本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單序列重復(fù)。它是以1-6個(gè)堿基的短核苷酸為基本單位首尾相連組成串聯(lián)重復(fù)序列，由于重復(fù)次數(shù)不同以及重復(fù)程度的不完全造成了每個(gè)位點(diǎn)的長度多態(tài)性。由于每個(gè)微衛(wèi)星兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，再經(jīng)電泳分析，即可顯示不同基因型個(gè)體微衛(wèi)星的多態(tài)性。微衛(wèi)星由于分布廣泛，密度大，多態(tài)性豐富，遵循孟德爾分離定律，共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增，所需DNA含量極少，對DNA質(zhì)量要求不高，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
安吉小鯢(Hynobius amjiensis)隸屬于兩棲綱(Amphibia)，有尾目(Urodela)，小鯢科(Hynobiidae)，小鯢屬(Hynobius)，是于1991年才發(fā)表的物種。安吉小鯢為我國的特有物種，僅在浙江省安吉縣龍王山、浙江省清涼峰、浙江省天目山口和安徽清涼峰內(nèi)有所分布。兩棲動(dòng)物對生境質(zhì)量要求較高，隨著生態(tài)環(huán)境質(zhì)量下降和保護(hù)區(qū)內(nèi)游客的干擾，安吉小鯢的適宜生境在不斷地縮減，種群的長期穩(wěn)定和持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。目前，安吉小鯢已被列入《中國物種紅色名錄》、《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》、《IUCN瀕危物種紅皮書》和《國家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究價(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》。同時(shí)，安吉小鯢被列為全球十大瀕危的兩棲動(dòng)物，種群的長期生存發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的安吉小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性擴(kuò)增引物，為安吉小鯢的種群遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、人工輔助繁育及后期保護(hù)提供有效的工具。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記，安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；或?yàn)樯鲜鋈我缓塑账嵝蛄械幕パa(bǔ)序列；
所述SEQ ID NO：2對應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam26；
所述SEQ ID NO：7對應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam74；
所述SEQ ID NO：8對應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam87；
所述SEQ ID NO：9對應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam91。
作為本發(fā)明的安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的改進(jìn)：安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的特異性引物對為如下任一所示：
微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam26特異性引物：Primers:L:TGATCCCAATCAATCCATGA
R:AAGGTTGGAGACCGATGATG
微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam74特異性引物：Primers:L:GCTCTCCTCCAGACTCCCTT
R:TTTTCCTTGAATCAGGCAGG
微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam87特異性引物：Primers:L:TGTGACAGCTTAGCGACTGC
R:CTTGTTCCGAGAAGGAGACG
微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam91特異性引物：Primers:L:TCAATACCAGCATGCCTCAA
R:GCAGCAGTGACAGCAAAAAG。
本發(fā)明還同時(shí)提供了上述安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的用途：用于分析安吉小鯢種群遺傳多樣性、分析安吉小鯢親緣關(guān)系、分析安吉小鯢人工輔助繁育、用于對安吉小鯢后期保護(hù)。
作為本發(fā)明的安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的用途的改進(jìn)：利用引物對檢測安吉小鯢種群遺傳多樣性的方法包括如下步驟：
1)、提取(可采用酚-氯仿法提取)安吉小鯢的基因組DNA；
2)、微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：
采用微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam26、Hyam74、Hyam87、Hyam91中任一的特異性引物，以安吉小鯢基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得安吉小鯢個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)、擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性檢測：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和DNA測序；
4)、遺傳多樣性分析：根據(jù)每個(gè)安吉小鯢個(gè)體的微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用CERVUS 3.0和POPGENE 3.2計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。
本發(fā)明還同時(shí)提供了上述安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的特異性引物對的獲得方法：引物對設(shè)計(jì)參數(shù)為：引物長度均為20bp，PCR產(chǎn)物片段長度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65℃，GC含量40％-60％之間。
作為本發(fā)明的安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記的特異性引物對的獲得方法的改進(jìn)：
(1)安吉小鯢簡化基因組測序：提取安吉小鯢的DNA，經(jīng)酶切，建立測序文庫，采用Illumina HiSeqTM4000進(jìn)行簡化基因組測序，獲得安吉小鯢原始序列；
(2)安吉小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測：將簡化基因組測序獲得的原始序列用軟件MISA進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)查找，得到多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)；
