本申請是申請?zhí)枮?00980126943.6的中國專利申請的分案申請，原申請是申請日為2009年5月20日的國際申請pct/ep2009/056181的中國國家階段申請。本發(fā)明涉及生產(chǎn)二羧酸的方法。本發(fā)明特別涉及通過酵母的發(fā)酵來生產(chǎn)二羧酸。
背景技術：
：二羧酸(例如延胡索酸和琥珀酸)是重要的化合物，其在食品工業(yè)中用于食物制備和防腐，在醫(yī)藥工業(yè)中用于配制藥物制品，以及用于其他工業(yè)用途，例如(生物)聚合物的單體。為了滿足對二羧酸的日益增加的需要，正在開發(fā)更高效和更具成本效益的生產(chǎn)方法。傳統(tǒng)上通過發(fā)酵能夠生產(chǎn)大量二羧酸的細菌來制造二羧酸。這例如描述于us5,573,931中，其中描述了通過使用細菌菌株生產(chǎn)高濃度的琥珀酸的方法。然而，與用細菌生產(chǎn)二羧酸的用途相關的一個主要的缺點是二羧酸鹽的形成。如果使用細菌，則發(fā)酵期間的ph需要被維持在ph6-7的范圍內，這高于所有二羧酸的pka值。因此，大部分酸將以其鹽的形式被生產(chǎn)，這些鹽必須被轉化成酸。在大規(guī)模生產(chǎn)方法中這不實用不高效，并且提高生產(chǎn)成本。此外，并非細菌的微生物也已被用于生產(chǎn)有機酸。ep0424384公開了在含有碳酸鈣的培養(yǎng)基中通過rhizopus生產(chǎn)有機酸的需氧方法。ep1183385公開了經(jīng)遺傳操縱的酵母細胞，所述酵母細胞具有crabtree陰性表型并且含有用于生產(chǎn)乳酸的外源核酸分子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)二羧酸的方法。所述方法包括在低于二羧酸pka的ph值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧時發(fā)酵酵母。本發(fā)明的方法提供了二羧酸產(chǎn)物的高產(chǎn)率，允許更簡單的下游加工，并且比現(xiàn)有方法更具成本效益，現(xiàn)有方法中生產(chǎn)的是鹽，其必須隨后被轉化成酸。因為二羧酸具有多于一個的pka值，所以ph應當?shù)陀诙人岬淖畹蚿ka。對大部分酸而言，ph應典型地在ph1.0到ph5.5的范圍內，優(yōu)選地在ph2.0和ph4.0之間。在一個實施方案中，在3.0的ph值下生產(chǎn)琥珀酸。另一優(yōu)點是由于ph低，所以污染的風險被降低。酸生產(chǎn)階段之前優(yōu)選是針對最優(yōu)生物質生產(chǎn)的生物質形成階段。在生物質形成階段中，ph在ph2到ph7的范圍內。優(yōu)選地，ph在ph3到ph6的范圍內，更優(yōu)選地，ph在ph4到ph5的范圍內。根據(jù)本發(fā)明的方法更具成本效益，并可導致低30％的成本價格。原因之一是滴定劑成本被顯著降低。本發(fā)明的方法可被用于生產(chǎn)任何二羧酸。合適的例子包括己二酸、延胡索酸、衣康酸(itaconicacid)、琥珀酸、蘋果酸、草酸。優(yōu)選地，二羧酸是琥珀酸、延胡索酸或蘋果酸。在本發(fā)明方法中使用的酵母可以是任何合適的酵母。酵母的合適例子包括saccharomyces、schizosaccharomyces、kluyveromyces、candida、pichia和yarrowia，例如saccharomycescerevisiae、schizosaccharomycespombe、kluyvermoceslactis、candidasonorensis、pichiastipidis和yarrowialipolytica的物種。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的真核微生物是saccharomycescerevisiae——一種廣泛使用的工業(yè)上感興趣的微生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的酵母是經(jīng)遺傳修飾的酵母。在本文中使用時，在根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母被定義為下述酵母細胞，其含有所述酵母細胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽，或者經(jīng)所述酵母細胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽轉化或遺傳修飾過，或者其含有內源核酸序列的額外的一個或多個拷貝。野生型酵母細胞在本文中被定義為重組細胞的親本細胞。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的酵母是經(jīng)遺傳修飾的酵母，其包含編碼選自下組的異源酶的核苷酸序列，所述組由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸還原酶和延胡索酸酶組成。