彼此間相互接觸，而同時又結(jié)合到各自的DNA相關(guān)位點(diǎn)上(Müller等人，2001，EMBO J.，164337-4340和其它此處引用的參考文獻(xiàn))。Hmgbl-/-小鼠的表型與此模型一致(Calogero等人，1999，Nat.Genet.，22276-280)。
最近HMGB1在細(xì)胞核外的另一個作用引起了注意HMGB1在內(nèi)毒素引發(fā)的致死現(xiàn)象以及小鼠中急性肺炎中作為晚期介質(zhì)物；同時在敗血病人血清中HMGB1水平升高是一個預(yù)測標(biāo)志(國際專利中請?zhí)朩O00/47104)。HMGB1能夠由培養(yǎng)的巨嗜細(xì)胞和垂體細(xì)胞應(yīng)激于細(xì)胞因子和細(xì)菌內(nèi)毒素而分泌(Abraham等人，2000，J.Immunol.，1652950-2954；Wang等人，1999，Surgery(St.Luis)，126389-392；Wang等人，1999，Science，285248-251)。HMGB1從鼠紅白血病細(xì)胞中的釋放與細(xì)胞的分化是相關(guān)的，在這些細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)以細(xì)胞膜結(jié)合的形式存在(Passalacqua等人，1997，F(xiàn)EBSlett.，400275-279；Sparatore等人，1996，Biochem.J.，320253-256).一種稱作amphoterin的蛋白，與HMGB1序列相同，已經(jīng)在大腦中被發(fā)現(xiàn)，那里它被發(fā)現(xiàn)存在于神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中以及在細(xì)胞外的空間中。如果外源地加入，HMGB1調(diào)節(jié)神經(jīng)突的突起，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的層粘連蛋白依賴性遷移就會被HMGB1的抗體抑制(Fages等人，2000，J.Cell Sci.，113611-620；Merenmies等人，1991，J.Biol.Chem.，26616722-16729；Parkkinen等人，1993，J.Biol.Chem.，2681972619738；Rauvala等人，1988，J.Cell Biol.，1072293-2305)。HMGB1和纖溶酶原激活系統(tǒng)，特別是和t-PA(組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子)的相互作用增強(qiáng)了纖溶酶的形成(Parkkinen和Rauvala，1991，J.Biol.Chem.，26616730-16735)。細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白的降解在細(xì)胞遷移過程中是很重要的一個步驟，由HMGB1促進(jìn)的細(xì)胞外蛋白酶活性增加能夠使細(xì)胞遷移。
HMGB1被鑒定為一種結(jié)合RAGE受體(高級糖化終產(chǎn)物的受體)的配體(Hori等人，1995，J.Biol.Chem.，27025752-25761)。RAGE是免疫球蛋白超家族的多配體受體，可以在很多細(xì)胞類型中被表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞和神經(jīng)元(Brett等人，1993，Am.J.Phathol.，1431699-1712；Neeper等人，1992，J.Biol.Chem.，26714998-15004)。它參與幾種不同的病理過程，例如糖尿病，淀粉樣變性，和動脈粥樣硬化(Schmidt等人，1999，Circ.Res.，84489-197)。HMGB1和RAGE的相互作用誘導(dǎo)神經(jīng)突突起，這兩種蛋白在胚胎發(fā)育中共同定位在不斷延伸的神經(jīng)突的前沿(Huttunen等人，1999，J.Biol.Chem.，27419919-19924)?？梢杂^察到腫瘤塊的生長和遷移阻止HMGB1和RAGE的相互作用；這種相互作用的抑制能夠抑制促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的激活和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，這些分子與腫瘤的增殖和侵入十分相關(guān)。
本發(fā)明的發(fā)明人證明HMGB1對平滑肌細(xì)胞(SMC)具有有力的生物學(xué)作用，平滑肌細(xì)胞是其中RAGE表達(dá)在表面上的細(xì)胞類型中的一種。血管SMC細(xì)胞是大血管中最多的細(xì)胞；它們位于血管中膜，血管中膜內(nèi)嵌在細(xì)胞外基質(zhì)中。在完整血管中，SMC細(xì)胞處于一種收縮狀態(tài)，顯示了一種表型，即不具有負(fù)責(zé)血管壁的剛性和彈性的維持和血壓控制的細(xì)胞分裂和遷移。