(3)對篩選得到的微衛(wèi)星位點(diǎn)用Primer3軟件進(jìn)行批量引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)要求為如上所述的引物對設(shè)計(jì)參數(shù)，從設(shè)計(jì)成功的引物中隨機(jī)選取一部分進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證。
本發(fā)明的整體發(fā)明內(nèi)容如下：
本發(fā)明提供9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1-9所示，或?yàn)樯鲜龊塑账嵝蛄械幕パa(bǔ)序列。
本發(fā)明還提供分別用于擴(kuò)增上述9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物對。優(yōu)選地，所述引物對設(shè)計(jì)參數(shù)為：引物長度均為20bp，PCR產(chǎn)物片段長度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65℃，GC含量在40％-60％之間。優(yōu)選地，上下游序列分別為SEQ ID：10(Hyam06-L)、SEQ ID：11(Hyam06-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：1所示的微衛(wèi)星標(biāo)記(Hyam06)；上下游序列分別為SEQ ID：12(Hyam26-L)、SEQ ID：13(Hyam26-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：2(Hyam26)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：14(Hyam35-L)、SEQ ID：15(Hyam35-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：3(Hyam35)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：16(Hyam39-L)、SEQ ID：17(Hyam39-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：4(Hyam39)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：18(Hyam40-L)、SEQ ID：19(Hyam40-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：5(Hyam40)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：20(Hyam63-L)、SEQ ID：21(Hyam63-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：6(Hyam63)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：22(Hyam74-L)、SEQ ID：23(Hyam74-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：7(Hyam74)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：24(Hyam87-L)、SEQ ID：25(Hyam87-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：8(Hyam87)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQ ID：26(Hyam91-L)、SEQ ID：27(Hyam91-R)的引物對，用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID：9(Hyam91)所示的微衛(wèi)星標(biāo)記。
綜上所述，本發(fā)明從安吉小鯢基因組DNA中篩選出9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(精選其中的4個(gè))，根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性，可用于安吉小鯢的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、人工輔助繁育和后期保護(hù)等領(lǐng)域。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
實(shí)施例1、
1、安吉小鯢簡化基因組測序
提取安吉小鯢的DNA，經(jīng)酶切，建立測序文庫，采用Illumina HiSeqTM4000進(jìn)行簡化基因組測序，獲得安吉小鯢原始序列；
2、含有微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列的查找
從獲得的安吉小鯢的原始序列中用MISA軟件進(jìn)行微衛(wèi)星重復(fù)單元序列的查找；參數(shù)設(shè)置為查找含有一個(gè)堿基重復(fù)10次及10次以上，二個(gè)堿基重復(fù)次數(shù)6次及6次以上，三個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上，四個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上，五個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上，六個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上。同時(shí)，當(dāng)兩個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100bp的時(shí)候，兩個(gè)微衛(wèi)星組成一個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。共篩選出15539個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，并從中設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多態(tài)性的檢測。
3、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)
從含有微衛(wèi)星重復(fù)單元的基因序列中，選取符合引物設(shè)計(jì)的序列使用Primer 3進(jìn)行批量引物設(shè)計(jì)。主要參數(shù)設(shè)置為：引物長度20bp，PCR產(chǎn)物片段長度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65℃，GC含量40％-60％之間，盡量避免二級結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
4、對設(shè)計(jì)的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)性檢測：
(1)基因組DNA的提?。?/p>
采用酚-氯仿法提取24個(gè)安吉小鯢肌肉組織的基因組DNA；
(2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：
用上述設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增安吉小鯢基因組DNA；反應(yīng)體系10μL：模板DNA 0.4μL(10ng/μL)，正反向引物各0.2μL，TaKaRa Taq酶0.08μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)1.0μL，Mgcl2 0.8μL，dNTP Mixture 0.8μL，無菌水6.52μL。
PCR反應(yīng)在S1000TMThermal Cycler儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變形45min；94℃變性30s，退火溫度下復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸3min。
