本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種用于肝癌診療的生物標(biāo)志物，具體的涉及生物標(biāo)志物L(fēng)INC00511。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是成人肝臟惡性腫瘤中最常見的疾病，雖然肝癌的治療技術(shù)不斷提升，如手術(shù)切除、肝移植、放化療，但肝癌患者總體5年生存率至今仍未明顯改善。肝癌病死率高、預(yù)后差的重要原因之一就是肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制目前仍然知之甚少。然而，隨著現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)展，現(xiàn)已證明肝癌的形成多伴隨一系列分子及信號(hào)通路的異常。因此，從分子水平探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并將特征性分子作為抗腫瘤靶點(diǎn)，可為臨床預(yù)防和治療肝癌開辟新的途徑。

隨著微陣列技術(shù)和核酸測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人類基因組中僅有2％的序列編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)，蛋白編碼基因數(shù)目不足3萬個(gè)，而其余的近98％的基因組序列卻轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了大量且種類繁多的非編碼RNA，這些ncRNA是機(jī)體內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類能在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用的大分子ncRNA。其分布廣泛，長度一般多于200個(gè)堿基，由于缺少有效開放閱讀框(ORF)而無或很少有編碼蛋白的能力。作為分子生物學(xué)中的一個(gè)全新領(lǐng)域，lncRNA是以RNA的形式在多個(gè)層面上發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用，主要是在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控三個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控。作為哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組的重要組成部分，lncRNA的功能目前還有待深入研究。最初lncRNA被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”、“暗物質(zhì)”，不具有生物功能。但近年來的研究結(jié)果顯示，lncRNA在細(xì)胞正常生理活性中的重要作用以及參與到多種腫瘤和其他疾病的發(fā)生發(fā)展。lncRNA不僅參與到核內(nèi)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白降解、基因組印記及X染色體沉默等細(xì)胞生理活動(dòng)中，還與乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、淋巴性白血病等疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。lncRNA可通過基因印記、染色質(zhì)重構(gòu)、剪切調(diào)控、mRNA降解和翻譯調(diào)控等機(jī)制來實(shí)施其功能。雖然了lncRNA相關(guān)研究近年來取得了進(jìn)展，但其功能及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。研究lncRNA主要方法和工具包括芯片、RNA測(cè)序、實(shí)時(shí)定量PCR,Northern blotting、原位雜交、RNAi，RIP和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)等。研究技術(shù)的開發(fā)和利用對(duì)于生物學(xué)機(jī)制的研究是非常關(guān)鍵的。

lncRNA廣泛存在于多種組織中，其表達(dá)具有組織特異性和時(shí)空特異性。組織特異性是指不同組織之間的lncRNA表達(dá)量不同；時(shí)空特異性是指在相同的組織或器官的不同發(fā)育階段，其中的lncRNA表達(dá)量也會(huì)變化。有人對(duì)小鼠腦部的1,300個(gè)lncRNA的表達(dá)特異性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在組織發(fā)育過程中腦組織的不同部位具有不同的表達(dá)模式，進(jìn)一步證明lncRNA表達(dá)的時(shí)空特異性。同時(shí)，lncRNA在腫瘤和其他疾病中也具有特異性的表達(dá)模式。目前針對(duì)lncRNA在癌癥領(lǐng)域中的研究仍處在起步階段，探尋lncRNA在肝癌中的作用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種診斷早期肝癌的產(chǎn)品，使患者在早期就得以治療，進(jìn)而提高生存率和生活質(zhì)量。

本發(fā)明的目的之二，提供一種分子標(biāo)志物，作為臨床應(yīng)用的檢測(cè)或治療指標(biāo)。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和藥物組合物，實(shí)現(xiàn)肝癌的精準(zhǔn)分子治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種LINC00511基因的用途，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述LINC00511在肝癌患者中表達(dá)上調(diào)。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品能夠通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、原位雜交、northern blotting、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)LINC00511的表達(dá)水平。

其中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增LINC00511基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增LINC00511基因的引物；所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括：與LINC00511基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與LINC00511基因的核酸序列雜交的探針。

進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異性擴(kuò)增LINC00511基因的引物，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中所述引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本發(fā)明提供了一種診斷肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測(cè)樣本中LINC00511的表達(dá)水平來診斷肝癌。所述“樣本”包括(但不限于)細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑或試劑盒；其中，所述芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)LINC00511轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)LINC00511的寡核苷酸探針；所述試劑盒包括用于檢測(cè)LINC00511轉(zhuǎn)錄水平的引物或芯片。

