技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于前列腺癌治療與診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于對(duì)前列腺癌化療效果和耐藥性評(píng)估的基因聯(lián)合標(biāo)志物，以及由該聯(lián)合標(biāo)志物制備得到的檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率顯著升高。與西方國(guó)家前列腺癌患者分期構(gòu)成不同，我國(guó)近70%的前列腺癌患者初診時(shí)就已是晚期轉(zhuǎn)移患者。雖然絕大多數(shù)患者對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，但幾乎所有患者在治療18個(gè)月后會(huì)進(jìn)展至激素抵抗性前列腺癌(HRPC)，患者生存期一般不超過(guò)2年。2004年TAX327和SWOC-9916兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，多西他賽為基礎(chǔ)的化療較米托蒽醌能顯著延長(zhǎng)HRPC患者的總體生存期，一舉奠定了其作為HRPC一線(xiàn)治療藥物的地位。但是，在臨床上仍然有患者出現(xiàn)多西他塞治療效果不佳的問(wèn)題，因此，預(yù)先對(duì)與多西他塞治療耐藥相關(guān)情況進(jìn)行評(píng)估具有重要意義。

miRNA是新近證明的一類(lèi)高度保守的、內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)通路，包括生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等一系列重要的生命調(diào)節(jié)過(guò)程。已發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)異常可能導(dǎo)致人類(lèi)多種疾病，如癌癥、自身免疫性疾病及腎臟疾病等。研究顯示miRNA參與調(diào)控人體細(xì)胞中細(xì)胞代謝、增值、分化、凋亡、免疫等過(guò)程；它的異常表達(dá)在疾病的發(fā)生發(fā)展中起了關(guān)鍵性作用。研究顯示miRNA在病理發(fā)展中會(huì)快速?gòu)慕M織中釋放入血，在血清、血漿、唾液和尿液中，這些胞外miRNA與腫瘤的不同病理狀態(tài)有關(guān)。Weber等釘檢測(cè)了12種來(lái)自于不同階段懷孕婦女和不同泌尿道上皮細(xì)胞腫瘤患者的體液和尿液標(biāo)本中的miRNA，應(yīng)用定量PCR對(duì)這些體液中的miRNA做廣譜分析。結(jié)果顯示miRNA在所有體液中均存在，在不同體液中

構(gòu)成比明顯不同，一些高水平的miRNA在多種體液中表達(dá)相同，而一些miRNA在特定體液中富集，還觀察到不同生理狀態(tài)的尿液標(biāo)本具有獨(dú)特的miRNA模式。提示使用特定miR-NA水平可用作檢測(cè)和監(jiān)測(cè)不同病理生理學(xué)狀態(tài)。

尿液中蘊(yùn)藏著大量生物學(xué)信息且具有無(wú)創(chuàng)收集、標(biāo)本處理相對(duì)簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)尿液中RNA類(lèi)的腫瘤標(biāo)志物還可以用于診斷其他泌尿系統(tǒng)的實(shí)體腫瘤，而且這類(lèi)循環(huán)miRNA的獨(dú)特表達(dá)模式與特定的疾病相關(guān)，特別是早期階段，其高特異性和敏感性的潛能可用于腫瘤分期和早期預(yù)測(cè)引。Bryant等使用含有742個(gè)miRNA的qRT-PCR芯片分析了78例前列腺癌患者和28例健康對(duì)照血清標(biāo)本，確定了12個(gè)表達(dá)量差異的miRNA。進(jìn)而檢測(cè)135份健康人與前列癌患者尿液標(biāo)本中5個(gè)選定的miRNA，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者尿液中miR-107和miR-574-3p水平顯著高于健康對(duì)照，均可診斷出前列腺癌患者，并且準(zhǔn)確性高于檢測(cè)尿液前列腺特異性抗原(PSA)。

