專利名稱::Ing4和il-24雙基因共表達載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬于重組載體領(lǐng)域,具體涉及人ING4基因和人IL-24基因的共表達載體的制備及其用途。
背景技術(shù):
:腫瘤是當(dāng)今社會影響人類健康的主要疾病之一,腫瘤的發(fā)生發(fā)展受體內(nèi)多種基因的調(diào)控,腫瘤抑制基因正是參與這一調(diào)控的重要分子,很多腫瘤中都有某些腫瘤抑制基因失活,向缺失某種抑癌基因的細胞內(nèi)導(dǎo)入正常的抑癌基因,則可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的表型、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡,以達到治療目的,例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人ING4基因(參見公開號為CN101058809A的中國專利申請)和人IL-24基因。人ING4基因定位于12pl3-31,基因跨距13kb,由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成,cDNA全長1380bp,編碼蛋白含249個氨基酸,是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞內(nèi)腫瘤生長抑制因子,可與NF-kB蛋白的P65亞基結(jié)合抑制NF-kB蛋白的活性,弓胞對NF-kB敏感的IL-8等基因的表達量減少;可通過調(diào)節(jié)p53乙?;癄顟B(tài)增強p53的轉(zhuǎn)錄活性;可抑制缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1的活化等,從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞生長。白介素-24(interleukin-24,IL-24)基因原先被命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因(melanomadifferentiation-associatedgene-7,mda-7),由美國哥倫比亞大學(xué)的Jiang等人于1995年將增生活躍的人類黑色素瘤細胞HO-l產(chǎn)生的cDNA文庫與經(jīng)人成纖維細胞0干擾素(IFN-0)和mezereiii(MEZ)共同處理過的HO-l細胞的cDNA文庫進行減數(shù)雜交時首次發(fā)現(xiàn)(參見JiangH,LinJJ,SuZZ等人,Oncogene,1995,ll(12):2477-2486.)。這一因子從其結(jié)構(gòu)、染色體定位、堿基序列同源性及細胞因子特性等方面綜合考慮,被歸入IL-10家族,并命名為IL-24。IL-24為分泌型細胞因子,是一種膜受體介導(dǎo)的腫瘤生長抑制因子。目前的研究顯示,IL-24基因是第一個,很可能是唯一既抑制腫瘤細胞生長和血管形成并誘導(dǎo)凋亡,同時又能刺激免疫細胞表達細胞因子的新型抑癌基因,因而能通過抑制腫瘤血管生長,刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡三者聯(lián)合的方式來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。近年來腫瘤等疾病多基因治療倍受關(guān)注。于同一載體上同時表達多個外源基因在生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價值,尤其在針對腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)設(shè)計的聯(lián)合基因治療方案中。因而構(gòu)建合適的載體獲得多個外源基因的高效轉(zhuǎn)移與表達具有重要意義。在細胞或整體水平轉(zhuǎn)移外源基因進行遺傳學(xué)改造、修飾是目前基因治療的重要方式。腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展是多基因變異的結(jié)果,同時轉(zhuǎn)移并表達多個外源基因在基因治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。目前多基因治療主要采取兩種途徑—是將多個攜帶不同基因的獨立載體同時轉(zhuǎn)染或感染靶細胞,其優(yōu)點是可以自由調(diào)節(jié)各表達載體的比例和時間上協(xié)調(diào)組合,缺點是其實現(xiàn)多基因共表達的效率太低和工作量大二是在同一載體上實現(xiàn)多基因共表達。低效的基因轉(zhuǎn)移過程是基因治療的瓶頸,與多個攜帶不同基因的獨立載體實現(xiàn)共表達相比,構(gòu)建多基因共表達載體可提髙轉(zhuǎn)移及表達效率。共表達主要應(yīng)用于(l)表達異源多聚體蛋白的亞單位,如免疫球蛋白、細胞受體、白細胞介素和轉(zhuǎn)錄因子等;(2洞時表達針對同一靶細胞的幾種異源蛋白以取得聯(lián)合或協(xié)同的作用,如原癌基因、抗血管生成基因、自殺基因等。