本申請(qǐng)是2011年7月7日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?01180038860.9(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2011/043221)、發(fā)明名稱為“使用peg化的量子點(diǎn)以在植物中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的線性dna分子投遞”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。優(yōu)先權(quán)要求本申請(qǐng)要求2010年7月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)流水號(hào)61/362,224關(guān)于“l(fā)ineardnamoleculedeliveryusingpegylatedquantumdotsforstabletransformationinplants”的提交日權(quán)益。本發(fā)明涉及使用納米顆粒以將線性核酸分子非侵入投遞入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法。發(fā)明背景納米顆粒具有的獨(dú)特性質(zhì)已經(jīng)被利用于將dna投遞至特定動(dòng)物細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，在將某些經(jīng)dna包被的納米顆粒與沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞一起溫育時(shí)，細(xì)胞吸收納米顆粒，并開始表達(dá)dna上編碼的基因。也已經(jīng)使用在大小范圍3-5nm內(nèi)的半導(dǎo)體納米顆粒(例如，量子點(diǎn)(“qd”))作為載體來將分子投遞入細(xì)胞中。dna和蛋白質(zhì)可以與附著于qd表面的某些配體連接。見例如patolsky,等(2003)j.am.chem.soc.125:13918?？梢酝ㄟ^使用標(biāo)準(zhǔn)的生物綴合方案將經(jīng)羧酸或胺包被的qd與含有硫醇基團(tuán)(見例如dubertret等(2002)science298:1759；akerman,等(2002)proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12617；mitchell,等(1999)j.am.chem.soc.121:8122)，或n-羥基琥珀酰亞氨基(“nhs”)酯基的分子交聯(lián)。見例如pinaud等(2004)j.am.chem.soc.126:6115；bruchez等(1998)science281:2013。一種將分子附著于qd表面的備選方式是經(jīng)由將經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白包被的qd與生物素化的蛋白質(zhì)、寡核苷酸、或抗體綴合進(jìn)行。見例如dahan,等(2003)science302:442；pinaud,等(2004)j.am.chem.soc.126:6115；wu,等(2003)naturebiotechnol.21:41；jaiswal,等(2003)naturebiotechnol.21:47；及mansson,等(2004)biochem.biophys.res.commun.314:529。由于存在植物細(xì)胞壁，將外來核酸分子投遞至植物是挑戰(zhàn)性的。目前的方法依賴于侵入性投遞以遺傳轉(zhuǎn)化植物。在植物細(xì)胞中，細(xì)胞壁是針對(duì)投遞外源應(yīng)用的分子的屏障。已經(jīng)采用許多侵入性細(xì)胞投遞方法，例如生物射彈(基因槍)、微注射、電穿孔、和土壤桿菌(agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)基因和小分子對(duì)有壁的植物細(xì)胞中的投遞，但是蛋白質(zhì)的投遞僅已經(jīng)通過微注射實(shí)現(xiàn)。在用納米顆粒將核酸分子投遞至植物細(xì)胞是期望的情況中，在將顆粒添加至植物原生質(zhì)體前除去細(xì)胞壁。見例如torney,等(2007)naturenanotechnol.2:295-300。發(fā)明概述本文中描述了使用納米顆粒和線性化的核酸分子以將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法和組合物。可以使用公開內(nèi)容的方法的一些實(shí)施方案來生成經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的經(jīng)遺傳修飾的能育植物。在一些實(shí)施方案中，線性核酸分子的獨(dú)特特性容許投遞沒有外來核酸序列的感興趣的特定基因序列，所述外來核酸序列對(duì)轉(zhuǎn)基因靶生物體可以具有調(diào)節(jié)后果。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒可以用線性核酸分子進(jìn)行peg化。在具體的實(shí)施方案中，納米顆?？梢允前雽?dǎo)體納米顆粒，諸如量子點(diǎn)(“qd”)。在一些實(shí)施方案中，線性核酸分子可以是線性化的質(zhì)粒dna。在其它實(shí)施方案中，線性核酸分子可以包含編碼膦絲菌素-n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(pat)和/或黃色熒光蛋白(yfp)的序列。還公開了用于將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法，其中該方法可以包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；用peg包被納米顆粒的表面以生成“peg化的”納米顆粒；用至少一種感興趣的線性核酸分子包被peg化的納米顆粒；將所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和用感興趣的線性核酸分子包被的peg化的納米顆粒置于彼此接觸中；并容許所述納米顆粒和所述感興趣的線性核酸分子攝取入包含細(xì)胞壁的細(xì)胞中。