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性檢測：
將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和DNA測序以確定安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記在不同個(gè)體上的等位基因大小。
(4)遺傳多樣性分析：
根據(jù)每個(gè)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因大小確定基因型，采用CERVUS 3.0和POPGENE 3.2計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，從而篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物及對應(yīng)的微衛(wèi)星標(biāo)記。
經(jīng)過多樣性檢測，本發(fā)明篩選了9個(gè)具有遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-9所示，其所對應(yīng)的擴(kuò)增引物的信息如表1所示。
表1、安吉小鯢微衛(wèi)星位點(diǎn)及其對應(yīng)的引物
如表2所示，在24個(gè)樣本中對上述9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析的結(jié)果表明：9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)分別為2-4個(gè)，平均等位基因數(shù)目為3.33個(gè)，觀測雜合度在0.000-1.000，期望雜合度在0.308-0.691，PIC(Polymorphic information content，多態(tài)性信息含量)值在0.279-618。從而證明本發(fā)明篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物具有遺傳多態(tài)性。
表2、9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳特征(Ta：退火溫度；NA：等位基因數(shù)目；HO：觀測雜合度；HE：期望雜合度；PIC：polymorphic information content，多態(tài)信息含量；P-HWE：Hardy-Weinberg equilibrium，哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn))
注：表中的*表示顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。
本發(fā)明的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其擴(kuò)增引物還可用于安吉小鯢遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、人工輔助育種和后期保護(hù)等領(lǐng)域的研究。
實(shí)驗(yàn)一、
將安吉小鯢和義烏小鯢，分別按照上述實(shí)施例1所述內(nèi)容進(jìn)行檢測，所得結(jié)果為：
安吉小鯢能擴(kuò)增得到微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam26、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam74、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam87、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam91相應(yīng)的序列；而義烏小鯢不能獲得上述4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)相應(yīng)的序列。
就微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam06、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam35、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam39、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam40、微衛(wèi)星位點(diǎn)Hyam63而言，安吉小鯢和義烏小鯢均能擴(kuò)增得到相應(yīng)的序列。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
<110> 浙江師范大學(xué)
<120> 安吉小鯢微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用
<160> 27
<210> 1
<211> 248
<212> DNA
<213> 安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam06
<400> 1
ccgaactgtc gggtaaagat gtgtgtaatt caaatagcag atagatagat 50
agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat aggtagataa 100
atagcactca tatgccattt ggcacaaact tctgggcata gctgataatg 150
gggattgctc catgctagta cttatagagc tctccgcggt ctttgatatg 200
gttgcccatg aaatcttggt cacccgtttc actgcagaac taggggct 248
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam26
<400> 2
tgatcccaat caatccatga ggcaaactat ggacacttca agttgaacca 50
cgtggcaaag aaggtctatg gatggctggt caaagactct gaatatggac 100
tgatctagtg agggtttcaa cctcaactga tgtgacctgc tgctgatctt 150
ggtgggggag gcagcaggtc atggcagggg ctcaggcacg tgctacttcc 200
cagaggagga agaacgctgc gcacctgctg gccctctaga gagcagtttg 250
agcctgtagt agtagtagta gtagtagcag cagcagcagc agcagcagca 300
gcagcatcac catcatcggt ctccaacctt 330
<210> 3
<211> 265
<212> DNA
<213>安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam35
<400> 3
taaagtgaga cgtgggggtc gttctttctc ccatcagggg gccctcctct 50
ggaacacgtt cccagaagag cttaaagagg ccaactcctt agctagcttc 100
tgtcgccatc tgtagacttg gcttcgccag ggacaaagat tgacgcgttg 150
agaccccatc ggggtaattt gaaccgcgcg ttactagacg cacctcatca 200
tcatcatcat catcatcatc atcatcatca ggacctgtca ctgaaaacct 250
gtgtccgcct ctaga 265
<210> 4
<211> 304
<212> DNA
<213>安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam39
<400> 4
cctcctggag ctagttacgc tcaccacttg ggtttcgctg ggatgggaca 50
ggttcaggct ctgcctgctc ccagactcag tgcaccctta cctgtgcact 100