固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

所述探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注冊(cè)商標(biāo)，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交聯(lián)化核酸)、ENA(注冊(cè)商標(biāo)，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發(fā)明中基因檢測(cè)試劑盒或基因芯片可用于檢測(cè)包括LINC00511基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與肝癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平，將肝癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高肝癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了一種LINC00511基因的用途，用于制備預(yù)防或治療肝癌的藥物組合物。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括LINC00511功能性表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑能夠抑制LINC00511或涉及LINC00511上游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)。

進(jìn)一步，所述抑制劑是針對(duì)LINC00511的siRNA。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括LINC00511功能性表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑可以在DNA水平或RNA(即基因產(chǎn)物)水平上起作用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括與LINC00511功能性表達(dá)的抑制劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

進(jìn)一步，所述載體包括(但并不限于)：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本發(fā)明提供了一種LINC00511基因的用途，用于篩選預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。

進(jìn)一步，篩選預(yù)防或治療肝癌潛在物質(zhì)的步驟包括：

候選物質(zhì)處理表達(dá)或含有LINC00511基因的體系；和

檢測(cè)所述體系中LINC00511基因的表達(dá)；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低LINC00511基因的表達(dá)或活性(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上，更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。

進(jìn)一步，上面所述的體系包括(但不限于)：細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。

在本發(fā)明中，siRNA可以包括部分純化的RNA、相當(dāng)純的RNA、合成的RNA、或重組產(chǎn)生的RNA、以及通過添加、刪除、替換和/或改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸而與天然存在的RNA不同的經(jīng)改變了的RNA。這樣的改變可以包括添加非核苷酸材料至例如siRNA的末端(一個(gè)或多個(gè))或至siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸，包括使siRNA抵抗核酸酶消化的修飾。

本發(fā)明在篩選有效的siRNA序列時(shí)，通過大量的比對(duì)分析，從而找出最佳的有效片段。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了多種siRNA序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果檢測(cè)出干擾效果較好的干擾分子，它們分別具有SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示的序列，進(jìn)一步地在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)而言抑制效率非常高。

本發(fā)明的核酸抑制物如siRNA可以化學(xué)合成，也可以通過一個(gè)重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA之后進(jìn)行制備。siRNA等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。

在本發(fā)明中，藥物組合物可以使用不同的添加劑進(jìn)行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。

緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應(yīng)的鹽(它們的堿金屬或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽)。等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如<1％w/v)的芐醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯。穩(wěn)定劑包括人類血清蛋白、L-氨基酸、糖及纖維素衍生物。L-氨基酸還可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個(gè)。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羥甲基纖維素鈉。表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單?；ァ⒅舅岣视王?。

本發(fā)明的藥物還可包括藥學(xué)上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。常見快速分解涂層材料包括OPADRY；腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)烯酸聚合物、磷羥丙甲基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維素、乙酰磷苯二甲酸纖維素；增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本發(fā)明所述的藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明的藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的pH以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對(duì)于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米淀粉。當(dāng)口服施用水懸浮液和/或乳液時(shí)，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當(dāng)時(shí)，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于降低內(nèi)源性的LINC00511過表達(dá)，通過降低LINC00511的表達(dá)，從而治療因LINC00511表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的肝癌。

在本發(fā)明中，可將抑制LINC00511表達(dá)的化合物作為裸RNA與遞送試劑一起作為核酸(如重組質(zhì)粒或病毒載體)給受試者施用，所述核酸包含抑制LINC00511表達(dá)的序列。遞送試劑可以是親脂試劑、聚陽離子、脂質(zhì)體等。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體可以增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)(其通常包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體。通常，通過考慮入目的脂質(zhì)體的大小和血流中直追半衰期等因素，指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。

用于本方法的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向細(xì)胞的配體分子。結(jié)合癌細(xì)胞中普遍存在的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。還可對(duì)用于本發(fā)明的脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。此類修飾的脂質(zhì)體具有存在于表面上或整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的調(diào)理作用抑制部分。優(yōu)選的，脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用抑制部分和配體兩者。