利用miRNA對(duì)多西他賽治療HRPC耐藥性能進(jìn)行判斷目前尚無(wú)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了可以用于對(duì)前列腺癌化療過(guò)程中耐藥性進(jìn)行預(yù)評(píng)估的分子標(biāo)記物組合，該分子標(biāo)記物是由2個(gè)前列腺癌敏感基因(P53基因、GSTP1基因)和1個(gè)miRNA(miRNA-155)所組成，可以應(yīng)用于對(duì)化療耐藥性的評(píng)估；同時(shí)，本發(fā)明還提供了應(yīng)用于評(píng)估的引物組和試劑盒；本發(fā)明還提供了上述引物組和試劑盒在分子標(biāo)記表達(dá)量的聯(lián)合判別方程（聯(lián)合標(biāo)志物）中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)方面：

一種用于激素抵抗性前列腺癌化療耐藥效果評(píng)估的聯(lián)合標(biāo)記物，包括有P53基因、GSTP1基因和miRNA-155，以及內(nèi)參基因U6和GAPDH。

所述的化療是指多西他賽和潑尼松聯(lián)合治療。

本發(fā)明的第二個(gè)方面：

一種用于對(duì)上述聯(lián)合標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)的試劑。

所述的試劑，是用于對(duì)聯(lián)合標(biāo)記物的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)的試劑。

所述的試劑中包括有：

用于擴(kuò)增P53基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1～2所示；

用于擴(kuò)增GSTP1基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5～6所示；

用于miRNA-155反轉(zhuǎn)錄的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 34所示；

用于擴(kuò)增miRNA-155反轉(zhuǎn)錄cDNA的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 35～36所示；

用于擴(kuò)增內(nèi)參基因U6的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 37～38所示；

用于擴(kuò)增內(nèi)參基因GAPDH的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 39～40所示。

包括有上述試劑的試劑盒。

上述的試劑在制備激素抵抗性前列腺癌化療耐藥效果評(píng)估用試劑盒中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，是指評(píng)估以下算式F的值是否大于3.2：

F1=((- Ln(miR-155相對(duì)于U6的表達(dá)量))^-0.5+0.71)×(Ln(TP53相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量)+0.24)-0.52×Ln(GSTP1相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量)；

當(dāng)F的值大于3.2時(shí)，認(rèn)為存在耐藥風(fēng)險(xiǎn)。

有益效果

本發(fā)明提供了可以用于對(duì)前列腺癌化療過(guò)程中耐藥性進(jìn)行預(yù)評(píng)估的分子標(biāo)記物組合，該分子標(biāo)記物是由2個(gè)前列腺癌敏感基因(P53基因、GSTP1基因)和1個(gè)miRNA(miRNA-155)所組成，可以應(yīng)用于對(duì)化療耐藥性的評(píng)估；同時(shí)，本發(fā)明還提供了應(yīng)用于評(píng)估的引物組和試劑盒；本發(fā)明還提供了上述引物組和試劑盒在分子標(biāo)記表達(dá)量的聯(lián)合判別方程中的應(yīng)用。通過(guò)評(píng)估上述基因的相對(duì)表達(dá)量，可以較好地對(duì)多西他賽和潑尼松聯(lián)合治療前列腺癌中存在的耐藥性進(jìn)行評(píng)估。

附圖說(shuō)明

圖1是公式1作為聯(lián)合標(biāo)記進(jìn)行耐藥判斷的特異性和敏感性的ROC圖；

圖2是公式2作為聯(lián)合標(biāo)記進(jìn)行耐藥判斷的特異性和敏感性的ROC圖；

圖3是公式3作為聯(lián)合標(biāo)記進(jìn)行耐藥判斷的特異性和敏感性的ROC圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件( 例如參考J. 薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社) 或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

我們選擇了以下3個(gè)可能與前列腺癌相關(guān)的敏感基因以及10個(gè)與腫瘤發(fā)病相關(guān)的miRNA基因，對(duì)其與前列腺癌耐藥的相關(guān)性進(jìn)行分析?；蛉缦拢?/p>

