本發(fā)明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及檢測ADAMTS13基因全外顯子突變的試劑盒和方法。
背景技術：
1924年，Eli Moschcowitz最初詳述了血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura，TTP)，其在臨床上主要表現(xiàn)為典型的三聯(lián)征:即血小板減少，微血管病性溶血性貧血，神經系統(tǒng)損傷；若同時伴有腎臟損害及發(fā)熱，則形成TTP經典的“五聯(lián)征”。1997年，慢性復發(fā)性TTP患者緩解期血漿中的超大分子量vWF多聚體與vWF裂解酶的缺失之間的聯(lián)系正式確立。此后，研究者們將這種水解蛋白酶純化，對先天性TTP家族成員進行了全基因組連鎖分析。ADAMTS13基因位于9q34，長度為37kb，包含29個外顯子。Zheng等首次對ADAMTS13進行了克隆，并將其列為ADAMTS家族的新成員，稱為ADAMTS13。先天性TTP的發(fā)病率小于5％，由于嚴重的ADAMTS13缺乏所致，與ADAMTS13基因突變有關。
現(xiàn)已報道的ADAMTS13突變已經超過140種，包括錯義突變、小片段缺失和插入、無義突變以及結合點突變等等。ADAMTS13的基因突變波及整個ADAMTS13蛋白，主要是降低其分泌和(或)酶活性。獲得性TTP80％的TTP患者屬于獲得性TTP，通常由于循環(huán)ADAMTS13自身抗體所致。這些抗體能夠抑制ADAMTS13蛋白的活性，但是也有10％－15％的患者體內沒有抑制性抗體，而是由于增加了抗體調節(jié)的ADAMTS13清除率導致ADAMTS13活性嚴重減低所致。
直接突變檢測通過DNA測序儀對ADAMTS13基因直接測序，找出突變的確切位置，可提供更為準確的信息。由于實現(xiàn)了自動化操作，我們采用的PCR結合DNA直接測序方法，因而大大縮短了診斷時間，節(jié)省了的人力和物力，測序效率高，能夠確定基因突變的位置和形式，結果也更為明確。
多種基因突變檢測技術包括蛋白截斷試驗(PTT)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、異源雙鏈分析(HA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)等方法,但所有這些方法均有一定的局限性,從而限制了基因突變的檢出率。目前常用的基因突變檢測的方法是基因測序和熒光定量PCR等。由于ADAMTS13容量大、突變類型多、突變位點散在分布,故而阻止了對ADAMTS13基因突變的深入研究，熒光定量PCR法并不適用。
本發(fā)明采用Sanger測序法檢測ADAMTS13基因全外顯子序列的突變，并且設計的引物可以擴展全外顯子序列，通過測序結果的分析，可以很直觀的了解ADAMTS13基因全外顯子的基因突變情況，并不受ADAMTS13的基因突變多樣化以及沒有突變熱點的影響，并且很大程度的節(jié)省了檢測成本。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供檢測ADAMTS13基因全外顯子的引物，采用Sanger測序法，可用于快速檢測ADAMTS13基因全外顯子突變的情況，用于TTP的基因診斷。
本發(fā)明的目的在于提供檢測ADAMTS13基因全外顯子的引物，包括：擴增覆蓋檢測ADAMTS13基因全外顯子突變的26對正、反向引物；其堿基序列為：
進一步地，引物序列ADAMTS13-1F、ADAMTS13-1R是擴增ADAMTS13基因第1號外顯子序列的引物，引物序列ADAMTS13-2F、ADAMTS13-3R是擴增ADAMTS13基因第2號外顯子序列的引物，引物序列ADAMTS13-5-6F、ADAMTS13-5-6R是擴增ADAMTS13基因第5和6號外顯子序列的引物，以此類推，引物序列ADAMTS13-17-18F、ADAMTS13-17-18R是擴增ADAMTS13基因第17和18號外顯子序列的引物，引物序列ADAMTS13-29F、ADAMTS13-29R是擴增ADAMTS13基因第29號外顯子序列的引物。
進一步地，所述26對正、反向引物的使用濃度為1:1；
本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測ADAMTS13基因全外顯子的方法，其包括如下步驟：
(1)提取樣品DNA；
(2)利用26對擴增引物ADAMTS13-1F與ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F與ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F與ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F與ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F與ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F與ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F與ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F與ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F與ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F與ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F與ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F與ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F與ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F與ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F與ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F與ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F與ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F與ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F與ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F與ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F與ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F與ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F與ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F與ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F與ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F與ADAMTS13-29R對(1)中的DNA分別進行擴增，獲得覆蓋檢測ADAMTS13基因全外顯子的擴增產物；
(3)利用1對測序引物M13-F與M13-R對(2)中的擴增產物進行正向和反向測序，獲得所述擴增產物的基因序列；
(4)將(3)中的基因序列與野生型ADAMTS13基因序列進行比較，確定突變位點是否存在；其中所述引物序列為：