進(jìn)一步公開了用于將性狀基因滲入(introgress)植物中的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法可以包括提供植物細(xì)胞；用peg包被納米顆粒的表面以生成peg化的納米顆粒；用供在所述植物中表達(dá)所述性狀用的手段(means)包被peg化的納米顆粒；將植物細(xì)胞和用供在植物中表達(dá)性狀用的手段包被的peg化的納米顆粒置于彼此接觸中；容許所述納米顆粒和供在植物中表達(dá)性狀用的手段攝取入所述植物細(xì)胞中以生成經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；自經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生全植物；并繁殖所述植物。在一些實(shí)施方案中，可以依照本發(fā)明的方法基因滲入的性狀包括性狀，其選自但不限于如下的：雄性不育；除草劑抗性；昆蟲抗性；和對(duì)細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。還公開了本發(fā)明的方法，其可以用于在植物內(nèi)(inplanta)轉(zhuǎn)化植物。在一些實(shí)施方案中，植物可以選自擬南芥屬(arabidopsis)的植物，例如擬南芥(a.thaliana)。在具體的實(shí)施方案中，通過植物內(nèi)轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化的植物可以選自哥倫比亞(columbia)生態(tài)型的擬南芥植物。另外，公開了經(jīng)遺傳修飾的(gm)植物細(xì)胞及其生成方法，其中所述植物細(xì)胞具有經(jīng)由本發(fā)明的方法導(dǎo)入其中的一種或多種核酸。在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由依照本發(fā)明的納米顆粒將質(zhì)粒導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中，所述質(zhì)粒包含至少一種感興趣的基因和選擇標(biāo)志。在其它實(shí)施方案中，可以選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，其已經(jīng)穩(wěn)定整合至少一種感興趣的基因和/或選擇標(biāo)志。在備選的實(shí)施方案中，可以增殖現(xiàn)在包含至少一種感興趣的基因的植物細(xì)胞以生成包含感興趣的分子的其它細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，現(xiàn)在包含感興趣的分子的植物細(xì)胞可以是可再生細(xì)胞，其可以用于再生包含感興趣的分子的全植物。進(jìn)一步公開了創(chuàng)建在組織培養(yǎng)中使用的包含感興趣的分子的可再生植物細(xì)胞的方法。組織培養(yǎng)物可以能夠再生與可再生細(xì)胞具有基本上相同的基因型的植物。此類組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以例如是胚；原生質(zhì)體；分生細(xì)胞；愈傷組織；花粉；葉；花藥；根；根尖；花；種子；莢果；或莖。更進(jìn)一步，一些實(shí)施方案提供了自本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的植物。進(jìn)一步公開了用于生成包含期望的性狀或感興趣的核酸分子的穩(wěn)定化植物系的方法，其中首先可以通過納米顆粒攝取穿過植物細(xì)胞壁來導(dǎo)入所述期望的性狀或感興趣的核酸分子。生成穩(wěn)定化的植物系的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且可以包括如下的技術(shù)，諸如但不限于自交；回交；雜種生成；與群體雜交；等等。如此，還公開了包含首先通過納米顆粒攝取穿過細(xì)胞壁導(dǎo)入植物細(xì)胞(或其祖先)中的期望的性狀或感興趣的核酸分子的植物和植物細(xì)胞?？梢栽谂c另一不同植物細(xì)胞的雜交中使用包含期望的性狀或感興趣的核酸分子的植物細(xì)胞以生成具有期望特征的第一代(f1)雜種細(xì)胞；種子；和/或植物，所述期望的性狀或感興趣的核酸分子首先通過納米顆粒攝取穿過細(xì)胞壁導(dǎo)入植物或細(xì)胞(或其祖先)中。具體地，本申請(qǐng)?zhí)峁┫率龈黜?xiàng)：1.一種將感興趣的線性核酸分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法，該方法包括：提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；用感興趣的線性核酸分子包被納米顆粒；將所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和所述經(jīng)包被的納米顆粒置于彼此接觸；并容許所述納米顆粒和所述感興趣的線性核酸分子攝取入所述包含細(xì)胞壁的細(xì)胞中。2.依照項(xiàng)1的方法，其中用聚乙二醇包被所述納米顆粒。3.依照項(xiàng)1的方法，進(jìn)一步包括容許所述納米顆粒攝取入所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的區(qū)室中。4.依照項(xiàng)3的方法，進(jìn)一步包括用亞細(xì)胞區(qū)室靶向蛋白包被所述納米顆粒。5.依照項(xiàng)4的方法，其中所述區(qū)室選自下組：胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核、液泡形成體、質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、白色體、油質(zhì)體、蛋白質(zhì)體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。6.