本發(fā)明藥物組合物可以局部給藥的藥物組合物，可以配制成軟膏、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。在人類中，該基因具有17個(gè)注釋轉(zhuǎn)錄本(或剪接變體)：長2265bp的LINC00511-018(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000581549.1)、長1716bp的LINC00511-002(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000453722.6)、長1696bp的LINC00511-009(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000457958.6)、長908bp的LINC00511-011(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000578206.1)、長757bp的LINC00511-013(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000583460.1)、長657bp的LINC00511-016(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000581183.1)、長561bp的LINC00511-005(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000580500.5)、長538bp的LINC00511-007(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000577828.5)、長536bp的LINC00511-017(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000580199.5)、長520bp的LINC00511-012(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000577773.1)、長475bp的LINC00511-010(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000580948.1)、長467bp的LINC00511-003(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000580861.1)、長436bp的LINC00511-004(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000580175.1)、長391bp的LINC00511-006(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000584749.1)、長379bp的LINC00511-014(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000581801.5)、長355bp的LINC00511-015(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000579631.1)、長141bp的LINC00511-008(Ensembl中的轉(zhuǎn)錄本ID為ENST00000582712.1)。在具體的實(shí)施方案中，LINC00511基因產(chǎn)物指長轉(zhuǎn)錄物。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)志物基因可具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3指定的cDNA序列。在一些實(shí)施方案中，其具有與所列的序列至少70％相同或相似的cDNA序列，諸如上述所列的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

在本發(fā)明中，關(guān)于LINC00511的“功能性表達(dá)”，意指功能性基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。對(duì)于像LINC00511的非蛋白編碼基因，“功能性表達(dá)”可以在至少兩個(gè)水平上失調(diào)。第一，在DNA水平上，例如通過基因的缺失或破壞，或者是沒有轉(zhuǎn)錄發(fā)生(在兩種情況下都阻止相關(guān)基因產(chǎn)物的合成)。轉(zhuǎn)錄的缺失可以例如由表觀遺傳的變化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突變導(dǎo)致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突變是，相對(duì)于賦予蛋白質(zhì)增強(qiáng)的或新的活性的功能獲得性突變而言，阻止、減少或消除基因產(chǎn)物的功能的突變。功能性缺失可由廣泛的突變類型引起，包括但不限于整個(gè)基因或基因部分的刪除、剪接位點(diǎn)突變、由小的插入和刪除引起的移碼突變、無義突變、取代了必需氨基酸的錯(cuò)義突變、和阻止產(chǎn)物的正確細(xì)胞定位的突變。該定義也包括LINC00511基因的啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)域的突變——如果這些突變干擾了基因的功能。無效突變是完全破壞基因產(chǎn)物功能的LOF突變。一個(gè)等位基因中的無效突變通常將使表達(dá)水平降低50％，但可能對(duì)基因產(chǎn)物的功能具有嚴(yán)重影響。值得注意的是，功能性表達(dá)也可以因?yàn)楣δ塬@得性突變而失調(diào)：通過賦予蛋白質(zhì)新的活性，蛋白質(zhì)的正常功能失調(diào)，表達(dá)的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達(dá)可以例如通過基因復(fù)制或通過缺乏DNA甲基化而增加。功能性表達(dá)也可以因?yàn)楣δ塬@得性突變而失調(diào)：通過賦予蛋白質(zhì)新的活性，蛋白質(zhì)的正常功能失調(diào)，表達(dá)的功能活性蛋白減少。反之亦然，功能性表達(dá)可以例如通過基因復(fù)制或通過缺乏DNA甲基化而增加。

第二，在RNA水平上，例如通過缺乏有效的翻譯—例如因?yàn)閙RNA的不穩(wěn)定(例如通過UTR變體)，可以導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄物翻譯之前mRNA被降解?；蛘咄ㄟ^缺乏有效的轉(zhuǎn)錄，例如因?yàn)橥蛔冋T導(dǎo)了新的剪接變體。