ccctttatgg acagcaaaga ccaagggggg aatccttttg ggattctccc 150
cctcctactg agtctcttga gggtttggct gccctagttc ggggtatggt 200
cagggatgag acaggtcgga ggtctccccc tcgtccttct cctcctcctc 250
ctcctcatgc tggtggaggg gtgtctgagc cttcaaggca acgtctgcaa 300
actc 304
<210> 5
<211> 112
<212> DNA
<213>安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam40
<400> 5
ccctcctttt ccacttccat aaacaaaaac ggacattctg ctgctgctgc 50
tgctgctcat ggagccgcag tgcctcccct tacccaagag ggggcagtcg 100
ctaagctgtc ac 112
<210> 6
<211> 235
<212> DNA
<213> 安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam63
<400> 6
aaggtggccc caataatttc catgacctcg caaactgcct ggcagaagac 50
aaacacacac acacacactt taatttgaca ggtaaagtgt aaagtataaa 100
atctgggccg ctgacatttc tctagtccca cagattggct gtttctagga 150
tttgcttctt ttaactcaga tgcctatgta gtaggctgtg ggtcatattg 200
acagaatccc gttttgcaat gagcccaggt aaaag 235
<210> 7
<211> 279
<212> DNA
<213>安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam74
<400> 7
gctctcctcc agactccctt ccaacctgaa gccttcaacc aactctctct 50
ctctctctct ctctctctct ctctctctct caagactaaa cagttccaga 100
attctagttg agataaaaac attctgtttc catgttgtgg tatcacaaca 150
catattagag atcctaaaag atgcttttgg aactctggga actctgagag 200
agttttctga tgagggaggc acacattttt caggggagaa acttccttct 250
aactcacacc ctgcctgatt caaggaaaa 279
<210> 8
<211> 295
<212> DNA
<213>安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam87
<400> 8
tgtgacagct tagcgactgc ccccttctgg gtaaggggag gcactgcggc 50
tccatgagca gcagcagcag cagcagcagc agaatgtccg tttttgttta 100
tggaagtgga aaaggagggg ggggggatgg agagaggatg cctgactatt 150
tgcatagcag gatcctaggt gaagagagta tcctgggaga ggacggtgcg 200
ctctgagcca gagctctctg taggattccc agtccctcca gaggccgcaa 250
tcctcatttc tctgcctgtg cccaccgtct ccttctcgga acaag 295
<210> 9
<211> 210
<212> DNA
<213>安吉小鯢Hynobius amjiensis 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hyam91
<400> 9
tcaataccag catgcctcaa attaacacaa tcaaaaaggg aacaagcatc 50
aaccaacccg ttgtggggaa accctcagaa tctgcatatg ctttgtgata 100
tgcttttcag tgtcttgcta taattgaaag caatgctact ggcactgctg 150
ctgctgctgc tgctgctgct gcatgacctg ctggtctact ctttttgctg 200
tcactgctgc 210
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam06-L
<400> 10
ccgaactgtc gggtaaagat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam06-R
<400> 11
agcccctagt tctgcagtga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam26-L
<400> 12
tgatcccaat caatccatga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam26-R
<400> 13
aaggttggag accgatgatg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam35-L
<400> 14
taaagtgaga cgtgggggtc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam35-R
<400> 15
tctagaggcg gacacaggtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam39-L
<400> 16
cctcctggag ctagttacgc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam39-R
<400> 17
gagtttgcag acgttgcctt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam40-L
<400> 18
ccctcctttt ccacttccat 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam40-R
<400> 19
tgtgacagct tagcgactgc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam63-L
<400> 20
aaggtggccc caataatttc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam63-R
<400> 21
cttttacctg ggctcattgc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam74-L
<400> 22
GCTCTCCTCC AGACTCCCTT 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam74-R
<400> 23
ttttccttga atcaggcagg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam87-L
<400> 24
tgtgacagct tagcgactgc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam87-R
<400> 25
cttgttccga gaaggagacg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam91-L
<400> 26
tcaataccag catgcctcaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>特異引物序列Hyam91-R
<400> 27
gcagcagtga cagcaaaaag 20