依照項(xiàng)1的方法，其中所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞是來自商業(yè)作物物種的植物細(xì)胞。7.依照項(xiàng)6的方法，其中所述植物細(xì)胞選自下組：煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕櫚、花生、大豆、稻屬物種(oryzasp.)、擬南芥屬物種(arabidopsissp.)、蓖麻屬物種(ricinussp.)、和甘蔗細(xì)胞。8.依照項(xiàng)6的方法，其中所述植物細(xì)胞來自選自下組的組織：胚、分生組織、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果和莖。9.依照項(xiàng)1的方法，其中所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。10.依照項(xiàng)1的方法，其中所述納米顆粒是半導(dǎo)體納米顆粒。11.依照項(xiàng)10的方法，其中所述半導(dǎo)體納米顆粒是量子點(diǎn)。12.依照項(xiàng)1的方法，進(jìn)一步包括衍生化所述納米顆粒的表面。13.依照項(xiàng)1的方法，其中所述感興趣的線性核酸分子包含選自下組的核酸序列：dna、rna、rnai分子、和基因。14.依照項(xiàng)13的方法，其中所述感興趣的線性核酸分子包含基因。15.依照項(xiàng)14的方法，其中所述基因是外來蛋白質(zhì)基因、農(nóng)藝學(xué)基因、或標(biāo)志物基因。16.依照項(xiàng)1的方法，其中所述感興趣的線性核酸分子通過用核酸酶消化核酸分子獲得。17.依照項(xiàng)16的方法，其中用核酸酶消化的核酸分子選自下組：質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、酵母人工染色體、和細(xì)菌人工染色體。18.依照項(xiàng)13的方法，進(jìn)一步包括選擇已經(jīng)穩(wěn)定整合所述感興趣的線性核酸分子的細(xì)胞。19.依照項(xiàng)18的方法，其中選定的細(xì)胞是可再生細(xì)胞。20.依照項(xiàng)19的方法，進(jìn)一步包括自所述可再生細(xì)胞再生植物。21.一種將感興趣的線性核酸分子導(dǎo)入植物材料中的方法，該方法包括：提供植物材料，其中所述植物材料選自由植物細(xì)胞、植物組織、和植物組成的組；用聚乙二醇包被納米顆粒；用感興趣的線性核酸分子包被所述納米顆粒；將具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和所述經(jīng)包被的納米顆粒置于彼此接觸；并容許所述納米顆粒和所述感興趣的線性核酸分子攝取入所述植物材料中。22.項(xiàng)21的方法，其中所述植物材料是選自下組的植物組織：胚、分生組織、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果和莖。23.一種用于將性狀基因滲入植物中的方法，所述方法包括：提供植物細(xì)胞；用聚乙二醇包被納米顆粒；用供在所述植物中表達(dá)所述性狀用的手段包被所述納米顆粒；將所述植物細(xì)胞和所述經(jīng)包被的納米顆粒置于彼此接觸中；容許所述納米顆粒和所述供在植物中表達(dá)性狀用的手段攝取入所述植物細(xì)胞中；自經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生全植物；并繁殖所述植物。24.項(xiàng)23的方法，其中所述性狀選自下組：表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)、雄性不育、除草劑抗性、昆蟲抗性、對(duì)細(xì)菌性疾病的抗性、對(duì)真菌性疾病的抗性、和對(duì)病毒性疾病的抗性。在上文所描述的例示性方面和實(shí)施方案外，其它方面和實(shí)施方案考慮到以下描述會(huì)變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖1包括未線性化的質(zhì)粒pdab3831的圖。圖2包括用kpni限制性酶線性化的質(zhì)粒pdab3831的圖。圖3包括來自經(jīng)具有線性dna的納米顆粒轉(zhuǎn)化的擬南芥基因組的膦絲菌素-n-乙?；D(zhuǎn)移酶(pat)dna序列和來自ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)的pat序列間的序列比對(duì)。序列表seqidno:1顯示了用于擴(kuò)增yfp基因的正向引物序列：tgttccacggcaagatcccctacg。seqidno:2顯示了用于擴(kuò)增yfp基因的反向引物序列：tattcatctgggtgtgatcggcca。seqidno:3顯示了用于擴(kuò)增pat基因的正向引物序列：ggagaggagaccagttgagattag。seqidno:4顯示了用于擴(kuò)增pat基因的反向引物序列：agatctgggtaactggcctaactg。發(fā)明詳述i.幾個(gè)實(shí)施方案的概述容許非侵入性基因轉(zhuǎn)移的本發(fā)明的方法對(duì)于生成具有期望性狀的經(jīng)遺傳修飾的植物可以是非常有用的。非侵入性基因轉(zhuǎn)移可以促進(jìn)各區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)分子位點(diǎn)的特異性靶向和編輯，諸如在作物植物中摻入期望的輸入、輸出、和農(nóng)藝學(xué)性狀。描述的方法也可以作為非gmo選項(xiàng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物，將用于性狀基因滲入和疾病抗性的技術(shù)擴(kuò)展至樹或蔬菜作物，其中該技術(shù)目前是受限的。目前的專利申請(qǐng)(u.s.s.n.60/978,059)證明了基于納米顆粒的dna投遞的非侵入性手段，其使用多種納米顆粒有效載荷投遞環(huán)形質(zhì)粒dna來進(jìn)行，等等，而且明確證明了擬南芥植物的t1種子中穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)基因。