機(jī)械或炎癥損傷后，當(dāng)內(nèi)皮被破壞，SMC細(xì)胞轉(zhuǎn)變成一種合成表型，經(jīng)歷細(xì)胞分裂和細(xì)胞遷移。SMC細(xì)胞從血管中膜遷移到血管內(nèi)膜，導(dǎo)致了內(nèi)膜增厚，在很多血管疾病的病理生理學(xué)中起到了一個重要的作用，例如冠狀血管成形術(shù)后的動脈粥樣硬化和再狹窄。在合成狀態(tài)，SMC也產(chǎn)生了大量的細(xì)胞外蛋白酶、生長因子和細(xì)胞因子，分泌一種纖維狀的細(xì)胞外基質(zhì)。血管壁受傷以后，幾種生長因子和/或化學(xué)引誘物通過循環(huán)單核細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞和血小板或者通過損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的釋放能夠誘導(dǎo)SMC細(xì)胞從收縮轉(zhuǎn)變到合成表型，它能夠指引SMC細(xì)胞朝著血管內(nèi)膜遷移。在這些因子中，bFGF是最重要的因子之一，但是，SMC細(xì)胞也能夠應(yīng)激于生血管刺激物而開始遷移。(Schwartz，1997，J.Clin.Invest.，992814-2816；Van Leeuwen，1996，F(xiàn)ibrinolysis，1059-74)。
試圖去定義HMGB1誘導(dǎo)RSMC細(xì)胞遷移的作用和機(jī)制，發(fā)明者證明HMGB1是一種強(qiáng)的化學(xué)引誘物，它能夠誘導(dǎo)它們的細(xì)胞形狀改變和細(xì)胞骨架再組織。這些情況通過加入一種抗RAGE的抗體和通過百日咳毒素被抑制，暗示RAGE和Gi/o蛋白都可能參與該通路。此外，HMGB1促進(jìn)磷酸化ERK1和2蛋白遷移到細(xì)胞核中的證據(jù)表明涉及MAP激酶通路。接著，證明了HMGB1由很多損傷或壞死細(xì)胞類型釋放出來，包括內(nèi)皮細(xì)胞。
因此，HMGB1具有一個在血管損傷后能夠促進(jìn)動脈粥樣硬化和再狹窄的分子的所有特點(diǎn)。
發(fā)明者也證明了HMGB1片段(相應(yīng)于HMG盒)比完整的全長分子具備更高的效能，甚至HMG盒家族的其它蛋白質(zhì)的HMG盒功能域也能夠誘導(dǎo)出相同的作用。
結(jié)果，能阻斷HMGB1和它的RAGE受體之間的相互作用的每一種分子(即屬于抑制劑類別的全部分子抗體或抗體片段，四向(four-way)DNA；屬于HMG盒拮抗物類別的全部分子包含HMG盒功能域的HMGB1片段分子)能有效地用于藥理制劑生產(chǎn)以避免、延緩或者抑制血管上皮損傷引起的甚至由于血管成形術(shù)引起的動脈粥樣硬化和再狹窄。
HMGB1結(jié)合分子或HMGB1抑制劑可以由用于血管成形術(shù)手術(shù)的器械注射或釋放，或者所述的分子能夠被結(jié)合到器械的表面上。
本發(fā)明的目的是提供能阻斷HMGB1和RAGE的相互作用的分子在用于治療血管疾病的治療劑的制備中的用途。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的分子在所述的手術(shù)中或手術(shù)后從導(dǎo)管、外科器械或血管成形術(shù)的支架中釋放出來。
結(jié)合附圖和下面詳細(xì)的描述，本發(fā)明進(jìn)一步的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將會更加地清楚。
在附圖中

圖1顯示了使用改進(jìn)的Boyden室完成的趨化性分析中HMGB1對RSMC的趨化活性。100％值對應(yīng)的是在沒有任何刺激物的條件下遷移的細(xì)胞數(shù)(隨機(jī)細(xì)胞遷移)。數(shù)值代表平均值±SD(n＝3)。圖1-A顯示了RSMC對從小牛胸腺中提純的HMGB1的濃度依賴的遷移反應(yīng)。圖1-B顯示了純化自小牛胸腺或表達(dá)于酵母中的HMGB1蛋白與化學(xué)引誘物fMLP和bFGF的趨化作用比較。圖1-C顯示了抗HMGB1的抗體對fMLP-和HMGB1-誘導(dǎo)的遷移的作用。星號(*)表示這樣的處理，即其中，student’s t-檢驗(yàn)中，遷移反應(yīng)與對照的統(tǒng)計學(xué)差異大于p＝0.0001。圖1-D顯示了RSMC對在酵母(巴斯德畢赤氏酵母(pichiapastoris))表達(dá)的HMGB1的濃度依賴性遷移反應(yīng)。
圖2顯示了HMGB1對RSMC形態(tài)學(xué)和細(xì)胞骨架組織的作用。圖2-A顯示了從小牛胸腺提純或在酵母中或大腸桿菌中表達(dá)的HMGB1對RSMC的亞匯合(subconfluent)培養(yǎng)的作用。使用TRIC-毒傘素可以看到肌動蛋白絲。圖2-B顯示了抗HMGB1兔抗體如何抑制HMGB1刺激的細(xì)胞骨架再組織。靜息細(xì)胞(狀態(tài)1)顯示了許多應(yīng)力纖維。非靜息細(xì)胞(狀態(tài)2)顯示了肌動蛋白細(xì)胞骨架的再組織。
圖3顯示了RSMC對HMGB1的HMG盒功能域的趨化性反應(yīng)。圖3-A顯示了對盒B和(e)盒A的濃度依賴反應(yīng)，盒A和盒B都在大腸桿菌中得到表達(dá)。隨機(jī)的細(xì)胞遷移設(shè)為100％遷移。數(shù)據(jù)代表平均值±SD(n＝3)。對于盒A和盒B兩者，ANOVA模型中結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)顯著性P＜0.0001。圖3-B顯示了在大腸桿菌中表達(dá)的全長HMGB1、盒A+B、盒A或盒B對肌動蛋白細(xì)胞骨架組織的作用。使用TRIC-毒傘素可見肌動蛋白絲。
