本發(fā)明屬于中藥材鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒定金錢白花蛇的特異性引物、試劑盒及鑒別方法。
背景技術(shù)：
金錢白花蛇為《中國藥典》2015年版一部收載的一種常用藥材，來源于眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥體，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效。臨床用于治療風(fēng)濕頑痹，麻木拘攣，中風(fēng)口眼斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風(fēng)，麻風(fēng)等病癥。
金錢白花蛇作為一種常用的名貴中藥材，主要分布于我國浙江、廣東、廣西、云南和貴州等省份。近年來，由于生態(tài)環(huán)境不斷地惡化以及金錢白花蛇產(chǎn)卵率較低等因素致使其藥材資源急劇減少，又鑒于其療效確切，使用量大，飼養(yǎng)條件和技術(shù)要求嚴(yán)格，導(dǎo)致金錢白花蛇價格節(jié)節(jié)攀升。在利益驅(qū)使下，一些不法商家以次充好，使得商品中常充斥著混雜和偽品。比較常見的偽品有赤鏈蛇、鉛色水蛇和金環(huán)蛇等。針對金錢白花蛇嚴(yán)重的造假情況，研究人員利用分子生物學(xué)PCR技術(shù)來對金錢白花蛇真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，如中國專利文CN101613759A中公開的鑒定金錢白花蛇的PCR方法及其特異引物，通過對金錢白花蛇的CYTB基因片段設(shè)計引物并進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增、電泳檢測即可完成對樣品真?zhèn)蔚蔫b別。然而上述方案中采用的引物進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物分子量為565bp，分子量大，導(dǎo)致其電泳時間長，檢測效率低，并且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度和靈敏度低、種屬特異性差，對于種屬相近的蛇鑒別困難。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題在于提供一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的特異性引物，采用所述引物鑒定中藥金錢白花蛇，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠、特異性強(qiáng)和靈敏度高，能夠在短時間內(nèi)對大量待測中藥金錢白花蛇進(jìn)行快速鑒定。
本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題在于提供一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的試劑盒，采用所述試劑盒鑒定中藥金錢白花蛇，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠、特異性強(qiáng)和靈敏度高，能夠在短時間內(nèi)對大量待測中藥金錢白花蛇進(jìn)行快速鑒定。
本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題在于提供一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的方法，采用所述方法鑒定中藥金錢白花蛇，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠、特異性強(qiáng)和靈敏度高，能夠在短時間內(nèi)對大量待測中藥金錢白花蛇進(jìn)行快速鑒定。
為此，本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的引物，所述引物序列如下：
上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。
本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的試劑盒，含有所述的引物。
本發(fā)明所述的試劑盒，每支所述試劑盒包括各自獨(dú)立包裝的引物液部分和PCR反應(yīng)液部分；所述PCR反應(yīng)液部分含有用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的含Mg2+擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH2O。
本發(fā)明提供了一種所述的引物或所述的試劑盒在鑒定中藥金錢白花蛇中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種鑒定中藥金錢白花蛇的方法，包括如下步驟：
(1)提取待測中藥金錢白花蛇的總DNA，備用；
(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
上游引物:5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物:5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。
(3)測定步驟(2)中所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有100～250bp的DNA片段，則所述待測中藥金錢白花蛇為真；反之，則所述待測中藥金錢白花蛇為假。
所述的方法，所述步驟(2)中，所述PCR反應(yīng)體系包括：
DNA模板，100ng，2μL；
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
2×EasyPCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
反應(yīng)總體積為22μL。
(4)所述的方法步驟(2)中，PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)，然后繼續(xù)72℃延伸5min，降溫至4℃，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。所述的方法(3)中100～250bp的DNA片段為181bp。所述的方法181bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示。
本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
(1)本發(fā)明所述的用于鑒定中藥金錢白花蛇的特異性引物，基于金錢白花蛇的CYTB基因設(shè)計了大量的引物，通過對大量引物篩選研究，篩選出了具有種屬特異性的引物，使用上述引物對待測中藥金錢白花蛇進(jìn)行鑒定，能將金錢白花蛇藥材與其他混淆品準(zhǔn)確的分開，且其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅為100～250bp，分子量小，保證了其能在短時間內(nèi)進(jìn)行大量的中藥金錢白花蛇鑒定，同時鑒定結(jié)果顯示，此方法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛適用于中藥金錢白花蛇的鑒定。
(2)本發(fā)明所述的用于鑒定中藥金錢白花蛇的試劑盒，所述試劑盒中含有所述的用于鑒定中藥金錢白花蛇的特異性引物，所述引物具有種屬特異性，使用上述引物對待測中藥金錢白花蛇進(jìn)行鑒定，能將金錢白花蛇藥材與其他混淆品準(zhǔn)確的分開，在短時間內(nèi)進(jìn)行大量的中藥金錢白花蛇鑒定，同時鑒定結(jié)果顯示，此方法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛適用于中藥金錢白花蛇的鑒定。