尤其是自殺基因及其與免疫活性基因的聯(lián)合應(yīng)用已在協(xié)同抗腫瘤的研究中取得了重要進展。大量的研究表明,聯(lián)合應(yīng)用不同治療基因可以產(chǎn)生較單基因更有效的作用?,F(xiàn)將多基因共表達載體構(gòu)建策略概括如下(l)基因之間以IRES(internalribosomeentrysite)(內(nèi)部核糖體進入位點)序列連接;(2)雙啟動子表達載體;(3)剪切載體;(4)基因之間以Fiiriii的切割耙點序列連接;(5)基因之間以2A序列連接;(6)表達融合基因。其中,IRES介導(dǎo)和雙啟動子介導(dǎo)的雙基因共表達模式是目前較常用的兩種構(gòu)建方式,前者為在上游啟動子的控制下,該IRES序列及與之相連的基因可同時轉(zhuǎn)錄,并以不依賴帽的方式啟動遠端mRNA的翻譯,從而在同一個轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白;后者為帶有polyA-promotor(CMV)各自獨立啟動子的兩個表達盒構(gòu)建于一個載體上,轉(zhuǎn)錄出兩種不同的mRNA并翻譯出不同的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知腺病毒載體是一類很有應(yīng)用前景的基因治療病毒載體,腺病毒是一種雙鏈DNA病毒,腺病毒載體與其他載體相比有如下許多優(yōu)點l.宿主范圍廣,對人致病性低;2.具有感染率髙、對分裂和非分裂細胞都能感染;3.能攜帶很長的治療基因和同時表達多個基因;4.不整合到染色體中,無插入致突變性,安全性好;5.能有效進行增殖,滴度髙,易加工制備等。采用pAdEasy腺病毒表達系統(tǒng)具有明顯優(yōu)點l.腺病毒質(zhì)粒的同源重組可在大腸桿菌BJ5183中髙效進行,且細菌繁殖快,同源重組能力強,因而從根本上克服細胞內(nèi)同源重組率低的缺陷2.腺病毒中可插入llkb的基因片段或同時插入多個基因片段;3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP報告基因,非常便于監(jiān)測病毒包裝成功與否、檢測病毒滴度及感染效率等。所有這些都避免了病毒的空斑克隆純化過程,大大減少了病毒的制備時間。構(gòu)建雙基因共表達重組轉(zhuǎn)移載體是作為腫瘤的基因治療藥物的有效途徑之一,但到目前為止,國內(nèi)外沒有關(guān)于利用IRES策略構(gòu)建ING4和IL-24雙基因載體的報道;另外,利用構(gòu)建polyA+promoter雙啟動子策略構(gòu)建雙基因重組轉(zhuǎn)移載體,雖然理論有相關(guān)研究,實踐中卻并沒有相關(guān)報道,而且該方法存在以下難點在利用在構(gòu)建polyA+promoter雙啟動子策略構(gòu)建雙基因重組轉(zhuǎn)移載體的過程中,發(fā)現(xiàn)polyA中有pad酶切位點,無法采用pacl酶切線性化后在293A細胞中進行腺病毒包裝,影響雙基因的正常表達。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供人ING4基因和人IL-24基因的雙基因重組轉(zhuǎn)移載體及其用途。為達到上述目的,本發(fā)明具體技術(shù)方案是,雙基因重組轉(zhuǎn)移載體,它含有人ING4基因和人IL-24基因,所述雙基因重組轉(zhuǎn)移載體選自pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24或PAdTrack-CMV-ING4-polyAA296~298+CMV-IL-24中的一種;所述雙基因重組轉(zhuǎn)移載體pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24具有序列表中SEQIDNO.l所述的堿基序列,其保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心;地址中國武漢大學(xué);保藏日期2008年10月12日;保藏編號CCTCCM208154;分類命名大腸桿菌DH5a/pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24;EscherichiacoliDH5a/pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24;所述雙基因重組轉(zhuǎn)移載體pAdTraCk-CMV-ING4-p0lyAA296~298+CMV-IL-24具有序列表中8妃010>xlOOX由圖24可見Ad-ING4、Ad-IL-24、和Ad-ING4-IL-24對MDA-MB-231細胞不僅均有不同程度的生長抑制作用,其中第四天抑制率各組分別可達45%、45%和68%左右,與Ad組和細胞對照組比較呈顯著性差異(P〈0.05);而且雙基因腺病毒Ad-ING4-IL-24對MDA-MB-231的抑制作用明顯優(yōu)于單基因腺病毒Ad-ING4和Ad-IL-24(P<0.05),但空病毒Ad對MDA-MB-231細胞幾乎無毒性作用。說明雙基因腺病毒Ad-ING4-IL-24對MDA-MB-231乳腺癌細胞的生長抑制作用明顯強于Ad-ING4、Ad-IL-24單基因腺病毒,有明顯的生長抑制增效功能。