圖4顯示了HMGB1和它的HMG盒對RSMC遷移到傷口的影響。數(shù)值100％對應(yīng)于當(dāng)不存在任何刺激物時細(xì)胞遷移的數(shù)量(基礎(chǔ)遷移)。數(shù)據(jù)表示平均值±SD(N＝5)。bFGF和細(xì)菌制備的全長HMGB1處理的統(tǒng)計學(xué)顯著性為0.05＜p＜0.01，盒A和盒B處理的0.01＜p＜0.001，小牛胸腺HMGB1處理的0.001＜p＜0.0001。
圖5顯示了HMGB1如何結(jié)合到RSMC的表面并通過RAGE刺激細(xì)胞的運(yùn)動性。圖5-A顯示了大量的HMGB1結(jié)合到RMSC的表面。在圖5-B中顯示了表達(dá)RAGE的RSMC。圖5-C顯示了抗RAGE的抗體如何抑制HMGB1誘導(dǎo)的RSMC遷移。HMGB1和加上非特異性抗體的HMGB1的處理的統(tǒng)計學(xué)顯著性0.001＜p＜0.0001。
圖6顯示了百日咳毒素如何抑制HMGB1誘導(dǎo)的RSMC遷移以及肌動蛋白細(xì)胞骨架再組織。在圖6-A中顯示了使用改進(jìn)的Boyden室完成的趨化性分析。數(shù)值100％對應(yīng)不存在任何刺激物時基礎(chǔ)細(xì)胞的遷移；數(shù)據(jù)表示平均值±SD。圖6-B顯示了明顯的細(xì)胞骨架再組織，使用結(jié)合的TRITC-毒傘素可以看到肌動蛋白絲。
圖7證明了MAP激酶通路參與HMGB1信號傳導(dǎo)。細(xì)胞用磷酸化ERK1/2的特異性抗體和DAPI染色，單獨(dú)細(xì)胞樣品用TRITC-毒傘素染色以看到細(xì)胞骨架的再組織。
圖8顯示了HMGB1由壞死和損傷的細(xì)胞釋放。圖8-A顯示了由壞死或通透的Hela細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；在道1和道3，HMGB1的存在是明顯的。圖8-B顯示了壞死和活的Hela細(xì)胞的免疫熒光法分析結(jié)果。
圖9顯示了HMGB1存在于內(nèi)皮細(xì)胞的核中，但是沒有在血管SMC的核中。在圖9-A和9-B中顯示了HMGB1存在于內(nèi)皮細(xì)胞的核中，但是在用抗HMGB1的抗體染色和用ematoxylin復(fù)染色的人體胰腺動脈切片的血管平滑肌細(xì)胞核中沒有發(fā)現(xiàn)，以低(A)和高(B)的放大率表示。紅框表示顯示在圖B中的地區(qū)的位置，箭頭指向SMC的核。在圖9-C中蛋白質(zhì)印跡分析顯示了HMGB1在RSMC中的表達(dá)水平(與Hela細(xì)胞對照)。
圖10顯示了當(dāng)抗RAGE抗體(1000ng/ml)存在或不存在的情況下，在使用改進(jìn)的Boyden室完成的趨化性分析中HMGB1對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的趨化性影響。數(shù)值100％對應(yīng)于沒有任何刺激物時細(xì)胞遷移的數(shù)量(隨機(jī)細(xì)胞遷移)。數(shù)據(jù)表示平均值±SD(n＝3)。
HMGB1及其衍生物的表達(dá)和純化第一步，必須表達(dá)和純化HMGB1及其衍生物。
全長HMGB1的表達(dá)在被pT7-7-rHMGB1cm質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中完成(Prof.J.O.Thomas所贈，Cambridge University)，純化遵循一個眾所周知的流程完成(Müller等人，2001，Biochemistry，4010254-10261)。
全長HMGB1在巴斯德畢赤氏酵母中的表達(dá)和純化遵循一個眾所周知的流程完成(Mistry等人，1997，Biotechniques，22718-729)。
眾所周知的質(zhì)粒pRNHMG1/M1-V176、pT7HMG1bA和pT7HMG1bB被分別用于BoxA+BoxB、BoxA和BoxB的表達(dá)和純化，遵循眾所周知的單盒和雙盒純化過程(Bianchi等人，1992，EMBO J.，111055-1063)。
為了證明HMGB1的趨化性作用，完成了三個獨(dú)立的細(xì)胞遷移測定趨化性測定、化動性測定和體外創(chuàng)傷測定。研究了非靜息細(xì)胞的HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移與形態(tài)改變(即肌動蛋白纖維再組織、細(xì)胞延長和細(xì)胞形狀極化)之間的功能性關(guān)系。
趨化性分析使用眾所周知的流程完成趨化性分析(Degryse等人，1999，Blood，94649-662)。采用改進(jìn)的Boyden室，其帶有0.5um孔徑的過濾器(Coring，Acton，MA)，并用纖連蛋白(10ug/ml)(Roche)和膠原蛋白I(100ug/ml，在0.5M乙酸中)處理。RSMC細(xì)胞(Dr.MarcoBertulli所贈，Bayer Research Laboratories，Milan)在沒有血清的DMEM中培養(yǎng)，20.000-40.000細(xì)胞樣品加入到Boyden室的上孔中。被測的分子在同樣的不含血清的介質(zhì)中稀釋，加入到下孔。
使用不同的HMGB1制劑從小牛胸腺純化的HMGB1(J.Bernués所贈，C.S.I.C.，Barcelona，Spain)、大腸桿菌表達(dá)的重組HMGB1和在巴斯德畢赤氏酵母上產(chǎn)生的輕微修飾的HMGB1形式(含有結(jié)合到N-末端的EAEAYVEF氨基酸)(Mistry等人，1997，Biotechniques，22718-729)。