含有其中生成的環(huán)形質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)出期望的除草劑耐受性表型，而且在同時(shí)用至少4倍的田間草銨膦水平噴霧時(shí)顯示高水平的耐受性。u.s.s.n.60/978,059證明了使用環(huán)形質(zhì)粒dna通過帶正電荷的金納米顆粒在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化，等等。本研究描述了使用線性核酸分子穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化植物，等等。u.s.s.n.60/978,059描述了帶正電荷的納米顆粒介導(dǎo)的質(zhì)粒dna投遞，等等。然而。至今尚未報(bào)告證明使用基于線性質(zhì)粒的投遞實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定基因組整合。此公開內(nèi)容描述了使用帶正電的納米顆粒介導(dǎo)的線性核酸分子以在植物中進(jìn)行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。分子分析指示通過本發(fā)明的方法用pat基因和yfp基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因t1擬南芥植物中的pat以及yfp表達(dá)。t1轉(zhuǎn)基因植物是能育的，并生成種子?？梢詫⑦@些種子繁殖，并可以與分子和蛋白質(zhì)分析一起實(shí)施分離分析。線性核酸分子具有的獨(dú)特特性使其區(qū)別于環(huán)形質(zhì)粒dna。例如，線性核酸分子可以具有不含載體主鏈和細(xì)胞抗生素選擇標(biāo)志的充分限定的基因盒?？梢砸蕴镩g水平濃度噴霧除草劑草銨膦(gla)以篩選轉(zhuǎn)基因物。例如，使用本發(fā)明的方法生成的擬南芥t1幼苗已經(jīng)對(duì)在萌發(fā)后7天開始隔日的田間水平劑量的草銨膦的五次應(yīng)用顯示了除草劑抗性。通過pcr對(duì)來自這些轉(zhuǎn)基因植物的基因組dna分析pat和yfp的存在，并且結(jié)果已經(jīng)顯示了pat和yfp靶dna序列。pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果已經(jīng)揭示了使用本發(fā)明的方法生成的t1擬南芥中pat和yfp轉(zhuǎn)基因的正確序列。ii.術(shù)語(yǔ)在以下的描述和表中，使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求書(包括此類術(shù)語(yǔ)給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了以下定義：回交：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“回交”可以是育種人員將雜種后代往回與親本之一，例如第一代雜種f1與f1雜種的親本基因型之一重復(fù)雜交的方法。胚：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“胚”可以指成熟種子內(nèi)含有的小植物。納米顆粒：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“納米顆?！笨梢灾敢环N具有至少1納米級(jí)尺寸，例如小于100nm的微觀顆粒。適合于用于本發(fā)明的納米微粒可以具有1nm-0.84um的大小。一類納米顆粒是“量子點(diǎn)”(qd)。量子點(diǎn)可以具有1nm-10nm，例如2-4nm的中值直徑。納米顆粒的其它種類包括但不限于金納米微粒；金包被的納米微粒；多孔性納米顆粒；中孔性納米顆粒；硅土納米顆粒；聚合物納米顆粒，包括樹枝狀聚合物(dendrimer)；鎢納米顆粒；明膠納米顆粒；納米殼(nanoshell)；納米核心(nanocore)；納米球(nanosphere)；納米棒(nanorod)；磁性納米微粒；及其組合。在可用的納米顆粒中，發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體(qd)在生物學(xué)成像和感測(cè)中提供許多得到證明的應(yīng)用。其效用源自與較大的蛋白質(zhì)相當(dāng)?shù)莫?dú)特光-物理特征和大小的組合。親水性cdse-znsqd的流體動(dòng)力學(xué)半徑從5nm(對(duì)于用分子配體交換的納米晶體帽)變化至20nm(對(duì)于嵌段共聚物內(nèi)包囊的納米晶體)?？梢詫我籷d與幾種生物分子(例如，抗體；肽；和核酸分子)綴合以提供具有增強(qiáng)的親合力的多官能性qd生物綴合物。另外，其對(duì)化學(xué)和光降解的強(qiáng)抗性可以潛在地容許特定生物學(xué)過程的長(zhǎng)期熒光監(jiān)測(cè)。nie和emory(1997)science275:1102-6?？梢栽诓恍枰M(jìn)一步純化的情況中，在同一復(fù)合物內(nèi)同時(shí)應(yīng)用基于金屬親和力自身裝配和生物素-親合素結(jié)合的多種非共價(jià)綴合方案，以生成即使在胞內(nèi)環(huán)境中仍穩(wěn)定的多官能性qd生物綴合物。yezhelyev等(2008)j.am.chem.soc.130(28):9006-12。通過對(duì)每個(gè)qd利用平均10個(gè)yfp及名義上50個(gè)細(xì)胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,cpp)，可以實(shí)現(xiàn)具有至少300kda的分子量和150埃的空間延伸的蛋白質(zhì)貨物的胞內(nèi)投遞。同上文。qd-b-pe綴合物的投遞貨物具有范圍大得多的大小和分子量；例如，在每個(gè)綴合物為平均2.5個(gè)鏈霉抗生物素蛋白-b-pe的情況中，投遞的裝配體具有潛在超過103kda的分子量，和接近500埃的總體尺寸。若使用具有更高b-pe價(jià)的綴合物，則分子量和大小可以實(shí)質(zhì)性增加。