本發(fā)明的藥物組合物可以按藥劑學(xué)上有效的量進(jìn)行給藥，本發(fā)明的用語“藥劑學(xué)上有效的量”指的是以可適用于醫(yī)學(xué)治療或預(yù)防的合理的受惠/危險(xiǎn)比率足以治療或預(yù)防疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴(yán)重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對(duì)藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時(shí)間、給藥途徑及排出比率、治療時(shí)間、與所使用的本發(fā)明的組合物配合或同時(shí)使用的藥物的要素及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的要素來決定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨(dú)的治療劑進(jìn)行給藥，或是與其它治療劑并用地進(jìn)行給藥，可以與以往的治療劑依次地或同時(shí)地進(jìn)行給藥。此外，可單次或多次地進(jìn)行給藥。重要的是，需要對(duì)上述要素均加以考慮，并且以無副作用的最少的量可取得最大效果的量進(jìn)行給藥。

術(shù)語“治療”是指不以治愈為目的，而是減緩(減少)靶定的病理狀況或病癥或防止復(fù)發(fā)。如果接受治療有效量的治療劑之后，患者成功地被“治療”，患者顯示出可觀測(cè)到的和/或可度量的一種或多種特定疾病的跡象和癥狀的減少或消失。例如，癌細(xì)胞數(shù)目顯著減少或癌細(xì)胞消失，減少腫瘤尺寸；抑制(即，在某種程度上減緩，及優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度上抑制腫瘤生長；使在一定程度上減少和/或減輕與特定癌癥相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀的時(shí)間增加；減少的發(fā)病率和死亡率，以及改善生活質(zhì)量。疾病的跡象或癥狀的減輕能夠?yàn)榛颊吒兄?。治療可以?shí)現(xiàn)完全反應(yīng)—定義為癌癥的所有跡象消失，或部分反應(yīng)—腫瘤尺寸減小，優(yōu)選減小的比例超過50％、更優(yōu)選75％。如果患者感受到疾病穩(wěn)定，患者也被視為得到治療。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA，通過檢測(cè)該lncRNA的表達(dá)水平即可對(duì)早期肝癌進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)早期肝癌患者進(jìn)行治療，提高患者的生存質(zhì)量。

本發(fā)明提供了一種精準(zhǔn)醫(yī)療手段，通過抑制患者中LINC00511的表達(dá)水平，從而治療肝癌患者。

本發(fā)明提供了一種肝癌的治療藥物，該藥物可以治療LINC00511過表達(dá)導(dǎo)致的肝癌。

附圖說明

圖1示利用QPCR檢測(cè)LINC00511在肝癌患者中的表達(dá)情況圖；

圖2示利用QPCR檢測(cè)LINC00511在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況圖；

圖3是利用QPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)在肝癌細(xì)胞中LINC00511的表達(dá)影響圖；

圖4是利用CCK8檢測(cè)LINC00511對(duì)細(xì)胞增殖的影響圖；

圖5示LINC00511對(duì)細(xì)胞的克隆形成集落的影響圖。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與肝癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會(huì)的同意。

2、RNA樣品的制備

利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行組織RNA的提取，按說明書的具體步驟進(jìn)行操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用Cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用說明書的步驟進(jìn)行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與癌旁組織相比，LINC00511在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。

實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證LINC00511基因的差異表達(dá)

1、對(duì)LINC00511基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式收集肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、RNA提取步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)QPCR擴(kuò)增檢驗(yàn)

引物設(shè)計(jì)：

LINC00511基因的引物序列為：

正向引物：5’-GCTCAAGTTCCTGACATAA-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-GCGTTGTGTTAGGCATTA-3’(SEQ ID NO.5)

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.6)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.7)

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系 12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，無酶水8.5μl。各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，LINC00511基因在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3 LINC00511基因在肝癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7和正常肝細(xì)胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、RNA的提取

1)當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol緩慢搖動(dòng)破碎細(xì)胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每個(gè)1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中RNA提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常肝細(xì)胞系相比，LINC00511基因在肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7中表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例4 LINC00511基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、siRNA設(shè)計(jì)

針對(duì)LINC00511基因的siRNA序列：

陰性對(duì)照siRNA序列(siRNA-NC)：

正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.8)，

反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.9)；

siRNA1-LINC00511：

正義鏈為5’-AAAGAGAAGACUCAGAUUCAA-3’(SEQ ID NO.10)，

反義鏈為5’-GAAUCUGAGUCUUCUCUUUCU-3’(SEQ ID NO.11)；

siRNA2-LINC00511：

正義鏈為5’-AUAACUCAAAAACAAACAGUC-3’(SEQ ID NO.12)，

反義鏈為5’-CUGUUUGUUUUUGAGUUAUUU-3’(SEQ ID NO.13)；

siRNA3-LINC00511：

正義鏈為5’-AAUUAGCAAGUCAAAACCCCC-3’(SEQ ID NO.14)，

反義鏈為5’-GGGUUUUGACUUGCUAAUUUA-3’(SEQ ID NO.15)