如果需要，多克隆的兔抗HMGB1(Pharmingen BD，TorreyPines，CA)、來自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳毒素(PT)(Dr.M.G.Pizza所贈，I.R.I.S.，Siena)或抑制劑加入到兩孔中。
整晚細(xì)胞遷移保持在37℃，接著刮掉留在濾器上表面的細(xì)胞，濾器在甲醇中固定，用含有10％龍膽紫的20％甲醇溶液進(jìn)行染色。所有的實(shí)驗(yàn)至少做兩次，每次三份。
顯示在圖1-A、1-B、1-C、1-D的結(jié)果是在每濾器10高密度區(qū)(high power fields)的細(xì)胞數(shù)目的平均值±SD，以對照的倍數(shù)表示。隨機(jī)細(xì)胞遷移(即沒有化學(xué)引誘物存在時的遷移)給予人為值100％。
用student’s-t檢驗(yàn)對處理進(jìn)行成對比較以進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，或者用ANOVA模型評價試劑量不斷增加的處理。
來自小牛胸腺的HMGB1以一種濃度依賴的方式刺激RSMC的遷移，在0.1ng/ml低劑量時開始，在100ng/ml有2.5倍最大的響應(yīng)(圖1-A)。HMGB1的影響與已鑒定的引誘劑fMLP和bFGF的影響在幅度上是可比的(圖1-B)。多克隆HMGB1抗體而不是非特異對照抗體能完全阻斷遷移響應(yīng)(圖1C)，表明了這特異地歸因于HMGB1。這些抗體不能改變作為正對照的化學(xué)引誘物fMLP肽的影響。采用在巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生的重組HMGB1得到了相似的結(jié)果(圖1-D)。
免疫熒光分析15.000-20.000 RSMC(20-40％匯合)樣品在2cm2孔中的玻璃蓋玻片上接種，在加入10％FCS的DMEM中培養(yǎng)24小時，用PBS沖洗，在沒有FCS的DMEM中再培養(yǎng)24小時。用100ng/ml HMGB1在37℃以5到120分鐘的不斷增加的時間間隔刺激RSMC。刺激完后，RSMC用3％低聚甲醛和2％蔗糖的PBS溶液(PH為7.5)在室溫固定20分鐘，接著用0.2％PBS-BSA清洗三次。用PH7.4的20mM Hepes、300mM蔗糖、50mM氯化鈉、3mM氯化鎂、0.5％(V/V)Triton X-100在4℃通透細(xì)胞三分鐘，用0.2％PBS-BSA清洗三次。接著RSMC用2％PBS-BSA在37℃孵育15分鐘，用初級抗體在37℃孵育30分鐘，0.2％PBS-BSA清洗三次，再用2％PBS-BSA孵育15分鐘。最后，細(xì)胞用二級抗體和/或結(jié)合羅丹明(rodamin)的毒傘素染色以便看到絲狀肌動蛋白；在一些情況下，使用DAPI(4’，6-diamidino-2-phenilindolo，Roche)標(biāo)記核。
所有隨后的孵育完成后，蓋玻片用0.2％PBS-BSA清洗三次，蒸餾水清洗兩次，20％Mowiol的PBS封固，在Axiophot顯微鏡下分析(Carl Zeiss)。在用Zeiss40或100neofluar透鏡的T-Max400或EPH P1600X膠卷(Eastman kodak)拍攝熒光照片。
圖2-A低放大率照片顯示了應(yīng)力纖維含量、細(xì)胞形狀和大小、細(xì)胞骨架組織在30分鐘內(nèi)改變，但是120分鐘后回復(fù)。高放大率照片(圖2-B)顯示了刺激前許多清晰可見的應(yīng)力纖維，并且細(xì)胞形狀是非極性化的。在15-30分鐘內(nèi)，形態(tài)和細(xì)胞骨架組織完全改變RSMC顯示了一種延伸的、極化的形態(tài)，這反映出肌動蛋白細(xì)胞骨架的空間重組。HMGB1的影響慢慢減弱1-2小時后，應(yīng)力纖維含量增加回到初始的水平，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)到與未刺激對照細(xì)胞相似的程度。
在一些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用抗體或PT或抑制劑預(yù)處理一晚。正如在圖2-B中所示的，HMGB1抗體完全抑制細(xì)胞骨架再組織和由HMGB1誘導(dǎo)的RSMC形態(tài)改變。對照抗體不能抑制HMGB1的影響。
最后，為了確定觀察到的HMGB1對RSMC的影響是否實(shí)際反映從靜止?fàn)顟B(tài)到運(yùn)動狀態(tài)的動態(tài)的過渡，對不同狀態(tài)的細(xì)胞的比例進(jìn)行定量。拍攝了低放大率照片，細(xì)胞分成了兩種狀態(tài)-狀態(tài)1，細(xì)胞顯示了典型的沒有被刺激的細(xì)胞的外觀，其特征在于有很大數(shù)量的應(yīng)力纖維和非極化的細(xì)胞形狀；-狀態(tài)2，RSMC顯示了應(yīng)力纖維低含量、膜變皺、肌動蛋白半環(huán)或者一種延長的形狀。
圖2-C可清楚地看到，非刺激培養(yǎng)中60％細(xì)胞處于狀態(tài)1，40％處于狀態(tài)2；刺激后5分鐘內(nèi)，狀態(tài)2的細(xì)胞的比例增加到60％，15-30分鐘后增加到80％。HMGB1刺激后一個小時，這些比例恢復(fù)到未刺激培養(yǎng)狀態(tài)的數(shù)值，60％RSMC處于狀態(tài)1和40％處于狀態(tài)2。這些數(shù)據(jù)證明了HMGB1的影響是瞬時的，表現(xiàn)了從靜止?fàn)顟B(tài)到遷移狀態(tài)的變化，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了趨化性結(jié)果HMGB1是一種RSMC的化學(xué)引誘物。