核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括rna的有義和反義鏈兩者、cdna、基因組dna、人工染色體(ace)、和前述物質(zhì)的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或任一類核苷酸的經(jīng)修飾形式。如本文中所使用的，“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義的。除非另有規(guī)定，核酸分子的長(zhǎng)度通常是至少10個(gè)堿基。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的dna。核酸分子可以包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸聯(lián)接連接在一起的天然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸之任一或兩者。可操作連接的：當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄性谂c第二核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，若啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子與編碼序列可操作連接。在重組生成時(shí)，可操作連接的核酸序列可以是連續(xù)的，且在必需連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，在同一閱讀框中。然而，核酸為了可操作連接不需要是連續(xù)的。peg化的：如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“peg化的”可以指納米顆粒(例如，量子點(diǎn))，其中已經(jīng)用聚乙二醇(peg)修飾納米顆粒的表面以得到改善的生物相容性?？梢杂酶鞣N靶向配體，例如肽和抗體進(jìn)一步包被peg化的納米顆粒，以對(duì)特定的細(xì)胞和組織實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的投遞效率。已經(jīng)將peg與具有各種藥物的納米顆粒；脂質(zhì)體；和聚合膠束綴合，例如以延長(zhǎng)經(jīng)包被的納米顆粒的血液循環(huán)時(shí)間，其通過經(jīng)由空間穩(wěn)定化效應(yīng)降低蛋白質(zhì)的非特異性吸附來實(shí)現(xiàn)。量子點(diǎn)：如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“量子點(diǎn)”(qd)(有時(shí)又稱為納米晶體)可以指限制導(dǎo)帶電子、價(jià)帶空穴、或激子(導(dǎo)帶電子和價(jià)帶空穴的束縛對(duì)(boundpair))在所有三個(gè)空間方向的運(yùn)動(dòng)的半導(dǎo)體納米結(jié)構(gòu)。例如，該限制可以由靜電勢(shì)(由外部電極、摻雜、應(yīng)變、雜質(zhì)等產(chǎn)生)；不同半導(dǎo)體材料間界面的存在(例如在核心-殼納米晶體系統(tǒng)中)；半導(dǎo)體表面的存在(例如半導(dǎo)體納米晶體)；或其組合所致。量子點(diǎn)可以具有離散的量子化能譜。相應(yīng)的波函數(shù)可以在空間上位于量子點(diǎn)內(nèi)，但是延續(xù)晶格的多個(gè)周期。量子點(diǎn)含有有限的少量(約1-100)的導(dǎo)帶電子；價(jià)帶空穴；或激子(即，有限數(shù)目的基元電荷)。量子點(diǎn)是一類特殊的半導(dǎo)材料，其可以是由ii-vi、iii-v、或iv-vi周期類材料構(gòu)成的晶體。例如，其大小范圍可以為直徑2-10納米(10-50個(gè)原子)。在一些實(shí)施方案中，量子點(diǎn)可以由硒化鎘硫化鋅核心殼(cdse/zns)構(gòu)成，并且具有一批有用的電和光學(xué)特性，其與散裝材料(bulkmaterial)的電和光學(xué)特性在性質(zhì)上趨異。量子點(diǎn)納米顆粒由于其高的量子產(chǎn)率；高的摩爾消光系數(shù)；和對(duì)光漂白的高抗性而已經(jīng)在體內(nèi)和在體外作為成像劑進(jìn)行調(diào)查。對(duì)草甘膦的抗性：對(duì)一定劑量的草甘膦的抗性指植物幸免于(即植物可以不被殺死)所述劑量的草甘膦的能力。在一些情況中，耐受性植物可以暫時(shí)變黃或者在其它方面展現(xiàn)出一些草甘膦誘導(dǎo)的損傷(例如，過度分蘗和/或生長(zhǎng)抑制)，但是能恢復(fù)。穩(wěn)定化的：如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化的”可以指從同一品種的近交植物的一個(gè)世代可再現(xiàn)地(reproducibly)傳遞給下一世代的植物特征。轉(zhuǎn)基因：如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”可以指外源核酸序列。在一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)基因是基因序列(例如，除草劑抗性基因)；編碼工業(yè)或藥學(xué)有用的化合物的基因；或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因。在又一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)基因是反義核酸序列，其中反義核酸序列的表達(dá)抑制靶核酸序列的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)。在一些實(shí)施方案中，要通過納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的感興趣的核酸分子是轉(zhuǎn)基因。然而，在其它實(shí)施方案中，感興趣的核酸分子是內(nèi)源核酸序列，其中內(nèi)源核酸序列的額外基因組拷貝是期望的；或相對(duì)于宿主生物體中的靶核酸分子在反義取向中的核酸分子。