異源酶的優(yōu)選的實施方案如下文定義。當用于指出給定的(重組)核酸或多肽分子與給定的宿主生物或宿主細胞之間的關系時，術語“同源的”應當被理解為表示該核酸或多肽分子天然地由相同物種、優(yōu)選地相同品種或株系的宿主細胞或生物生產(chǎn)。在關于核酸(dna或rna)或蛋白質的方面，使用術語“異源的”表示下述核酸或蛋白質，其不作為其存在的生物、細胞、基因組或dna或rna序列的部分天然存在，或其被發(fā)現(xiàn)于與其天然被發(fā)現(xiàn)的細胞或基因組或dna或rna序列中的位點不同的細胞或位點。異源核酸或蛋白質對其被引入的細胞而言不是內源的，而是得自另一細胞或是以合成方式或重組方式生產(chǎn)的。優(yōu)選地，經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。pep羧激酶(ec4.1.1.49)優(yōu)選地是異源酶，優(yōu)選地源于細菌，更優(yōu)選地具有pep羧激酶活性的酶源于escherichiacoli、mannheimiasp.、actinobacillussp.或anaerobiospirillumsp.，更優(yōu)選地，mannheimiasucciniciproducens或actinobacillussuccinogenes。在一個實施方案中，pep羧激酶源于actinobacillussuccinogenes(pcka)，其中pcka優(yōu)選地已被修飾為在第120-122位上用daf氨基酸序列代替egy。優(yōu)選地，用與seqidno:6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性的pep羧激酶對根據(jù)本發(fā)明的酵母細胞進行了遺傳修飾。在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼延胡索酸還原酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，延胡索酸還原酶是異源酶，優(yōu)選地是nad(h)-依賴型延胡索酸還原酶，其可源于任何合適的來源，例如細菌、真菌、原生動物或植物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的酵母包含異源的nad(h)-依賴型延胡索酸還原酶，優(yōu)選地源于trypanosomasp.，例如源于trypanosomabrucei。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼nad(h)-依賴型延胡索酸還原酶的核苷酸序列在胞質溶膠中表達。在編碼nad(h)-依賴型延胡索酸還原酶的核苷酸序列包含過氧化物酶體或線粒體靶向信號的情況下，可能必須修飾或缺失大量氨基酸(和編碼核苷酸序列中相應的核苷酸序列)，從而阻止酶的過氧化物酶體或線粒體靶向。過氧化物酶體靶向信號的存在可例如通過etal,nucleicacidresearch2007,35,d815-d822所公開的方法來確定。優(yōu)選地，用與seqidno:7具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性的nad(h)-依賴型延胡索酸還原酶來對根據(jù)本發(fā)明的酵母細胞進行遺傳修飾。在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼延胡索酸酶的核苷酸序列，所述延胡索酸酶可以是異源或同源的酶。編碼異源延胡索酸酶的核苷酸序列可以源于任何合適的來源，優(yōu)選地來自微生物來源，優(yōu)選地來自酵母，例如saccharomycescerevisiae，或來自絲狀真菌，例如rhizopusoryzae。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明方法中的酵母過表達編碼與seqidno:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列同一性的延胡索酸酶的核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母還包含編碼蘋果酸脫氫酶(mdh)的核苷酸序列，所述蘋果酸脫氫酶在所述核苷酸序列表達后在胞質溶膠中有活性。優(yōu)選地，mdh缺乏過氧化物酶體或線粒體靶向信號，以將酶定位于胞質溶膠中。胞質溶膠mdh可以是任何合適的同源或異源蘋果酸脫氫酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母細胞包含編碼下述蘋果酸脫氫酶的核苷酸序列，所述蘋果酸脫氫酶與seqidno:9的氨基酸序列具有至少70％，優(yōu)選地至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。