體外傷口分析
RSMC的匯合培養(yǎng)，在2-cm2孔中的玻璃蓋玻片中生長，用PBS清洗一次，并用無血清DMEM進(jìn)行FCS饑餓培養(yǎng)24小時。接著刺激傷口，用移液管的尖端在單層的中央?yún)^(qū)域劃一條單線。經(jīng)過處理的單層用PBS清洗一次，在沒有血清的培養(yǎng)基中恢復(fù)48小時，該培養(yǎng)基含有或不合HMGB1(100ng/ml)。接著固定細(xì)胞，用TRITC-傘毒素染色。通過拍攝低放大率的照片和計數(shù)已遷移到無細(xì)胞空間的細(xì)胞來定量分析遷移。數(shù)據(jù)代表平均值±SD，數(shù)值100％對應(yīng)無任何刺激物時遷移的細(xì)胞數(shù)(基礎(chǔ)遷移)。
圖4顯示，HMGB1刺激增加了5-2倍遷移的細(xì)胞數(shù)。盒A和盒B(10ng/ml)也被檢測，兩者刺激1.8倍細(xì)胞遷移。最后，與bFGF的比較表明上面所述的分子是更加有效的。假定傷口愈合和化學(xué)趨化性、化動性可能基于同樣的信號傳導(dǎo)途徑。
信號通路然后，檢測信號通路。
作為一種遷移信號，HMGB1必須到達(dá)響應(yīng)的細(xì)胞并結(jié)合到受體上。為了檢測HMGB1是否結(jié)合到RSMC的表面，1百萬細(xì)胞被胰蛋白酶消化，在含有800ng盒A+B肽和5ug BSA的PBS中于4℃培養(yǎng)20分鐘。BoxA+BoxB多肽比內(nèi)源全長HMGB1稍小，很容易在SDS-PAGE凝膠中鑒別。接著細(xì)胞成團(tuán)，保留上清液；在500ul冷PBS中漂洗兩次，細(xì)胞在SDS-PAGE樣品緩沖液中重懸浮，100℃加熱5分鐘，上樣至12％tricine-SDS凝膠(line P)，相鄰的是20ul上清液(lineS)。接著凝膠印跡到Immobilon濾膜，用印度墨染色。
圖5-A顯示了SDS-PAGE凝膠，從中可以計算從細(xì)胞團(tuán)和上清液回收的盒A+B的數(shù)量，可以估計在單個RSMC上結(jié)合超過500000個盒A+B分子。這一結(jié)果證明胞外HMGB1可以結(jié)合RSMC，但極有可能沒有反映實(shí)際的受體數(shù)目。實(shí)際上HMGB1已經(jīng)顯示能結(jié)合到肝素和蛋白聚糖(Bianchi，1988，EMBO J.，7843-849；Nair和Jungalwala，1997，J.Neurochem.，681286-1297；Salmivirta等人，1992，Exp.CellRes.，200444-451)；因而，HMGB1也可能與RSMC產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)相聯(lián)系，正如發(fā)明者在Hela細(xì)胞中證明的，其中由于這些細(xì)胞產(chǎn)生很少的細(xì)胞外基質(zhì)，所以只有少量的HMGB1結(jié)合細(xì)胞。
據(jù)報道HMGB1結(jié)合到許多細(xì)胞類型表達(dá)的RAGE。為了證明RAGE存在于RSMC膜上，一百萬RSMC在包含SDS-PAGE樣品緩沖液(50mMPH6.8的Tris，2％2-巰基乙醇，4％SDS，12％甘油(glicerol)，0.05％溴酚藍(lán))的板上裂解，100℃變性5分鐘，在12％丙烯酰胺上分離。采用含有25mM PH7.5 Tris、0.192M甘氨酸、20％甲醇的tankblot系統(tǒng)將分離的蛋白質(zhì)印跡到Immobilon(Millipore)膜。在5％脫脂奶/TBST中于室溫阻斷印跡一小時(20mM Tris，PH7.5，137mM氯化鈉，0.1％Tween20)，TBST漂洗三次，在TBST-0.01％BSA中與抗HMGB1抗體孵育。TBST-0.01％BSA漂洗后，用二級抗體進(jìn)行孵育。使用ECL系統(tǒng)(Amersham)檢測蛋白質(zhì)。使用抗RAGE抗體(Dr.A.M.Schmidt所贈，Columbia University，NY)檢測RAGE的存在。圖5-B的結(jié)果證明了RAGE存在于RSMC。而且，HMGB1誘導(dǎo)的化學(xué)趨化性不但能被抗HMGB1抗體抑制，而且能被抗RAGE抗體抑制，正如圖5-C中顯示。抗RAGE抗體阻斷響應(yīng)于HMGB1遷移信號的RSMC細(xì)胞骨架再組織和形態(tài)改變；無關(guān)的抗體不能夠阻斷細(xì)胞骨架再組織。
這些數(shù)據(jù)表明HMGB1誘導(dǎo)的RSMC的反應(yīng)需要RAGE受體。