攝取。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“攝取”可以指顆粒，諸如納米顆粒(例如量子點(diǎn))穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的移位，其中所述移位不僅僅由于除攝取顆粒的細(xì)胞外的某物對(duì)顆粒賦予的動(dòng)量而發(fā)生。僅由于對(duì)顆粒賦予的動(dòng)量而引起顆粒穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的移位的裝置或方法的非限制性例子是生物射彈、基因槍、微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技術(shù)。iii.使用納米顆粒以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的dna分子投遞a.概述例如，本發(fā)明描述了用于植物轉(zhuǎn)化的新方法，其使用納米顆粒介導(dǎo)的線性化質(zhì)粒dna投遞以遺傳轉(zhuǎn)化并形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行。依照某些實(shí)施方案的方法不僅可以提供轉(zhuǎn)基因生物體的快速生成，而且在與其它轉(zhuǎn)化方法相比時(shí)為期望的基因組修飾提供幾種可能性。本發(fā)明的實(shí)施方案已經(jīng)導(dǎo)致經(jīng)由納米顆粒介導(dǎo)的線性化質(zhì)粒dna投遞生成的第一次報(bào)告的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。遺傳修飾的公開方法偏離植物遺傳轉(zhuǎn)化的傳統(tǒng)方法，并且對(duì)于生成轉(zhuǎn)基因作物植物可以是非常有用的。b.dna分子隨著容許分離和表征編碼特定蛋白質(zhì)或rna產(chǎn)物(例如干擾rna(“rnai”))的基因的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對(duì)以下方面形成了強(qiáng)烈的興趣，即工程化改造細(xì)胞的基因組以含有和表達(dá)外來基因，或者另外的或經(jīng)修飾型式的天然或內(nèi)源基因(可能由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))，以便例如以特定的方式改變細(xì)胞的性狀。此類外來的另外的和/或經(jīng)修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因”。例如，轉(zhuǎn)基因可以編碼感興趣的蛋白質(zhì)，或者轉(zhuǎn)錄成rnai。在過去15至20年里，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，并且在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化形式的細(xì)胞及其生成方法，其通過經(jīng)由穿過細(xì)胞壁攝取納米顆粒將一種或多種線性核酸分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中來進(jìn)行。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以包含在線性化表達(dá)載體中。細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以牽涉構(gòu)建會(huì)在特定細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。此類載體可以包含核酸序列，該核酸序列包含在調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止序列、或其組合)控制下的或者與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止序列、或其組合)可操作連接的基因。如此，表達(dá)載體可以含有一種或多種此類可操作連接的基因/調(diào)節(jié)元件組合。載體可以是質(zhì)粒形式，而且可以單獨(dú)或者與其它質(zhì)粒聯(lián)合使用，以使用如本文中所描述的轉(zhuǎn)化方法提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而將轉(zhuǎn)基因摻入包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。在實(shí)施方案中，感興趣的核酸分子可以是線性核酸分子。例如，可以通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化環(huán)形質(zhì)粒來生成線性核酸分子。限制性內(nèi)切核酸酶會(huì)在質(zhì)粒核苷酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)處切割質(zhì)粒。如此，質(zhì)粒可以設(shè)計(jì)為容許通過用特定的限制性內(nèi)切核酸酶消化生成一種或多種特定的線性核酸分子?；蛘撸梢詫?duì)給定的質(zhì)粒核苷酸序列搜索一種或多種特定的限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切核酸酶容許生成一種或多種特定的線性核酸分子。通過選擇在環(huán)形質(zhì)?；蚓€性核酸分子內(nèi)的特定位置處切割的限制性位點(diǎn)，可以生成所得的線性核酸分子，其缺乏來自前體核酸分子的一種或多種序列。例如，可以生成如下的線性核酸分子，其缺乏外來核酸序列(例如，載體主鏈；選擇標(biāo)志，諸如細(xì)菌選擇標(biāo)志；和與靶細(xì)胞的基因組dna同源的不必要的核酸序列)。或者，可以合成缺乏外來核酸序列的線性核酸分子。在感興趣的分子包含一種或多種基因的實(shí)施方案中，基因可以是顯性或隱性等位基因。舉例而言，所述基因可以賦予的性狀諸如除草劑抗性、抗蟲性、細(xì)菌抗性、真菌抗性、病毒性疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量、和工業(yè)用途。