將細(xì)胞按2×10⁵/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h；

在無雙抗、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于Invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(HepG2)陰性對(duì)照組(siRNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組(20nM)(siRNA1-LINC00511、siRNA2-LINC00511、siRNA3-LINC00511)，其中陰性對(duì)照組siRNA與LINC00511基因的序列無同源性，濃度為20nM/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3、QPCR檢測(cè)LINC00511基因的轉(zhuǎn)錄水平

3.1細(xì)胞總RNA的提取

具體步驟同實(shí)施例3。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

3.3QPCR擴(kuò)增 步驟同實(shí)施例2。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾LINC00511基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，相比HepG2、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA1-LINC00511、siRNA3-LINC00511組，siRNA2-LINC00511組能夠顯著降低LINC00511的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)施例5 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 步驟同實(shí)施例4

2、CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

1)將對(duì)數(shù)增殖期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×10³個(gè)細(xì)胞；

2)實(shí)驗(yàn)分三組，分別是空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染siRNA-NC組和轉(zhuǎn)染siRNA2-LINC00511，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；

3)分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔CCK8試劑；

4)2h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450的吸光值。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

圖4所示的結(jié)果顯示：空白對(duì)照組同空載組無明顯差異，而轉(zhuǎn)染siRNA2-LINC00511組的細(xì)胞生長速度明顯低對(duì)照組的細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明LINC00511的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。

實(shí)施例6軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10³個(gè)/ml。

3、制備兩個(gè)濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于CO₂溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個(gè)/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)4個(gè)樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO₂溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。

7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA2-LINC00511的細(xì)胞組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 王冬國