已知很多化學(xué)引誘物通過與異三聚體GTP結(jié)合蛋白(G蛋白)相關(guān)的膜受體而起作用，測定了G蛋白是否參與HMGB1信號通路。使用了百日咳毒素，因?yàn)樗种艷蛋白的一個特異的亞類(Gi/o蛋白)，揭示了它們參與信號通路(Baggiolini等人，1994，Adv.Immunol.5597-179；Haribabu等人，1999，J.Biol.Chem.，27437087-37092)。使用mPT(PT的失活突變型)作為對照。用PT或mPT(50ng/ml)預(yù)處理RSMC 6小時，用HMGB1(100ng/ml)、BoxA或BoxB(10ng/ml)刺激30分鐘。如前面所述進(jìn)行化學(xué)趨化性分析。數(shù)據(jù)代表平均值±SD，數(shù)值100％代表沒有任何刺激物存在的基礎(chǔ)遷移。圖6-A顯示了PT對HMGB1誘導(dǎo)的化學(xué)趨化性的抑制作用。這些數(shù)據(jù)顯示了Gi/o蛋白參與了HMGB1控制的信號通路。圖6-B顯示了細(xì)胞骨架再組織，如以前所描述的方法看到肌動蛋白絲。然后，研究HMGB1誘導(dǎo)的信號是否涉及MAP激酶通路；實(shí)際上，已知這些蛋白由RAGE活化，它們對細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動機(jī)制的調(diào)節(jié)有直接的作用。RSMC用PD98059(50mM)預(yù)處理一小時或者未預(yù)處理，用來自小牛胸腺的HMGB1(100ng/ml)刺激30分鐘，用特異的磷酸化ERK1/2的抗體(New England Biolabs，Beverly，MA)和DAPI染色。為了看到細(xì)胞骨架再組織，單獨(dú)的細(xì)胞樣品用TRITC-傘毒素染色。圖7顯示了在30分鐘內(nèi)，HMGB1刺激如何誘導(dǎo)RSMC的ERK1/2蛋白的活化和它們的核轉(zhuǎn)運(yùn)；與此形成對照的，磷酸化的ERK蛋白在未刺激的RSMC中幾乎不能檢測到，并且其位于細(xì)胞質(zhì)中。而且PD98059(MEK的選擇性抑制劑，而MEK是ERK的上游調(diào)節(jié)劑)抑制HMGB1誘導(dǎo)的ERK磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)，以及RSMC遷移和細(xì)胞骨架再組織。結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明MAP激酶在HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移中起到了重要的作用。
細(xì)胞損傷誘導(dǎo)考慮到現(xiàn)有技術(shù)的狀況，檢測了損傷細(xì)胞或正在經(jīng)歷壞死的細(xì)胞是否在細(xì)胞外介質(zhì)中釋放HMGB1。
Hela細(xì)胞和HUVEC用5um離子霉素(Sigma)和20um CCCP，或mM脫氧葡萄糖和10mM疊氮鈉處理誘導(dǎo)壞死。在37℃進(jìn)行16個小時后，根據(jù)形態(tài)，記下經(jīng)歷壞死的細(xì)胞數(shù)目，當(dāng)它達(dá)到50％時，采集上清液。
蛋白質(zhì)印跡分析時，采集處理和未處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基，用Amicon Ultrafree-MC濾器濃縮50倍；用SDS-PAGE樣品緩沖液溶解細(xì)胞。
免疫熒光分析中，細(xì)胞用4％PFA固定，用抗HMGB1抗體孵育，二級抗體和DAPI染色，使用0.1％NP-40的PBS進(jìn)行細(xì)胞的透化作用。
圖8-A顯示了上清液(S)和細(xì)胞團(tuán)(P)的蛋白質(zhì)印跡分析。HMGB1從壞死細(xì)胞和損傷細(xì)胞的上清液中回收。圖8-A顯示了在單個活的和壞死的Hela細(xì)胞上進(jìn)行的免疫熒光分析，HMGB1沒有結(jié)合到殘余的壞死細(xì)胞上。
圖9顯示了免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)說明HMGB1包含在沿著人體動脈的內(nèi)皮細(xì)胞的核中，但是沒有在RSMC的核中(圖9-A是低放大率，圖9-B是高放大率)，實(shí)際上，大多數(shù)平滑肌細(xì)胞的核中包含數(shù)量無法測定的HMGB1(圖9-B的框)。圖9-C蛋白質(zhì)印跡法顯示了與Hela細(xì)胞相對照的HMGB1在RSMC中的表達(dá)水平，說明了RSMC的體外培養(yǎng)與Hela細(xì)胞相比含有少量的HMGB1。
總而言之，這些數(shù)據(jù)表明給予血管平滑肌細(xì)胞信號的HMGB1分子可能僅僅源于附近的細(xì)胞的壞死或機(jī)械損傷。
結(jié)論是，上面所述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，即本申請的基礎(chǔ)，證明了HMGB1核蛋白是機(jī)械損傷和/或炎癥發(fā)生后血管重建的一個重要的介質(zhì)，它能由損傷或壞死的細(xì)胞被動釋放。
這些數(shù)據(jù)特別表明了下面的內(nèi)容HMGB1作為一種化學(xué)引誘物同bFGF或fMLP一樣，HMGB1在趨化性分析和創(chuàng)傷分析中是很強(qiáng)的化學(xué)引誘物，促進(jìn)細(xì)胞形狀改變和細(xì)胞骨架組織改變，這與用尿激酶原觀察到的相似；這些使用特異性地歸因于HMGB1而不是由于潛在的污染物。另外，HMGB1的抗體抑制它對細(xì)胞遷移的影響，然而非特異的對照抗體是不能這樣的。
在RSMC中結(jié)合RAGE引發(fā)HMGB1的信號通路上面所報道的實(shí)驗(yàn)顯示了RAGE在RSMC中表達(dá)，抗RAGE抗體抑制了HMGB1對RSMC的影響。