在另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼二羧酸轉運蛋白(優(yōu)選地，蘋果酸轉運蛋白(mae))的核苷酸序列。二羧酸轉運蛋白可以是同源或異源的蛋白質。優(yōu)選地，二羧酸轉運蛋白是異源的蛋白質。二羧酸轉運蛋白可源于任何合適的生物，優(yōu)選地源于schizosaccharomycespombe。優(yōu)選地，二羧酸轉運蛋白是下述蘋果酸轉運蛋白(mae)，所述蘋果酸轉運蛋白與seqidno:10具有至少80％、85％、90％、95％或99％或100％的序列同一性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的酵母是包含異源pep-羧激酶、異源nad(p)h-依賴型延胡索酸還原酶、異源延胡索酸酶、異源蘋果酸轉運蛋白和胞質溶膠蘋果酸脫氫酶的經(jīng)遺傳修飾的酵母。這些酶的優(yōu)選的實施方案如本文上文中定義。序列同一性在本文中被定義為通過比較序列測定的兩條或更多條氨基酸(多肽或蛋白質)序列或兩條或更多條核酸(多核苷酸)序列之間的關系。通常，在被比較的序列的整個長度上比較序列同一性或相似性。在本領域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之間的序列相關度，這根據(jù)情況通過這類序列串之間的匹配測定。測定同一性的優(yōu)選方法被設計為在測試的序列之間給予最大匹配。測定同一性和相似性的方法被編碼于公眾可獲得的計算機程序中。測定兩條序列之間同一性和相似性的優(yōu)選的計算機程序方法包括blastp和blastn，公眾可從ncbi和其它來源(blastmanual,altschul,s.,等,ncbinlmnihbethesda,md20894)獲得。使用blastp的氨基酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放11.0，缺口延伸1，blosum62矩陣。在本文中使用時，術語“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚體，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知類似物，因為它們能夠以類似于天然存在的核苷酸的方式與單鏈核酸雜交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或異源的結構基因或調節(jié)基因的全長或亞序列。除非另有說明，該術語包括特定的序列及其互補序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法中的酵母過表達編碼本文上文定義的任何酶的核苷酸序列。本領域可獲得多種手段用于在本發(fā)明方法中在酵母中過量表達編碼酶的核苷酸序列。具體地，可以通過提高細胞中編碼酶的基因的拷貝數(shù)，例如通過在細胞的基因組中整合額外的基因拷貝，通過表達來自著絲粒載體、來自附加體多拷貝表達載體的基因，或者通過引入包含多拷貝基因的(附加體)表達載體，來過量表達編碼酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，用(強)組成型啟動子實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的酶的過量表達。含碳水化合物的底物可以是任何含碳水化合物的底物，包括糖蜜(molasse)，甘蔗汁，戊糖和己糖，例如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖。優(yōu)選地，含碳水化合物的底物是含葡萄糖的底物，如麥芽糖、蔗糖、葡萄糖或葡萄糖漿。含碳水化合物的底物的碳水化合物含量以干物質含量為基礎優(yōu)選地多于50％w/w，更優(yōu)選地多于55％、60％、65％、70％、75％、80％w/w，最優(yōu)選地多于85％、90％、95％或99％w/w。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選地包括在碳(c)-受限的條件下發(fā)酵酵母。c-受限的條件在本文中被定義為溶解的碳水化合物的濃度低于1g/l，優(yōu)選地低于0.9g/l、0.8g/l或低于0.5g/l溶解的碳水化合物。發(fā)現(xiàn)在c-受限的條件下發(fā)酵酵母導致與非c-受限的條件相比提高的琥珀酸產(chǎn)率。用于發(fā)酵的氧可以以任何合適的形式供應。在一個實施方案中，氧以空氣的形式供應。氧應當小量供應。這反映于酵母的氧吸收速率(our)和/或氧吸收比速率(qo2)中。本發(fā)明中的our低于約8.0mmol氧/l/小時，優(yōu)選地低于約5.0、4.0、3.0或2.0mmol氧/l/小時，更優(yōu)選地低于約1.0或0.5mmol氧/l/小時，優(yōu)選地高于0.01mmol氧/l/小時。本發(fā)明方法中的氧吸收比速率(qo2)范圍在8mmol氧/g生物質干重/小時到0.5mmol氧/g生物質干重/小時之間，優(yōu)選地在5、4、3或2mmol氧/g生物質/小時到約0.4、0.3或0.2mmol/氧/g生物質/小時之間。