賦予這些性狀和其它性狀的基因是本領(lǐng)域中已知的，并且可以依照本發(fā)明的方法將任何基因?qū)氚?xì)胞壁的細(xì)胞中。用于線性化和經(jīng)由納米顆粒攝取的表達(dá)載體：標(biāo)志物基因任選地，表達(dá)載體可以包含至少一種例如與調(diào)節(jié)元件可操作連接的遺傳標(biāo)志，其容許通過負(fù)選擇(即抑制不含該選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞生長(zhǎng))或者通過正選擇(即篩選由該遺傳標(biāo)志編碼的產(chǎn)物)回收含有標(biāo)志物的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。許多用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因是本領(lǐng)域中公知的，包括例如但不限于：編碼在代謝上使可以作為抗生素或除草劑的選擇性化學(xué)劑解毒的酶的基因，或者編碼可對(duì)抑制劑不敏感的改變了的靶物的基因。特定正選擇方法也是本領(lǐng)域中已知的。一種可以適合于用某些核酸分子的植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因是任選地在植物調(diào)節(jié)信號(hào)控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶ii(nptii)基因，其賦予對(duì)卡那霉素的抗性。參見例如fraley等(1983)proc.natl.acad.sci.u.s.a.80:4803?？梢允褂玫牧硪环N選擇標(biāo)志基因是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對(duì)抗生素潮霉素的抗性。參見例如vandenelzen等(1985)plantmol.biol.5:299。可以在本發(fā)明的方法中使用的其它選擇標(biāo)志基因包括細(xì)菌起源的選擇標(biāo)志基因，例如對(duì)抗生素賦予抗性的(諸如慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷-3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(adenyltransferase))、和對(duì)博來霉素賦予抗性的選擇標(biāo)志基因。參見hayford等(1988)plantphysiol.86:1216；jones等(1987)mol.gen.genet.210:86；svab等(1990)plantmol.biol.14:197；及hille等(1986)plantmol.biol.7:171。其它選擇標(biāo)志基因可以賦予對(duì)除草劑諸如草甘膦；草銨膦(glufosinate)；或溴苯腈(bromoxynil)的抗性。參見comai等(1985)nature317:741-744；gordon-kamm等(1990)plantcell2:603-618；及stalker等(1988)science242:419-423?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用的其它選擇標(biāo)志基因包括那些不是細(xì)菌起源的。這些基因包括例如但不限于小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶；和植物乙酰乳酸合酶。參見eichholtz等(1987)somaticcellmol.genet.13:67；shah等(1986)science233:478；及charest等(1990)plantcellrep.8:643。另一類適合于植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物基因可以需要篩選據(jù)推測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，而不對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接遺傳選擇對(duì)毒性物質(zhì)諸如抗生素的抗性。這些基因特別可用于量化或顯現(xiàn)基因在特定組織中表達(dá)的空間樣式，并且通常稱為“報(bào)告基因”，因?yàn)樗鼈兛梢耘c基因或基因調(diào)節(jié)序列融合以調(diào)查基因表達(dá)。通常用于篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)；β-半乳糖苷酶；螢光素酶；和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。參見jefferson(1987)plantmol.biol.rep.5:387；teeri等(1989)emboj.8:343；koncz等(1987)proc.natl.acad.sciu.s.a.84:131；及deblock等(1984)emboj.3:1681。最近，已經(jīng)可獲得用于顯現(xiàn)gus活性的體內(nèi)方法，其不需要破壞植物組織。molecularprobespublication2908(1993)imagenegreentm,第1頁(yè)-第4頁(yè)；及naleway等(1991)j.cellbiol.115:151a。新近，已經(jīng)利用編碼熒光蛋白(例如，gfp,egfp,ebfp,ecfp和yfp)的基因作為原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的標(biāo)志物。參見chalfie等(1994)science263:802。如此，熒光蛋白和熒光蛋白的突變?cè)谝恍?shí)施方案中可以作為可篩選標(biāo)志物使用。用于經(jīng)由納米顆粒攝取的表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子表達(dá)載體中包含的基因可以由包含調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)的核苷酸序列驅(qū)動(dòng)。