使用熒光定量PCR對(duì)上述基因和miRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，首先通過(guò)尿沉渣中提取RNA，再轉(zhuǎn)錄為cDNA之后，進(jìn)行qPCR分析；采用的內(nèi)參基因?yàn)閁6和GAPDH，分別將基因和miRNA相對(duì)于它們的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，統(tǒng)計(jì)計(jì)算基因和miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

其中，對(duì)于上述3個(gè)基因的cDNA擴(kuò)增所采用的引物對(duì)如下：

其中，對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程采用環(huán)莖法，使用的反轉(zhuǎn)錄引物以及對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增使用的引物如下：

其中，對(duì)于內(nèi)參基因U6和GAPDH的擴(kuò)增引物序列如下：

實(shí)施例1 尿液中RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

l、取前列腺按摩后的前段尿液20～30ml，立即放入冰水中冷卻。于4℃、3000r/min下離心10min收集尿沉渣，加等量冷D-hanks液洗滌2次。

2、將尿沉渣收集至1.5ml Eppendorf管中，即加含酸性異硫氰酸胍的變性液500 μl混勻置-70℃保存。

3、按照經(jīng)典總RNA抽提試劑盒說(shuō)明提取總RNA后真空干燥，用15 μl DEPC水溶液。

4、取2 μlRNA溶液加98 μl水，混勻后在DU 800型紫外分光光度儀上測(cè)定吸光度A₂₆₀/A₂₈₀及RNA含量，RNA樣品完整性用1%甲醛變性凝膠電泳鑒定。

5、逆轉(zhuǎn)錄：

使用Promega GoScrip逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)提取的RNA樣本進(jìn)行目的相關(guān)基因、miRNA和內(nèi)參基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（其中，對(duì)于基因和內(nèi)參基因采用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)于miRNA采用上述的miRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Stem-loops) 逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄），具體操作參照使用說(shuō)明書(shū)，整個(gè)操作過(guò)程在冰上進(jìn)行。

具體步驟如下：

(1)根據(jù)所需樣本個(gè)數(shù)配制逆轉(zhuǎn)錄混合物(RT Master Mix)，每個(gè)樣本反應(yīng)體系中RT Mix總計(jì)6μL，如下所示：

(2)上下顛倒混勻并離心，按照每樣本6止將RT Master Mix分裝于200μL無(wú)酶EP管中。

(3)離心后每管加入所需樣本的RNA模板各4μL，總逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為l0μL，混勻后離心。

(4)設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：25℃ 5min→42℃1小時(shí)→70℃15min。逆轉(zhuǎn)錄完成后將合成的cDNA立即置于冰上冷卻，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

6、熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：100μl已稀釋的cDNA，1ml qPCR Master Mix (2×)，900μl ddH₂O 在混合成總體積為2ml的混合液，加20μl到PCR Array對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，PCR 擴(kuò)增:①將PCR反應(yīng)體系加熱至95℃進(jìn)行預(yù)變性，反應(yīng)5min，②在95℃下變性反應(yīng)15s后降溫至60℃退火反應(yīng)32s，并以72℃延伸反應(yīng)32s為一個(gè)循環(huán)，如此擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后建立熔解曲線(xiàn)并鑒定產(chǎn)物特異性，并記錄Cq值；其中，qPCR Master Mix的組成是Hot-start Taq DNA polymerase、dNTP Mixture、MgCl₂、SYBR Green、正向引物和反向引物；其中正反向引物總量分別是分別是2.5μM，體積為2μl。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

將從人前列腺癌細(xì)胞LNCaP細(xì)胞（上海研域生物科技有限公司購(gòu)得）中提取的miRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后10倍梯度稀釋成5個(gè)濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)品，同待測(cè)樣本一同進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