(3)本發(fā)明所述的鑒定中藥金錢白花蛇的方法，采用本發(fā)明設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有100～250bp的DNA片段，且所述100～250bp的DNA片段為181bp的DNA片段，則所述待測中藥金錢白花蛇為真；反之，則所述待測中藥金錢白花蛇為假；所述方法能將金錢白花蛇藥材與其他混淆品準(zhǔn)確的分開。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見的，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下述實(shí)施中所使用的主要試劑如下：
EasyGenomic DNA Kit、2×EasyPCR SuperMix(+dye)和Trans2K Plus DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)公司。
本發(fā)明下述實(shí)施中所使用的主要設(shè)備如下：
ST16R高速冷凍離心機(jī)購自賽默飛世爾、V-GES電泳儀購自威泰克、Dolphin View凝膠成像系統(tǒng)購自威泰克。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的特異性引物，針對金錢白花蛇的CYTB基因設(shè)計的特異性引物如下，參見序列表中SEQ ID NO：1-2所示：
上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′；
上述引物由上海英濰捷基公司(北京合成部)合成。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的試劑盒，每支所述試劑盒包括各自獨(dú)立包裝的引物液部分和PCR反應(yīng)液部分；所述引物液為含所述實(shí)施例1中的所述特異性引物；所述PCR反應(yīng)液部分含有用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的含Mg2+擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH2O，每支所述試劑盒的配方為：
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
2×EasyPCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
總體積為20μL。
實(shí)施例3
本實(shí)施例3提供了一種利用實(shí)施例1的特異性引物或?qū)嵤├?的試劑盒鑒定中藥金錢白花蛇的方法，包括如下步驟：
(1)藥材收集于浙江、江西、廣西和四川等省份(表1)，表1中試驗(yàn)所有的樣品均為市售產(chǎn)品，可以通過購買得到，或是自來源地采集或購買。
表1金錢白花蛇及其常見偽品樣品來源
選取上表1中的樣品的凍干粉采用EasyGenomic DNA Kit進(jìn)行總DNA的提取，按照說明書操作，步驟如下：
(1)總DNA提取制備
1)分別稱取各樣品的凍干粉≤25mg，置于無菌的1.5mL離心管中；
2)分別加入100μL的LB2(裂解液)和20μL的Proteinase K(蛋白酶K)；
3)55℃金屬浴孵育1小時至DNA完全裂解，每15min顛倒混勻一次；
4)加入20μL的RNase A(RNA酶)于樣品中，室溫孵育2min，除去RNA的干擾；
5)12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液于無菌的離心管中；
6)加入500μL的BB2(結(jié)合緩沖液)，立即渦旋5s，室溫孵育10min；
7)將全部的溶液加入離心柱中，12000rpm離心30s，棄去流出液；
8)加入500μL的CB2(清洗緩沖液)，12000rpm離心30s，棄去流出液；
9)重復(fù)步驟8)一次；
10)加入500μL的WB2(洗滌緩沖液)，12000rpm離心30s，棄去流出液；
11)重復(fù)步驟10)一次；
12)12000rpm離心2min，徹底去除殘留的WB2；
13)將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入50μL 65℃預(yù)熱EB(洗脫緩沖液)，室溫靜置1min，12000rpm離心1min，洗脫DNA，洗脫出的DNA作為供試品溶液，置于-20℃保存。
(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。
所述PCR反應(yīng)體系包括：
DNA模板，100ng，2μL；
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
2×EasyPCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
反應(yīng)總體積為22μL。
所述PCR擴(kuò)增程序如下：
95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)，然后繼續(xù)72℃延伸5min，降溫至4℃，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。
(3)取步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用V-GES電泳儀，測得各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，瓊脂糖凝膠電泳法按照2015年版中國藥典三部附錄ⅣB，膠濃度為1％，TAE電泳緩沖液(Tris-EDTA-乙酸緩沖液，pH 8.3)，上述步驟(2)中獲得的各樣品的PCR反應(yīng)溶液的上樣量分別為10μL，DNA分子量標(biāo)記(Trans2K Plus DNA Marker)上樣量為2μL，電泳結(jié)束后，取凝膠在溴化乙錠溶液(0.5μg/mL)中染色20min，在Dolphin View凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，其中1為DNA Marker，2為金錢白花蛇，3為金環(huán)蛇，4為赤鏈蛇，5為鉛色水蛇，6為虎斑頸槽蛇(圖1)，金錢白花蛇的凍干粉的PCR反應(yīng)液在100～250bp有一條DNA條帶，所述DNA條帶為引物設(shè)計的PCR產(chǎn)物大小(181bp)，而金環(huán)蛇、赤鏈蛇、鉛色水蛇和虎斑頸槽蛇沒有條帶，表明本發(fā)明設(shè)計的引物具有種屬特異性，采用該特異性引物、試劑盒及鑒別方法能準(zhǔn)確的將金錢白花蛇藥材與其他混淆品分開，并且擴(kuò)增的DNA片段僅為181bp，分子量小，檢測速率快，采用EasyGenomic DNA Kit純化回收所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后由上海英濰捷基公司(北京合成部)進(jìn)行測序，所述的181bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示。
顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京建生藥業(yè)有限公司
<120> 用于鑒定金錢白花蛇的特異性引物、試劑盒及鑒別方法
<130> HA201602556
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccgctccat aacctttcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcagttcagc cgagtaaggg 20
<210> 3
<211> 181
<212> DNA
<213> 金錢白花蛇Bungarus multicinctus
<400> 3
cccgctccat aacctttcgt ccatttatac aaatcctatt ttgaacatta gtctcaacct 60
ttattattat tacatgaaca gccactaaac ctgtagaatc gccattcatt cttatcagcc 120
aaacaacttc aattatctac ttctccttct ttattattaa tcccttactc ggctgaactg 180
a 181