本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測ADAMTS13基因全外顯子的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括樣品DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應液包括26對擴增引物ADAMTS13-1F與ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F與ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F與ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F與ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F與ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F與ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F與ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F與ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F與ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F與ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F與ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F與ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F與ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F與ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F與ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F與ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F與ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F與ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F與ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F與ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F與ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F與ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F與ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F與ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F與ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F與ADAMTS13-29R，測序體系反應液包括1對測序引物M13-F與M13-R。
進一步地，所述檢測體系PCR反應液還包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FX DNA Polymerase。
進一步地，所述測序體系反應液還包括測序純化液、EDTA、無水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
進一步地，所述測序純化液包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
有益效果：本發(fā)明設計了擴增覆蓋檢測ADAMTS13基因全外顯子序列的26對正、反向引物，并在PCR擴增的上游引物5’端和下游引物5’端分別加了一段長18bp的M13-F引物序列和長16bp的M13-R引物序列。這樣擴增產物兩端都會帶上所引入的M13-F及M13-R引物序列，隨后進行測序反應的時候，所有的擴增產物可以使用統(tǒng)一的M13-F和M13-R引物進行正反向測序。因為ADAMTS13基因有29個外顯子，每個樣本檢測需要擴增26個PCR產物，如果每個產物使用各自的測序引物進行測序，操作將會十分繁瑣，也極易引起污染。而本試劑盒這樣的設計有效的避免了這一問題，大大簡化了測序反應的操作步驟，使整個過程非常便捷。同時通過調整正反向引物的濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。
利用本發(fā)明所述擴展引物和測序引物，可以擴展整個全外顯子序列，通過測序結果的分析，可以很直觀的了解ADAMTS13基因全外顯子的基因突變情況，并不受ADAMTS13突變多樣化以及沒有突變熱點的影響，可覆蓋待檢測的所有突變位點；具有很高的特異性及準確性；采用PCR方法擴增目的基因并測序檢測其基因多態(tài)性，具有靈敏度高，操作簡單、成本低等優(yōu)點。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
實施例1
檢測ADAMTS13基因全外顯子的引物，包括：擴增覆蓋檢測ADAMTS13基因全外顯子的26對正、反向引物；所述擴展引物的堿基序列為：
所述引物還包括1對測序引物，其堿基序列為
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG
在檢測中，先利用上述26對正、反向擴增引物對覆蓋檢測ADAMTS13基因全外顯子的DNA片段進行擴增，獲得擴增產物，然后利用上述1對測序引物對擴增產物進行測序，獲得擴增產物的基因序列。
在引物設計上，所設計的每對引物都位于所要擴增的外顯子序列兩側，即擴增區(qū)域包括了該外顯子的全部序列。因為ADAMTS13的突變位點很多，突變類型不定。因此本發(fā)明所述引物既能將所述全部外顯子序列都擴增出來，也保證無論外顯子的何處位置發(fā)生突變，都不會出現(xiàn)漏檢的情況。因為第5和6號外顯子、第10和11號外顯子、第17和18號外顯子序列都較短，中間的內含子序列也很短，因此本發(fā)明在檢測第5和6號外顯子、10和11號外顯子、17和18號外顯子時，分別采用一對擴增引物，為ADAMTS13-5-6F和ADAMTS13-5-6R、ADAMTS13-10-11F和ADAMTS13-10-11R、ADAMTS13-17-18F和ADAMTS13-17-18F。通過如上創(chuàng)新性的用一對引物檢測連續(xù)的兩個外顯子，減少了實驗的操作步驟，縮短了檢測時間，減少了人力的投入，同時引物數(shù)量的減少，降低了檢測成本。
檢測ADAMTS13基因全外顯子的試劑盒，包括：組織DNA抽提試劑盒(例如使用天根生物的提取試劑盒)、無水乙醇、檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中
檢測體系PCR反應液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；檢測目的基因用的26對上、下游引物ADAMTS13-1F(10μm)與ADAMTS13-1R(10μm)；ADAMTS13-2F(10μm)與ADAMTS13-2R(10μm)；ADAMTS13-3F(10μm)與ADAMTS13-3R(10μm)；ADAMTS13-4F(10μm)與ADAMTS13-4R(10μm)；ADAMTS13-5-6F(10μm)與ADAMTS13-5-6R(10μm)；ADAMTS13-7F(10μm)與ADAMTS13-7R(10μm)；ADAMTS13-8F(10μm)與ADAMTS13-8R(10μm)；ADAMTS13-9F(10μm)與ADAMTS13-9R(10μm)；ADAMTS13-10-11F(10μm)與ADAMTS13-10-11R(10μm)；ADAMTS13-12F(10μm)與ADAMTS13-12R(10μm)；ADAMTS13-13F(10μm)與ADAMTS13-13R(10μm)；ADAMTS13-14F(10μm)與ADAMTS13-14R(10μm)；ADAMTS13-15F(10μm)與ADAMTS13-15R(10μm)；ADAMTS13-16F(10μm)與ADAMTS13-16R(10μm)；ADAMTS13-17-18F(10μm)與ADAMTS13-17-18R(10μm)；ADAMTS13-19F(10μm)與ADAMTS13-19R(10μm)；ADAMTS13-20F(10μm)與ADAMTS13-20R(10μm)；ADAMTS13-21F(10μm)與ADAMTS13-21R(10μm)；ADAMTS13-22F(10μm)與ADAMTS13-22R(10μm)；ADAMTS13-23F(10μm)與ADAMTS13-23R(10μm)；ADAMTS13-24F(10μm)與ADAMTS13-24R(10μm)；ADAMTS13-25F(10μm)與ADAMTS13-25R(10μm)；ADAMTS13-26F(10μm)與ADAMTS13-26R(10μm)；ADAMTS13-27F(10μm)與ADAMTS13-27R(10μm)；ADAMTS13-28F(10μm)與ADAMTS13-28R(10μm)；ADAMTS13-29F(10μm)與ADAMTS13-29R(10μm)。