實施例二十二,Annexin-V-PE/7-AAD雙染的FCM檢測細胞凋亡同上分別感染處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞。37^C、5%C02培養(yǎng)72h后收集細胞,PBS洗滌2次,用結(jié)合緩沖液調(diào)節(jié)細胞至106107個/1111,取細胞10(HU于流式管中,加10nlAnnexin-V-PE冰上混勻,避光15min,再加結(jié)合緩沖液380fil,再加lOfil7-AAD,上流式細胞儀(FCM)檢測。如圖25,可見Ad-ING4、Ad-IL-24和Ad-ING4-IL-24均能不同程度誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡,其中凋亡率分別可達22.63%、15.8%和39.18%,與Ad組和細胞對照組比較呈顯著性差異(P〈0.05);尤以雙基因腺病毒Ad-ING4-IL-24組對誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡的作用明顯強于單基因腺病毒Ad-ING4組和Ad-IL-24組(P〈0.05)。說明Ad-ING4-IL-24雙基因表達對乳腺癌腫瘤細胞也具有誘導(dǎo)細胞凋亡的協(xié)同增效功能。實施例二十三,RT-PCR分析Bax、Bcl-2、Survivin細胞凋亡相關(guān)基因的表達按上述各組將重組腺病毒分別感染MDA-MB-231細胞(細胞數(shù)為lxl06)48h,收集細胞并提取總RNA,分別取2jiL模板樣品,以GAPDH為內(nèi)參照進行RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、和Survivin基因在MDA-MB-231細胞中mRNA的轉(zhuǎn)錄。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像儀分析(參見圖26)。瓊脂糖凝膠電泳條帶,通過BandScan4.0軟件對條帶進行灰度掃描分析,結(jié)果如表3,由表3可見,與PBS組和Ad組相比,感染100MOI的Ad-ING4-IL-24、Ad-ING4的MDA-MB-231細胞中的Bax基因表達明顯上調(diào),而Bcl-2和Survivin基因表達明顯下調(diào),Bax/Bcl-2比值明顯上調(diào),導(dǎo)致細胞凋亡;Ad-IL-24組MDA-MB-231細胞中的Bax基因表達明顯上調(diào),而Survivin基因表達則明顯下凋,盡管Bcl-2基因表達下調(diào)不明顯,但也可以引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值上調(diào),同樣也會導(dǎo)致細胞凋亡。表3細胞凋亡相關(guān)基因的半定量分析結(jié)果(目的條帶/GAPDH灰度比衝<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例二十四,VEGF濃度的ELISA測定用100MOI的Ad、Ad-ING4、Ad-IL-24、Ad-ING4-IL-24分別感染MDA-MB-231細胞48h后,lOOOr/mhi離心收集細胞培養(yǎng)上清,同時設(shè)不加病毒的細胞對照組(PBS組)。按ELISA試劑盒說明書測定各組細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度。經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示,Ad-ING4、Ad-IL-24和Ad-ING4-IL-24組培養(yǎng)上清中的VEGF水平與PBS組及Ad組比較均顯著減少(P〈0.05)。PBS組及Ad組比較VEGF表達水平差異不明顯(如圖27)。SEQUENCELISTING<110>蘇州大學(xué)<120>ING4和IL-24雙基因共表達載體及其用途<160>4<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>2803<212>DNA<213>大腸桿菌DH5a(£ic/^Wc/^co/,DH5a)<220><221>gene<222>(2801)..(2803)<223>nisa,c,g,ort<400>1t肌tagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttggt60肌atggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgta120tgttcccatatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacg180gta肌ctgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattga240cgtc肌tgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactt300tcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttg360gcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccc420cattgacgtcaatgggagtttgttttggcacgggactttc480t肌c肌ctccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatat540aagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctaccatggctgctgggat600gtatttgg肌cattatctggacagtattga肌acctcccgtttgaattacagaga肌ctt660tcagctcatgagggacctagaccaaaggacagaggacctgaaggctgaaattgacaagtt720ggccactgaatatatgagtagcgcccgcagcctgagctccgaggagaagctggcccttct780caaacagatccaggaggcctatggcaagtgcaaggagtttggtgacgacaaggtgcagct840ggccatgcagacctatgagatggtagacaa狄acattcggcggctggacacagacctggc卯Occgttttgaggctg錢tctg級gatcgagtccagtgactatgacagctcttc960tagcaaaggcaaa這agagccgg狄cc肌aaggagaaaa肌gctgccagagcccgttccaa1020agggaaaaactcagatg肌g肌gccccc肌gactgcccag肌g肌gttaaaacttgtgcg1080cacaagtcctgagtatgggatgccctcagtgacatttggcagtgtccacccctctgatgt1140gttggatatgcctgtggatccc肌cg肌cccacatattgcctttgtcaccaggtctccta1200tggagagatgattggctgtgac肌cccggattgttccatcgagtggttccacttcgcctg1260tgtggggctgacaacc肌acctcgagggaaatggttttgcccacgctgctcccaagaacg1320ga級ga級gaaataggtcgacaattccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggc1380cgaagccgcttggaat肌ggccggtgtgcgtttgtctatatgtgattttccaccatattg1440ccgtcttttggcaatgtgagcctggccctgtcttcttgacgagcattcct1500鄉(xiāng)ggtctttcccctctcgcca肌gg肌tgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagca1560gttcctctggaagcttcttgacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcgg1620肌ccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataag由cacct1680gcaa級ggcggcaca級ccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga1740tggctctcctcaagcgtattc肌caaggggctaaaggatgcccagaaggtaccccattgt1800atgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgmagtcgaggtt肌aa1860aaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaacacgatgataag1920cggccgctcgagaccatgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccaga1980cccttctgccctcctttgctggcgacagcctctcaaatgcagatggttgtgctcccttgc2040ctgggttttaccctgcttctctggagccaggtatcaggggcccagggcca2100tttgggccctgccaagtgaagggggttgttccccag級aactgtgggaagccttctgggct2160gtgaaagacactatgcaagctcaggataacatcacgagtgcccggctgctgcagcaggag2220gttctgcagaacgtctcggatgctgagagctgttaccttgtccacaccctgctggagttc2280tacttga肌actgttttcaa肌tag肌cagttg肌gtc級ggactctgaag2340tcattctctactctggcc肌caactttgttctcatcgtgtcacaactgca2400g肌肌tgag級tgttttccatcagagacagtgcacacaggcggtttctgctattccggaga2460gcattc肌acagttggacgtagaagcagctctgacca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1658SQ20081024430公開日2009年12月2日申請日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者楊吉成,謝宇鋒申請人:蘇州大學(xué)