<120> 一種用于肝癌診療的生物標(biāo)志物

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

aaggggcgat gcgccccgga gggggaggga cgcaaggggc gactactgtt acctcgcttg 60

gagataccaa ggccggtcgg accccccgct ggccgaatgt ggggagcgag cagatccagc 120

ctgtttggac gtggtgagga cccagccgtg gggtttaagg ccaagttagc ctctcccttc 180

actgattaca agagccattg ttacaggtgc tcacatgcca ggagaaataa gctggtgatt 240

tatgtggcac agcaccatcg atcgacctac aaaggaagct tcagtgcagc cgtgttgcta 300

tacagacctc tctcaccaag gcgtcatgaa ctgaagggct gggagaggcc tcgtggagga 360

ggaagagttt cgctcagctg cttgggtgtg ggactgaatg tggttccaga actggtcgct 420

gccttcaccc gctgactctg gtctcggcga tgacaagccc atggaacaga cttacggcgt 480

atgacctcat cggagacttg tacatggggc caacccccat tttcccacag gaaacccaca 540

ctctaattaa gggctgaccc tgaacttgaa tctgagtctt ctctttcttc aacagagagc 600

catctctcca gcccagctgg caaggagaca ggtgatgtta caggaaaaaa tacacagctt 660

gtgcccttgg aattaccaga gttcaaagcc tgttcagcat ctacccacca tgtgacccgg 720

gtcgaattct tcagtttctc taagcccatt ttctcatctg taagatgggg aagtgtaatc 780

agttctgaac ccacatatac ctcactgggc ttgaacaggc ctgagcaggc atgtggggct 840

ttactagcta gccatccttt ctgccgctct ccctcattct ccttcaagcc ccccaaagtc 900

cttggtggag gaggaagtgg agacagaacg tttggtgttg ggtgaggtac gtgaggaggc 960

tgatttcaga acctccagga aacaaagctt tagtgttccg agggcagtgc ccgcctgtgc 1020

ctcctcctca cagggggtag taggagtggg gtggggccga ggcatttccc agcacagctc 1080

aatcacatct cctgcgcctg cccttgtgac ctgctcactg gaaaggaaga aatgaccgag 1140

ggagaaggga gggcatttga ggggagaaga agaggatgga gaaaaaaact ggatcatctc 1200

gtgacatgga aagaaaggtc tgagctctga cgatcccctc acgtgattat aggcatgagg 1260

actcactctt cgaattgttt gaaaattgaa tggactggct cacaccttct gaaatttctt 1320

ggaagctctg gagtaactat tccactaaag aacagcgtgt ttttggctga aatctgtgac 1380

tgtttgtttt tgagttattt taatctctgt gtcaagcatg aaaacctcag cagcctggga 1440

tttataatta gatcccactg gcatgccctc tcacctctca aacatgccac agtgctttgg 1500

ctctctcctt gtgcaaacct ccctttgata tttttggata tcgataccaa gtgtatctgc 1560

atattttaac caactgatat gcatatcctg tgatctgagg cattcgctca atgtggggca 1620

tcaggccagc tgtgaacttc ctttaaaatt tattttgtgt caaatgattc cctaatgcta 1680

tagctccctt gaactgctag atttatgaaa attctgcaca acacatagct cagagaaaaa 1740

aaaaaaagag tgttgcaaga ccagatatag gatatcattt gatttgttta aaacactctg 1800

tccagggggt tttgacttgc taatttaaaa ataattctaa aattaggtac agttgaccct 1860

tagtatccat gggggattgg ttccaggatg ccctgtggat accagaatcc aaggatgctc 1920

aagttcctga cataaatggc ttagtgtttg catataacct actcccctct tcctatatac 1980

tttaaataat ctctagatta cttataatgc ctaacacaac gcctgtgcat cacttcattc 2040

atgtggattc aatgtagtac ttggtgtgaa gaaaatttaa gtcttgcttt ttggaacttt 2100

gtggattttt ttttctggaa tgtttttgat ctgcagttgg ttgaatccac aggtgcagaa 2160

ctatggacac agggggctga ctatgtatat ttatatccac ttgcaaaatt aagaataaaa 2220

ataatgtgca tcagcaggtg cagattctga tgctcggtgg acagt 2265

<210> 2

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

agggcgcgca ggcggcgcgg gtgcgcggtg cggcgctggt atccagagga cgcggtcacc 60

gcctctggca tttgtcgttc tgcgcttctc cgcaaggacc ctctgttagg caggcgccca 120

ccgtaagcct cccgggcctt gtgaacctgc aaacccaagt ctgagagacg atccgccttc 180

agcgctttcc agcttggcag agaggctttc ccggcgggga tctttggttg gcgctggcga 240

tgcgcgggga agaaaggcga ggagcggcgt ccaggctggg tgatgtccca gcacgagtag 300

gcgggatgcg ctcgcttggt cctccgggcg cccggtccct gcccgcgtcg cgcgcccacc 360

cctggggacg agaaggcggc cgcctgagga cccccgcccg cgacctccgc gagtctggag 420

cgcagaggac agggtctggc tgctctttgg ccttggatgg aaagtgggga attgggtggg 480

gggctgcgga ccccttaacg tggattactt ggtgtgtatc agctgggctc agaagaccca 540

cgacctcttc tccatccgtg gattgatttg ttctgcttaa cagctgggtc gccaagctgg 600

aggtattttt ccctctccac cctggtcttc tcctgtaacg tgtggccgcc ttttccagca 660

cggcctcctg ccttcctggt gcactttttg gagaacgtgg tggaatcaga ggtttctggc 720

tgactcggtg ggtgctttga accaggaaag gacaagaaag aggttggagt acagtggcat 780

gatctcagct cactgcagcc tcgacttcct gggctcaaga aatcctcctg tctctgcctt 840

ccgagtagct gtgatcacag ttgtatgcca tcatgcccag accagatttc gccatattgc 900

tcaggatggt cttgaactcc tgggctcaag tgatccgcct gccttggcct cccagaatgc 960

caggattaca gatgtgagcc actgtgcctg gcctgaagtc tagtaatttt taaaactttg 1020

catgttattc tgctcatgag ccaagttcgg gtgcctgtgg aacagctata ttcctcaaac 1080

tagatatgca ccccagtccc tggggattct gtcaaaaggc agattcacat tcagcaggtc 1140

tagggtgggg ggcctgacat tcggcacgtc tcacaagctc ccaggcgatg ctgatggtgc 1200

tggtccctgg acgccctctt gagtagtaag gaacaaaagg actctcccct gttcttttca 1260

gctacgtagc ccagtggttc tccacttagg cttcacactg gaatcatcca gggagtttta 1320

aactatagtg atgcctggcg gtgtcttact cgcagagctt ctggtttgat tggtctaggt 1380

tgcagcctgg gcaaggagat ttaaaaactt ctcagatggg ccaggcatgg tggctcaagc 1440

ctgtaatccc agcactttgg gaggcagagg tgggcggatc acgaggtcag gagatcgaga 1500

ccatcctggc tagcacggcg aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaaa ttagctgggt 1560