測序體系反應液包括：測序純化液、EDTA(125mmol)、無水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去離子甲酰胺)、測序引物：M13-F(3.2μm)與M13-R(3.2μm)，以及Bigdye TeRminatoR V3.1(購買自美國Applied Biosystems公司)，其中測序純化液包括蝦堿性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
陽性對照品：含有野生型ADAMTS13序列的溶液。
陰性對照品：無野生型ADAMTS13序列的溶液。
空白對照品：2μl生理鹽水或不加任何物質。
實施例2
(1)抽提血液中的基因組DNA(按照血液DNA抽提試劑盒(天根生物)的說明書操作):
1)抽取500ul血液加入1000ul紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。3000Rpm離心5分鐘，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200ul緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混勻。
3)加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，短暫離心以去除管蓋內壁的水珠。
4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，短暫離心以去除管蓋內壁的水珠。
5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000Rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000Rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000Rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000Rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液。
9)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000Rpm(13,400×g)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
10)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000Rpm(13,400×g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
(2)試劑配置：按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應液各Xμl，每人份18μl分裝：
X＝18μl反應液×(n份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)
n為檢測標本數(shù)。
檢測體系PCR反應液配制如下：
其中，F(xiàn)與R選自ADAMTS13-1F與ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F與ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F與ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F與ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F與ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F與ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F與ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F與ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F與ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F與ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F與ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F與ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F與ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F與ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F與ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F與ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F與ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F與ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F與ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F與ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F與ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F與ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F與ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F與ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F與ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F與ADAMTS13-29R。
(3)加樣：加入3個檢測體系PCR反應液中各2μl DNA；陽性對照和陰性對照直接加2μl陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2μl生理鹽水或不加任何物質。其中陽性對照品是含有野生型ADAMTS13序列的溶液，陰性對照品是無野生型ADAMTS13序列的溶液，空白對照品是2μl生理鹽水或不加任何物質。
(4)擴增：檢測在常規(guī)PCR儀上進行，可用儀器包括ABI veRiti(美國Applied Biosystems公司)等。反應條件如下：
(5)Sanger測序：
取9μl PCR產物與2μl純化體系。按照以下程序進行純化：
將1μl純化產物分別與測序引物：M13-F(3.2μm)與M13-R(3.2μm)，按照如下體系進行混合：
測序反應程序：
沉淀環(huán)節(jié)：
向完成測序反應的產物中加入2μl 125mmol的EDTA，靜置5min；加入15ml無水乙醇，漩渦混勻；3700Rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50ml 70％乙醇，漩渦混勻；3700Rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μl HIDI后進行變性試驗。變性程序：
變性程序結束后，上測序儀(ABI3730)測序。
(7)結果判斷：將測序結果與野生型參考序列(GeneBank No.:NG_011934.2)進行比對，根據實際突變情況對結果進行報告。
實施例3
取臨床患者樣本8份，8份樣本都確定是患有TTP，檢測該8份樣本是否存在ADAMTS13突變。按實施例2所述方法提取基因組、配制試劑并檢測。每份樣品2μl加入檢測體系PCR反應液中。同時做陽性對照，陰性對照，空白對照各一份。檢測結果如下所述：
