本發(fā)明涉及人基因組DNA突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的PCR引物、探針及熒光定量PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

多指(趾)畸形（polydactyly，PD）是以手/足有一個(gè)或者多個(gè)額外的指(趾)樣贅生物為特征，可以單發(fā)或多發(fā)畸形的形式出現(xiàn)，是我國(guó)常見的先天畸形之一。根據(jù)中國(guó)出生缺陷監(jiān)測(cè)網(wǎng)的資料，其發(fā)生率一直居于前三位。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的發(fā)生率在 5/萬-19/萬之間，存在明顯的種族和地理差異。

從目前報(bào)道的病例中我們發(fā)現(xiàn)，PD往往是孤立的癥狀，合并其它肢體器官畸形較少見。贅指雖多數(shù)沒有功能或功能受限，但卻嚴(yán)重影響相鄰健指的功能及形態(tài)。另一方面，PD 患兒常因此被同齡人孤立，長(zhǎng)期以往容易形成內(nèi)向自卑性格，影響與人交往，甚至影響戀愛、工作及婚姻。目前我國(guó)產(chǎn)前診斷技術(shù)尚不成熟，盡管超聲檢查具有無創(chuàng)、快速等特點(diǎn)，但 PD 的產(chǎn)前診斷受儀器的分辨率以及切面定位、胎兒宮內(nèi)姿勢(shì)以及超聲檢查人員水平的限制，診斷率僅能達(dá)到 60%-70%。

目前多指的治療主要以手術(shù)切除為主，部分復(fù)雜類型尚需截骨及肌腱移位等功能重建，平均住院手術(shù)及后繼治療費(fèi)用約 4500 元/例。而龐大的患者人群，將會(huì)對(duì)家庭及社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。若能在多指的基因診斷上取得突破，可以做出早期產(chǎn)前診斷，將能節(jié)省很大的醫(yī)療資源及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道，GLI3基因（NM_000168）多個(gè)位點(diǎn)的突變與多指畸形密切相關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)在多指畸形患者的DNA中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)GLI3基因的新突變，編碼區(qū)4507位堿基由C突變成T，在正常人群中未檢測(cè)到該突變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的PCR引物、探針及熒光定量PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的PCR引物，包括用于擴(kuò)增GLI3基因基因多態(tài)位點(diǎn)的1對(duì)共2條引物，2條引物的序列分別為：

Ltbp1F：5'- GTGACAAGCACAGTGGACAGC -3'

Ltbp1R：5'-GCCCTGAGCCCAAGTATCTTC-3'。

一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的探針，包括用于檢測(cè)GLI3基因基因多態(tài)位點(diǎn)的2條探針，每一條探針包含13-25個(gè)堿基的序列，其5’端具有熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端具有MGB基團(tuán)標(biāo)記。

優(yōu)選的，所述2條探針的序列分別為：

Ltbp1G：5'-VIC-AGGGGTATAGATTGACTTCG-MGB-3'

Ltbp1C：5'-FAM-AGGGGTACAGATTGACTTC-MGB-3'。

一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的試劑盒，包括上述所述的PCR引物和上述所述的探針。

一種用于非治療目的檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟：

（1）提取模板DNA：從病人的血液中提取模板DNA；

（2）配制PCR反應(yīng)液：設(shè)計(jì)引物和探針，配制25μL/人份的PCR反應(yīng)液；

（3）PCR擴(kuò)增：將上述PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

優(yōu)選的，所述步驟（2）中，每人份的PCR反應(yīng)液中各成份及濃度分別為：2條引物濃度分別為0.1μmol/L、2條探針濃度分別為0.2μmol/L、Taq酶濃度為0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2濃度為1.5mmol/L、dNTP濃度分別為0.2mmol/L each、模板DNA濃度為1-10ng/μL。

優(yōu)選的，所述步驟（3）中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒，循環(huán)35次；72℃再延伸5分鐘。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的PCR引物特異性好；本發(fā)明的探針特異性好，檢測(cè)靈敏精確；本發(fā)明的試劑盒可以檢測(cè)多指畸形GLI3基因多態(tài)性，準(zhǔn)確性好，靈敏度高。本發(fā)明的熒光定量PCR檢測(cè)方法可以檢測(cè)多指畸形GLI3基因多態(tài)性，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，步驟簡(jiǎn)單，操作控制方便，檢測(cè)效率高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明檢測(cè)多指畸形GLI3基因多態(tài)性樣本結(jié)果示例，其基因型為：Ltbp1GG純合子；

圖2是本發(fā)明檢測(cè)多指畸形GLI3基因多態(tài)性樣本結(jié)果示例，其基因型為：Ltbp1CC純合子；

圖3是本發(fā)明檢測(cè)多指畸形GLI3基因多態(tài)性樣本結(jié)果示例，其基因型為：Ltbp1GC雜合子。

具體實(shí)施方式

為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實(shí)施例及附圖1-3對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施方式提及的內(nèi)容并非對(duì)本發(fā)明的限定。

一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的PCR引物，包括用于擴(kuò)增GLI3基因基因多態(tài)位點(diǎn)的1對(duì)共2條引物，2條引物的序列分別為：

Ltbp1F：5'- GTGACAAGCACAGTGGACAGC -3'

Ltbp1R：5'-GCCCTGAGCCCAAGTATCTTC-3'。

一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的探針，包括用于檢測(cè)GLI3基因基因多態(tài)位點(diǎn)的2條探針，每一條探針包含13-25個(gè)堿基的序列，其5’端具有熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端具有MGB基團(tuán)標(biāo)記。

所述2條探針的序列分別為：

Ltbp1G：5'-VIC-AGGGGTATAGATTGACTTCG-MGB-3'

Ltbp1C：5'-FAM-AGGGGTACAGATTGACTTC-MGB-3'。

一種檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的試劑盒，包括上述所述的PCR引物和上述所述的探針。

一種用于非治療目的檢測(cè)多指畸形GLI3基因突變的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟：

（1）提取模板DNA：從病人的血液中提取模板DNA；

（2）配制PCR反應(yīng)液：設(shè)計(jì)引物和探針，配制25μL/人份的PCR反應(yīng)液，每人份的PCR反應(yīng)液中各成份及濃度分別為：2條引物濃度分別為0.1μmol/L、2條探針濃度分別為0.2μmol/L、Taq酶濃度為0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2濃度為1.5mmol/L、dNTP濃度分別為0.2mmol/L each、模板DNA濃度為1-10ng/μL；

（3）PCR擴(kuò)增：將上述PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒，循環(huán)35次；72℃再延伸5分鐘。

如圖1-3所示，若結(jié)果中只能看到某一條擴(kuò)增曲線，則表明該樣本為該條探針?biāo)淼募兒献樱蝗艚Y(jié)果中有兩條擴(kuò)增曲線，則表明該樣本為這兩條探針?biāo)淼碾s合子。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。