可以確定由于ERK1/2被磷酸化并且在HMGB1的刺激下轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，MAP激酶參與了HMGB1誘導(dǎo)的RSMC細(xì)胞遷移，以及MEK抑制劑PD98059能夠阻斷HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。數(shù)據(jù)也表明由于HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能夠被百日咳博德特氏菌毒素阻斷，Gi/o蛋白參與到由HMGB1活化的過程。G蛋白通常締合到七跨膜elix受體(7TM)，但是到目前為止沒有描述過RAGE與G蛋白之間的直接結(jié)合。到目前為止，不知道HMGB1除了結(jié)合RAGE，是否需要結(jié)合7TM受體/G蛋白受體，或者是否G蛋白參與RAGE下游，或者參與到反饋機(jī)制中。
HMGB1旁分泌功能HMGB1以一種非調(diào)節(jié)的方式釋放，這就意味在細(xì)胞因子或脂多糖的刺激下，此時細(xì)胞被機(jī)械損傷或遭受壞死。因而，HMGB1能把單個細(xì)胞的損傷或破壞以一種旁分泌的方式用信號通知相鄰的細(xì)胞。對細(xì)胞外HMGB1響應(yīng)的細(xì)胞自身含有很少的HMGB1，在細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒有。RSMC與Hela細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞相比含有很少的HMGB1，它們含有的很少的HMGB1大多位于細(xì)胞質(zhì)。遷移的RSMC傾向于把HMGB1集中在細(xì)胞前沿的表面上?？梢约僭O(shè)為了減少對它們自身的HMGB1不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)的幾率，對HMGB1響應(yīng)的細(xì)胞含有很少的HMGB1。HMGB1集中在遷移細(xì)胞的前沿能誘發(fā)相鄰細(xì)胞的HMGB1誘導(dǎo)的反應(yīng)參與細(xì)胞遷移的分子(例如整聯(lián)蛋白，尿激酶受體或c-Src)的重新定位，是運(yùn)動RSMC的特征。遷移也涉及細(xì)胞外蛋白酶的活化，HMGB1和纖溶酶原活化系統(tǒng)的相互作用能推動細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的遷移。
HMGB1在血管病中的作用平滑肌細(xì)胞對HMGB1的反應(yīng)性，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞含有很大數(shù)量的HMGB1而血管SMC含有很少，以及遭受機(jī)械損傷的細(xì)胞釋放HMGB1，所有上述的結(jié)果表明了在動脈粥樣硬化和再狹窄中產(chǎn)生的組織再塑造過程中HMGB1可能發(fā)揮了作用。
上述特定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠鑒別抑制HMGB1和RAGE受體之間的相互作用的分子，這也是本發(fā)明的目的，考慮到它們的結(jié)構(gòu)和功能特征，這些分子被分類如下1、HMGB1拮抗劑HMGB1片段、比完整的全長分子更有效的HMG盒類似物和含有HMG盒功能域的蛋白，后面的兩種都能夠結(jié)合RAGE受體。
2、HMGB1抑制劑作為抗體或抗體片段和回向DNA的分子，它們能結(jié)合到HMG盒功能域，并避免HMGB1結(jié)合到RAGE。
這些分子有利于應(yīng)用到藥物制劑中，以預(yù)防、延緩或使血管上皮損傷后的動脈粥樣硬化和/或再狹窄最小化，包括血管成形術(shù)后產(chǎn)生的那些。
此外，本發(fā)明的發(fā)明人表明HMGB1對鼠胚胎成纖維細(xì)胞有強(qiáng)的生物學(xué)作用。已知成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，它們對連接的細(xì)胞外基質(zhì)的合成和維持起作用。更特別的是，HMGB1在體外作為一種強(qiáng)的成纖維細(xì)胞的化學(xué)引誘物起作用，抗RAGE抗體能阻斷所述的效應(yīng)。
結(jié)果，每種與HMGB1同源的分子都可以作為全長蛋白質(zhì)用于制備藥物學(xué)制劑，該藥物學(xué)試劑能正調(diào)節(jié)，從而推動和/或誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞遷移。同樣，為了避免、延緩或減少結(jié)締組織的再生，能阻斷HMGB1和它的RAGE受體的相互作用的每種分子(即屬于抑制劑組的所有分子抗體或抗體片段，四向DNA；和屬于HMG盒拮抗物組的所有分子HMGB1片段、含有HMG盒功能域的分子)能有效地用于藥物學(xué)制劑的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個目的是HMGB1、相應(yīng)于HMG盒的HMGB1片段、屬于HMG盒家族的其它蛋白質(zhì)的HMG盒結(jié)構(gòu)域和HMG盒家族的其它蛋白質(zhì)在制備治療藥物中的用途，所述治療藥物用于促進(jìn)和/或誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移從而正調(diào)節(jié)結(jié)締組織再生。
本發(fā)明的一部分是將能夠抑制HMGB1和RAGE受體的相互作用的所有分子、拮抗物和/或抑制劑用于制備減少、延緩和避免結(jié)締組織再生的治療劑，正如下面的實(shí)驗(yàn)所指的。
成纖維細(xì)胞的趨化性分析趨化性分析采用眾所周知的方案進(jìn)行(Degryse等人，1999，Blood，94649-662)。使用具有0.5um孔徑濾器的改進(jìn)的Boyden室(Corning，Acton，MA)，用膠原蛋白I(0.5M乙酸中100ug/ml)和纖連蛋白處理(10ug/ml)(Roche)。采用眾所周知的方案培養(yǎng)鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Calogero等人，1999，Nat.Genet.，22276-280)，24小時血清饑餓后，20.000-40.000細(xì)胞樣品加入到Boyden室的上孔中。大腸桿菌表達(dá)的重組HMGB1在同樣的無血清介質(zhì)中稀釋，加入到下孔中。
抗RAGE抗體(1000ng/ml)(Dr.A.M.Schimdt所贈，ColumbiaUniversity，NY)加入到兩孔中。
在37℃細(xì)胞遷移整晚，接著刮掉保存在濾器上表面的細(xì)胞，用甲醇固定濾器，10％龍膽紫的20％甲醇溶液染色。所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少兩次，每次三份。
在圖10中顯示的結(jié)果是在每個濾器10個高密度區(qū)計算的細(xì)胞數(shù)目的平均值±SD，以未處理的對照的倍數(shù)表示。對隨機(jī)的細(xì)胞遷移(即不存在化學(xué)引誘物時的遷移)給予人為值100％。使用ANOVA模型來評價采用不斷增加劑量的試劑的處理，從而進(jìn)行統(tǒng)計分析。
大腸桿菌表達(dá)的重組HMGB1以一種濃度依賴的方式刺激成纖維細(xì)胞的遷移，以0.1ng/ml的劑量開始，在100ng/ml有最大反應(yīng)，在更高的劑量(1000ng/ml)反應(yīng)比對照的低?？筊AGE抗體(1000ng/ml)完全阻斷遷移響應(yīng)(圖10的圖解的右側(cè))顯示了上述現(xiàn)象特異性地歸因于HMGB1。
HMGB1在結(jié)締組織再生的調(diào)節(jié)中的作用成纖維細(xì)胞對HMGB1的反應(yīng)性指明了在由于創(chuàng)傷或外科發(fā)生的損傷后產(chǎn)生的結(jié)締組織重塑造過程中HMGB1可能發(fā)揮作用。而且抗RAGE抗體阻斷所述反應(yīng)的事實(shí)表明在細(xì)胞表面的HMGB1和RAGE受體的相互作用是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞對HMGB1的敏感性的基礎(chǔ)。
結(jié)論-HMGB1和/或相應(yīng)于HMG盒的HMGB1片段、屬于HMG盒家族的其它蛋白的HMG盒域以及HMG盒家族的其它蛋白能有利地用于正調(diào)控(即促進(jìn)和/或誘導(dǎo)結(jié)締組織再生)的藥物制劑中。
-能抑制HMGB1和RAGE相互作用的并且屬于拮抗物組(能結(jié)合到RAGE受體)和屬于抑制劑組(能結(jié)合HMG盒域從而阻斷HMGB1結(jié)合在RAGE受體上)的每種分子可以有利地用于負(fù)調(diào)控(即阻斷、延緩或減少結(jié)締組織再生)的藥物制劑中。
權(quán)利要求
1.HMG盒結(jié)合分子在制備治療血管病的治療試劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HMG盒結(jié)合分子的用途，其中所述的分子屬于包含抗體或抗體片段、抑制劑和四向DNA的組。
3.與HMG盒具有序列同源性并且能結(jié)合受體的功能性HMG盒結(jié)合結(jié)構(gòu)域的拮抗物分子在制備治療血管病的治療試劑中的用途。
4.根據(jù)一個或多個上述權(quán)利要求中所述的分子的用途，其中血管病包含在血管成形術(shù)中產(chǎn)生的動脈粥樣硬化和/或再狹窄。
5.根據(jù)一個或多個上述權(quán)利要求中所述的分子的用途，其中所述分子由用于血管成形術(shù)的導(dǎo)管、外科器械或支架釋放。
6.HMGB1和/或相應(yīng)于HMG盒的HMGB1片段、屬于HMG盒家族的其它蛋白質(zhì)的HMG盒域以及HMG盒家族的其它蛋白質(zhì)在制備能促進(jìn)和/或誘導(dǎo)結(jié)締組織再生的治療試劑中的用途。
7.HMG盒結(jié)合分子在制備能阻斷、延緩或減少結(jié)締組織再生的治療試劑中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的HMG盒結(jié)合分子的用途，其中所述分子屬于包含抗體或抗體片段、抑制劑和四向DNA的組。
9.與HMG盒具有序列同源性并且能結(jié)合受體的功能性HMG盒結(jié)合結(jié)構(gòu)域的拮抗劑分子在制備能阻斷、延緩或減少結(jié)締組織再生的治療試劑中的用途。
全文摘要
描述了HMG盒結(jié)合分子以及與HMG盒具有序列同源性的分子在制備用于治療血管病的治療劑中的用途。
文檔編號A61P9/00GK1537014SQ02806567
公開日2004年10月13日 申請日期2002年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月16日
發(fā)明者馬爾科·E·比安基, 蒂齊亞納·博納爾迪, 保拉·斯卡菲迪, 蘇珊·米勒, 伯納德·德格里希, 德格里希, 斯卡菲迪, 米勒, 納 博納爾迪, 馬爾科 E 比安基 申請人:Bio3研究有限責(zé)任公司, 馬爾科·E·比安基