根據(jù)本發(fā)明的方法可以以分批、補料分批或連續(xù)模式進行。這些發(fā)酵模式是本領域技術人員已知的。取決于發(fā)酵模式，發(fā)酵期間的生物質濃度可在發(fā)酵期間或多或少地變化。在分批和補料分批模式中，生物質濃度通常提高。因此，在分批和補料分批模式中，氧吸收比速率通常降低。本發(fā)明方法的溫度典型地在10℃和40℃之間，優(yōu)選地在20℃和35℃之間，更優(yōu)選地在30℃和35℃之間。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案中，除了含碳水化合物的底物之外還存在額外的電子供體。額外的電子供體優(yōu)選地是有機電子供體。有機電子供體的合適例子包括甘油、甲酸鹽/酯和多元醇例如甘露醇、山梨醇和木糖醇。附圖說明圖1.應用的our對ph3下進行90小時后的琥珀酸生產(chǎn)的影響。具體實施方式實施例實施例1.通過saccharomycescerevisiae生產(chǎn)琥珀酸1.1.構建酵母菌株1.1.1.構建表達構建體對s.cerevisiae表達載體prs414(sirkoskir.s.andhieterp,genetics,1989,122(1):19-27)進行bamhi/noti限制性消化，隨后在該載體中連接由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(來源actinobacillussuccinogenes)合成基因構建體(seqidno:1)構成的bamhi/noti限制性消化片段之后，制造了表達構建體pgbs414ppk-3。使用連接混合物轉化e.colitop10(invitrogen)，得到酵母表達構建體pgbs414ppk-1。隨后用asci和noti限制性消化pgbk414ppk-1。為了制造pgbs414ppk-3，將由來自t.brucei(frdg)合成基因構建體(seqidno:2)的酵解酶體延胡索酸還原酶構成的asci/noti限制性消化片段連接進經(jīng)限制性消化的pgbs414ppk-1載體中。連接混合物被用于轉化e.colitop10(invitrogen)，得到酵母表達構建體pgbs414ppk-3。對s.cerevisiae表達載體prs415(sirkoskir.s.andhieterp,genetics,1989,122(1):19-27)進行bamhi/noti限制性消化，隨后在該載體中連接由延胡索酸酶(來源rhizopusoryzae)合成基因構建體(seqidno:3)構成的bamhi/noti限制性消化片段之后，制造了表達構建體pgbs415fum-3。使用連接混合物轉化e.colitop10(invitrogen)，得到酵母表達構建體pgbs415fum-1。隨后用asci和noti限制性消化pgbk415fum-1。為了制造pgbs415fum-3，將由來自s.cerevisiae(mdh3)合成基因構建體(seqidno:4)的過氧化物酶體蘋果酸脫氫酶構成的asci/noti限制性消化片段連接進經(jīng)限制性消化的pgbs415fum-1載體中。連接混合物被用于轉化e.colitop10(invitrogen)，得到酵母表達構建體pgbs415fum-3。對s.cerevisiae表達載體prs416(sirkoskir.s.andhieterp,genetics,1989,122(1):19-27)進行bamhi/noti限制性消化，隨后在該載體中連接由schizosaccharomycespombe蘋果酸轉運蛋白合成基因構建體(seqidno:5)構成的bamhi/noti限制性消化片段之后，制造了表達構建體pgbs416mae-1。使用連接混合物轉化e.colitop10(invitrogen)，得到酵母表達構建體pgbs416mae-1。1.1.2.構建s.cerevisiae菌株通過電穿孔將質粒pgbs414ppk-3、pgbs415fum-3和pgbs416mae-1(在1.1.下描述)轉化進s.cerevisiae菌株rwb064(mataura3-52leu2-112trp1-289adh1::loxadh2::loxgpd1::kanlox)中，制造過表達pcka、mdh3、fumr、frdg和spmaei的菌株suc-200。根據(jù)wo2008/000632，針對在s.cerevisiae中的表達對所有基因都進行了密碼子對優(yōu)化。1.2.在低ph和氧受限條件下的s.cerevisiae琥珀酸生產(chǎn)在30℃和220rpm下，在搖瓶(2x300ml)中將酵母菌株suc-200(過表達pcka、mdh3、fumr、frdg和spmaei的mataura3-52leu2-112trp1-289adh1::loxadh2::loxgpd1::kanlox)培養(yǎng)3天。