gtggtggcgt gtgcctgtgg tcccagctgc tcgggaggct gaggcagaag aatggcctga 1620

acccgggagg cggagcttgc agacagccga tcgtgccact gcactccagc ctgggcgaca 1680

gagcgagact ccgtctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1716

<210> 3

<211> 1696

<212> DNA

<213> 人源

<400> 3

tggggaattg ggtggggggc tgcggacccc ttaacgtgga ttacttggtg tgtatcagct 60

gggctcagaa gacccacgac ctcttctcca tccgtggatt gatttgttct gcttaacagc 120

tgggtcgcca agctggaggt ggaatcagag gtttctggct gactcggtgg gtgctttgaa 180

ccaggaaagg acaagaaaga ggatgggaag gactgatcca cattcccacc aggaagttta 240

gcagaacccc cgcgtgccac ctggacccct tggaaggacc tggctcaggc tggaccacct 300

cttgagaggc aggagctctg gatttgatca agaattcttt gctgagcatg gtgcctcatg 360

cctataatcc caacactttg ggaggccagt gtgggaggat ctcttgagcc caggagttca 420

agactagcct gggcaacaca gagagacccc atctctaaaa taataataat aataaaataa 480

aaaattagca gggcatggtg gcatgtgcct gtagtcccag ctacccagga ggctgaggca 540

agaggatggc tggagcctgg gatgttgagg ctgcaatgaa ctgtgattac cccactgcac 600

tccagcctgg gcaaaagagc gagagaccct gtctcaaata ataataataa taataatctt 660

attttggaga ataaagagac ctctggattt gaggtgccat ttgggtagaa agaaaagacg 720

tttacaccga gaaatagtct gtgttgccct gaaggagcag agggatgcat cgctggaggt 780

gacctacagt tgaagaagac tcattatgac agaccttgtc cttcttcctt gtggaaagtg 840

tttcctctgc tgctactgct catgagactc ttccccctcc ctgtcccagg gaaccaaagg 900

gctttctacc acaccctttc ttgccccccg cctcccatgt ctgctgtgcc tttgtactca 960

gcaattcttg tttgctccat tatcttccag ccggatacag agtgaatagt taaccacact 1020

taggtcaaat aggatctaaa tttttgttcc tgctccgtgt aaagaggcca gtgtttgtgt 1080

gttgcaagca gccttggaat agtaactctt ctcatttgtt tgggatctgg ccaccaagtt 1140

ccagaatgat acacggatca gtgcagaagt tcatcaggct ctcggacctt agggctgttg 1200

gagaaggctt cagcagcaga actgatggtg aaggctcgtg ttctccatcc tcaactttct 1260

ttgcttcgat catacacaag aatacatttg gaagggcaaa aaatgaacac tgtcgttcat 1320

tgcagccgtg ttttgtgaca cagatgcaca gtctgctgtg aagaccttct ctcaagtggc 1380

atttgggagt ccatgccaga tcatggtgct tcatgagaga ctgacagcta tcaggggttg 1440

tggcacttag tgaggactct cctcccccag tgtgtgctga tgacacatac acacctgaca 1500

atagcttgag tcttctctgt tccttttact ctgtagccaa catacacatg atttaaaacc 1560

ctttctaaat atctatcatg gttcatcctt gtccaaatgc agagtcagag ctatttgtac 1620

ttcattatta tttccaaggc gaatagttgg ctttcttttt gcaaaaataa ttaaagtttt 1680

tgtatgttgc agttgc 1696

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctcaagttc ctgacataa 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgttgtgtt aggcatta 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaagagaaga cucagauuca a 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaucugagu cuucucuuuc u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

auaacucaaa aacaaacagu c 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

cuguuuguuu uugaguuauu u 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

aauuagcaag ucaaaacccc c 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggguuuugac uugcuaauuu a 21