7、結(jié)果判斷

(1)拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算斜率S，然后根據(jù)公式E=10^（-1/S）-1，計(jì)算擴(kuò)增效率E；

(2)選中樣本和校對(duì)樣本檢測(cè)孔，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件得出樣本閾值Cq(T)和校對(duì)樣本閾值Cq(C)，根據(jù)公式Q=(E+1)^-△Cq，△Cq=[Cq(T)-Cq(C)]，得出基因的校正起始拷貝數(shù)Q；將各基因和miRNA的Q值與內(nèi)參基因的Q 值相比，可以得到各基因和miRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中各基因的表達(dá)量是相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，miRNA的表達(dá)量是相對(duì)于U6的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

樣本信息

選擇收治HRPC患者29例，年齡61～78歲，平均69.1±10.3歲，所有患者均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)為HRPC，其中21例患者曾行雙側(cè)睪丸切除術(shù)去勢(shì)治療，8例曾行藥物去勢(shì)治療，所有患者均至少使用過(guò)一種抗雄激素藥物治療。化療前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平為39.1～482.1μg/L，平均239.1μg/L，經(jīng)內(nèi)分泌治療過(guò)程中病情惡化，連續(xù)3次(間歇期至少2w)測(cè)得的血PSA水平升高，血清睪酮達(dá)去勢(shì)水平(<1.7nmol/L)，停止抗雄激素治療及二線(xiàn)抗雄激素藥物治療后，血PSA值仍不下降甚至上升。選擇健康者10名作為對(duì)照。

HRPC患者的治療方法：多西他賽(商品名奧名潤(rùn)，江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))75mg/m²，第1天靜脈滴注1～1.5h，化療前1d(d0)患者口服地塞米松，16mg/d，持續(xù)至少3d，以預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)和體液潴留。潑尼松5mg，口服，2次/d，從d1～d21連續(xù)服用21d為1個(gè)周期?；煹?天常規(guī)給予舒歐亭預(yù)防嘔吐反應(yīng)，當(dāng)白細(xì)胞(WBC)＜2.0×10⁹/L時(shí)酌情給予粒細(xì)胞集落刺激因子支持治療，若治療過(guò)程如出現(xiàn)腹瀉，給予易蒙停處理。用藥期間忌冷食冷飲，忌接觸冷物。

所有患者進(jìn)行至5個(gè)周期的化療后評(píng)價(jià)療效及毒副作用?；熐昂笮醒Ｒ?guī)、生化常規(guī)、PSA、心電圖、胸部X線(xiàn)片、全身骨掃描、特定部位CT或MRI檢查等。PSA作為治療反應(yīng)的指標(biāo)在國(guó)際上得到了廣泛的應(yīng)用，以血清PSA下降≥50%，且可以維持一周為有效；PSA仍升高為無(wú)效。

經(jīng)檢查，化療5個(gè)周期后患者中有17名被認(rèn)為是治療有效，有效率60.7%。

各個(gè)分子標(biāo)記的平均表達(dá)量在患者和健康者之間的統(tǒng)計(jì)比較（取自然對(duì)數(shù)值Ln）

*、※相對(duì)于健康者P<0.05；

#相對(duì)于有效者P<0.05。

從上表中可以看出，對(duì)于TP53和GSTP1，它們?cè)诙辔魉愔委熡行Ш椭委煙o(wú)效者的表達(dá)量相對(duì)于健康者來(lái)說(shuō)，都分別明顯上調(diào)和下調(diào)，提示它們的表達(dá)量與前列腺癌密切相關(guān)；并且，有效者與無(wú)效者之間的表達(dá)量也存在著顯著性區(qū)別，提示有可能它們能夠成為診斷多西他賽化療耐藥的標(biāo)記；而對(duì)于Bcl2基因，在治療有效和無(wú)效者都與健康都的表達(dá)量存在顯著性差異，提示Bcl2基因是的變化是診斷前列腺癌的一個(gè)重要標(biāo)記；多西他賽是一種半合成的紫杉醇衍生物，藥理學(xué)研究顯示其可通過(guò)加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，同時(shí)還可促進(jìn)Bcl2磷酸化，使Bcl2/Bax異二聚體解聚，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)于治療有效者來(lái)說(shuō)，雖然也出現(xiàn)有Bcl2量過(guò)表達(dá)，但是使用多西他賽不佳，提示可能存在著其它因素導(dǎo)致了治療無(wú)效。