培養(yǎng)基以verduyn(verduynet.al.,1992,yeast8,501-517)為基礎，但是如表1中所示對碳源和碳源進行了改動。表1.預培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基組成a維生素溶液組分通式濃度(g/kg)生物素(d-)c10h16n2o3s0.05cad(+)泛酸鹽c18h32can2o101.00煙酸c6h5no21.00myo-肌醇c6h12o625.00鹽酸氯化硫胺c12h18cl2n4osxh2o1.00鹽酸吡哆醇c8h12clno31.00對氨基苯甲酸c7h7no20.20b微量元素溶液通式濃度(g/kg)c10h14n2na2o8·2h2o(edta)15.00znso4·7h2o1.50mncl2·2h2o0.84cocl2·6h2o0.30cuso4·5h2o0.30na2moo4·2h2o0.40cacl2·2h2o4.50feso4·7h2o3.00h3bo31.00ki0.10隨后，將搖瓶內容物轉移至含有以下培養(yǎng)基的10l發(fā)酵罐(初始重量6kg)中：表2.主要發(fā)酵培養(yǎng)基組成通過添加6nkoh將ph控制在3.0。將溫度控制在30℃。通過控制對發(fā)酵罐的補料添加，使葡萄糖濃度保持受限(<1g/l)。對發(fā)酵應用導致氧限制的不同的氧吸收速率(our)(圖1)。應用0.33vvm的包括10％co2的總氣流，從而為高效的琥珀酸生產(chǎn)提供足夠的co2。對琥珀酸生產(chǎn)應用的不同our的結果展示于圖1中。在ph3下需要最小量的通氣維持琥珀酸生產(chǎn)。高于5mmol/l/h的our導致更低的琥珀酸生產(chǎn)。在90小時的培養(yǎng)期間，生長發(fā)生至8g干重/l的典型生物質濃度。結果，在發(fā)酵期間氧吸收比速率(qo2)持續(xù)降低。在一次發(fā)酵中應用的10mmol/l/h的our與從10降低至1.25mmol/g生物質干重/h的qo2相關，1mmol/l/h的our與從1降至0.1mmol/g生物質干重/h的qo2相關。以下內容對應于母案申請中的原始權利要求書，現(xiàn)作為說明書的一部分并入此處：1.用于制備二羧酸的方法，所述方法包括在低于有機酸最低pka的ph值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧時發(fā)酵酵母。2.根據(jù)項1的方法，其中所述二羧酸是延胡索酸、蘋果酸或琥珀酸。3.根據(jù)項1或2的方法，其中所述ph在ph1.0到ph5.5的范圍內。4.根據(jù)項1到3中任一項的方法，其中所述氧以低于約8mmol氧/l/小時的氧吸收速率被供應。5.根據(jù)項1到3中任一項的方法，其中所述氧以8到0.5mmol/g生物質干重/小時之間的范圍內的氧吸收比速率被供應。6.根據(jù)項1到5中任一項的方法，所述方法包括在碳受限的條件下發(fā)酵酵母。7.根據(jù)項1到6中任一項的方法，所述方法在存在額外的電子供體時進行。8.根據(jù)項1到7中任一項的方法，其中所述酵母是saccharomycescerevisiae。9.根據(jù)項1到8中任一項的方法，其中所述酵母是經(jīng)遺傳修飾的酵母。10.根據(jù)項9的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的酵母包含編碼選自下組的異源酶的核苷酸序列，所述組由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸還原酶和延胡索酸酶組成。序列表<110>帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司米克爾·萊納德斯·奧古斯特·詹森瑞內·維爾瓦爾<120>通過在低ph下發(fā)酵生產(chǎn)二羧酸<130>26725-wo-pct<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>3148<212>dna<213>人工序列<220><223>用于在s.cerevisiae中表達的合成構建體tdh1p-pcka-tdh1t<400>1ggatcccttcccttttacagtgcttcggaaaagcacagcgttgtccaagggaacaatttt60tcttcaagttaatgcataagaaatatctttttttatgtttagctaagtaaaagcagcttg120gagtaaaaaaaaaaatgagtaaatttctcgatggattagtttctcacaggtaacataaca180aaaaccaagaaaagcccgcttctgaaaactacagttgacttgtatgctaaagggccagac240taatgggaggagaaaaagaaacgaatgtatatgctcatttacactctatatcaccatatg300gaggataagttgggctgagcttctgatccaatttattctatccattagttgctgatatgt360cccaccagccaacacttgatagtatctactcgccattcacttccagcagcgccagtaggg420ttgttgagcttagtaaaaatgtgcgcaccacaagcctacatgactccacgtcacatgaaa480ccacaccgtggggccttgttgcgctaggaataggatatgcgacgaagacgcttctgctta540gtaaccacaccacattttcagggggtcgatctgcttgcttcctttactgtcacg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oglyleulys260265270asnglylyslysalaglnglnleuvalglyaspasnserileglutyr275280285pheserleuproilevalleuargasnglyservalvalserileasp290295300thrservalleuglulysleuserproargglugluglnleuvalasn305310315320thralavallysgluleuarglysasnileglulysglylysserphe325330335ileleuaspser340<210>10<211>438<212>prt<213>schizosaccharomycespombe蘋果酸通透酶氨基酸序列。<400>10metglygluleulysgluileleulysglnargtyrhisgluleuleu151015asptrpasnvallysalaprohisvalproleuserglnargleulys202530hisphethrtrpsertrpphealacysthrmetalathrglyglyval354045glyleuileileglyserphepropheargphetyrglyleuasnthr505560ileglylysilevaltyrileleuglnilepheleupheserleuphe65707580glysercysmetleupheargpheilelystyrproserthrilelys859095aspsertrpasnhishisleuglulysleupheilealathrcysleu100105110leuserileserthrpheileaspmetleualailetyralatyrpro115120125aspthrglyglutrpmetvaltrpvalileargileleutyrtyrile130135140tyrvalalavalserpheiletyrcysvalmetalaphephethrile145150155160pheasnasnhisvaltyrthrilegluthralaserproalatrpile165170175leuproilepheproprometilecysglyvalilealaglyalaval180185190asnserthrglnproalahisglnleulysasnmetvalilephegly195200205ileleupheglnglyleuglyphetrpvaltyrleuleuleupheala210215220valasnvalleuargphephethrvalglyleualalysproglnasp225230235240argproglymetphemetphevalglyproproalapheserglyleu245250255alaleuileasnilealaargglyalametglyserargprotyrile260265270phevalglyalaasnserserglutyrleuglyphevalserthrphe275280285metalailepheiletrpglyleualaalatrpcystyrcysleuala290295300metvalserpheleualaglyphephethrargalaproleulysphe305310315320alacysglytrpphealapheilepheproasnvalglyphevalasn325330335cysthrilegluileglylysmetileaspserlysalapheglnmet340345350pheglyhisileileglyvalileleucysileglntrpileleuleu355360365mettyrleumetvalargalapheleuvalasnaspleucystyrpro370375380glylysaspgluaspalahisproproprolysproasnthrglyval385390395400leuasnprothrpheproproglulysalaproalaserleuglulys405410415valaspthrhisvalthrserthrglyglygluseraspproproser420425430sergluhisgluserval435當前第1頁12