陽性對照品的測序結果與野生型ADAMTS13序列(GeneBank No.:NG_011934.2)進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者完全一致，證明所用引物可以準確擴增出ADAMTS13基因的全部外顯子，使用其引物進行擴增和測序的方法準確可靠，符合基因擴增和測序要求。
陰性對照品和空白對照品未出現(xiàn)測序結果，說明上述引物不會產生非特異性擴增，測序結果真實可靠。
8份臨床患者樣本中，根據其測序結果與野生型ADAMTS13序列(GeneBank No.:NG_011934.2)進行對比，未發(fā)現(xiàn)突變，說明8份樣本不存在ADAMTS13突變。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司
<120> 檢測ADAMTS13基因全外顯子的試劑盒和方法
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<170> PatentIn version 3.5
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aacagctatg accatgctca aatgtgtcct ggtgtgaacc a 41
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagtgc tgaggccaca cccacatctt gat 43
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacagctatg accatgggat gccagagcct gaaccacttt g 41
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagtag atagaaaccc ttgccccaga tgc 43
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aacagctatg accatgagat ccttttcccc agcaccactc c 41
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtaaaacga cggccagtgg cagggctgca gagtcattga ggc 43
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacagctatg accatgcaga agggtggcga agtggaagag g 41
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtag ctccctttgt ctgtggtgtg gtg 43
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aacagctatg accatgcaac tatcaagcct gagggtggtt 40
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgtaaaacga cggccagttg gggaccccgg gaaggagagt cac 43
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
aacagctatg accatgctgt aagtgaccgc tgaatgaata 40
<210> 29
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgtaaaacga cggccagttt ggccaggctg gagtgctatg ttg 43
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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aacagctatg accatgtgca gaatgggggc actcacagag c 41
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgtaaaacga cggccagttc accagcctgt gattcggttg tcc 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aacagctatg accatgtaag gaactctgac agcagcactt a 41
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgtaaaacga cggccagttc ctctttgggc tcctggatgt tgg 43
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aacagctatg accatgggca atgggtgctc ctcgttctcc 40
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tgtaaaacga cggccagtgc aaggataccc gctgcgagac cg 42
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aacagctatg accatgtcag ccaatcaaca cccacatttg a 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tgtaaaacga cggccagtac ccatgcgggc cttatgtgct aga 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aacagctatg accatggctc tgggttgcag tcctcaaagg 40
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<211> 43
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<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagtaa gggggcctcc agaaagagaa cct 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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aacagctatg accatgctgt gttgcccagg ttggacttgc a 41
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtaaaacga cggccagtgg gctcagtggc tgcactttcc at 42
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aacagctatg accatgcttc cagcgtcccc aaacctaagg 40
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tgtaaaacga cggccagtgt gacagggacc cagacttgaa tta 43
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<211> 41
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<213> 人工序列
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aacagctatg accatgtcaa gttacttccc cttgatagta g 41
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
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aacagctatg accatgactg ggcacatcac ttaatctctc c 41
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<400> 47
tgtaaaacga cggccagtat gtgcattccc acctgtagtt tgc 43
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 51
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<400> 54
aacagctatg accatg 16