綜上分析，篩選出了在治療有效和無(wú)效之間存在顯著性差異性的TP53、GSTP1、miR-221、miR-155進(jìn)行聯(lián)合公式評(píng)價(jià)篩選，根據(jù)表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)，經(jīng)過(guò)SPSS軟件的ROC曲線(xiàn)擬合，得到出了如下3組聯(lián)合公式：

；當(dāng)F1大于3.2時(shí)認(rèn)為耐藥；（公式1）

；當(dāng)F2大于1.2時(shí)認(rèn)為耐藥（公式2）

；當(dāng)F3大于1.1時(shí)認(rèn)為耐藥（公式3）

其中：

A=Ln(TP53相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量)；

B=Ln(GSTP1相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量) ；

C= Ln(miR-221相對(duì)于U6的表達(dá)量) ；

D= Ln(miR-155相對(duì)于U6的表達(dá)量) ；

由三個(gè)聯(lián)合公式分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到的敏感性和特異性如下，其ROC圖分別如圖1～3所示：

從表中可以看出，公式1中對(duì)TP53的表達(dá)量加上了含有miR-155表達(dá)量的修正因子后，明顯地提高了診斷的敏感性和特異性，并且優(yōu)于采用miR-221表達(dá)量的診斷公式。

綜上可以看出，采用本發(fā)明提供的聯(lián)合分子標(biāo)記可以用于對(duì)多西他賽治療前列腺癌耐藥的預(yù)判斷。

SEQUENCE LISTING

<110> 強(qiáng)平, 毛

<120> 一種用于前列腺癌治療評(píng)估的聯(lián)合基因標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒

<130> 無(wú)

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagttgtagt ggatggtggt acagt 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actgtaccac catccactac aacta 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctttcgga tctttatttc atgag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcatgaaat aaagatccga aagga 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagctctggc cctgatctgc cagca 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgctggcaga tcagggccag agctg 25

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgaccc cctctg 56

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaccccctct ggtcaaccag tcaca 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtgactggt tgaccagagg gggtc 25

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacaa cccatg 56

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacaacccat ggaattcagt tctca 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgagaactga attccatggg ttgtc 25

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac ccaccg 56

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acacccaccg acaacaatga atgtt 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aacattcatt gttgtcggtg ggtgt 25

<210> 16

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacca gctgct 56

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

accagctgct tttgggattc cgttg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caacggaatc ccaaaagcag ctggt 25

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacaa atctac 56

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gacaaatcta cattgtatgc caggt 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acctggcata caatgtagat ttgtc 25

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacag gatcta 56

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacaggatct acactggcta ctgag 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ctcagtagcc agtgtagatc ctgtc 25

<210> 25

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacaa ctcagc 56

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gacaactcag cttgtcaaat acacg 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cgtgtatttg acaagctgag ttgtc 25

<210> 28

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacct gaacac 56

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gacctgaaca ccaaaagaaa tcagt 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

actgatttct tttggtgttc aggtc 25

<210> 31

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacga acacc 55

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gacgaacacc aggagaaatc ggtca 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgaccgattt ctcctggtgt tcgtc 25

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<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac ccct 54

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acacccctat cacgattagc attaa 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttaatgctaa tcgtgatagg ggtgt 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

catatacacg acggcttcgc tcgtg 25

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

taaaacctcc ctagagcgag g 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

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