數(shù)種類型的啟動(dòng)子現(xiàn)在是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，可以單獨(dú)使用或者與啟動(dòng)子聯(lián)合使用的其它調(diào)節(jié)元件也是如此。啟動(dòng)子是可以在轉(zhuǎn)錄起始的上游的dna區(qū)域，而且可以牽涉識(shí)別和結(jié)合rna聚合酶和/或其它蛋白質(zhì)以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄?！爸参飭?dòng)子”可以是能夠在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的例子包括優(yōu)先在某些組織諸如葉；根；種子；纖維；木質(zhì)部導(dǎo)管；管胞；或厚壁組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子稱為“組織優(yōu)選性的”。僅在某些組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱為“組織特異性的”。“細(xì)胞類型”特異性啟動(dòng)子主要在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)表達(dá)。“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子可以是可在環(huán)境控制下的啟動(dòng)子?？烧兄抡T導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括但不限于缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選性的、細(xì)胞類型特異性的、和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成“非組成性”啟動(dòng)子類?！敖M成性”啟動(dòng)子是可在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動(dòng)子。1.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，可以將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而升高。可以在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。參見ward等(1993)plantmol.biol.22:361-366。例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于：那些響應(yīng)銅的acei系統(tǒng)的啟動(dòng)子(mett等(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:4567-71)；響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的in2基因(hershey等(1991)mol.gengenetics227:229-237；及gatz等(1994)mol.gen.genetics243:32-38)；和來自tn10的tet阻抑物(gatz等(1991)mol.gen.genetics227:229-237)。特別有用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是響應(yīng)植物正常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子。此類例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是來自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性可以受糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。schena等(1991)proc.natl.acad.sci.u.s.a.88:0421。2.組成性啟動(dòng)子可以將組成性啟動(dòng)子與細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接，或者可以將組成性啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)施方案中利用不同的組成性啟動(dòng)子。例示性的組成性啟動(dòng)子包括但不限于：來自植物病毒的啟動(dòng)子，諸如來自camv的35s啟動(dòng)子(odell等(1985)nature313:810-812)；來自稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子(mcelroy等(1990)plantcell2:163-171)；來自泛素的啟動(dòng)子(christensen等(1989)plantmol.biol.12:619-632及christensen等(1992)plantmol.biol.18:675-689)；來自pemu的啟動(dòng)子(last等(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；來自mas的啟動(dòng)子(velten等(1984)emboj.3:2723-2730)；和來自玉米h3組蛋白的啟動(dòng)子(lepetit等(1992)mol.gen.genetics231:276-285及atanassova等(1992)plantjournal2(3):291-300)；和als啟動(dòng)子，即歐洲油菜(brassicanapus)als3結(jié)構(gòu)基因5’的xba1/ncoi片段(或與所述xba1/ncoi片段的核苷酸序列相似性)。參見國(guó)際pct公開文本wo96/30530。3.組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子可以將組織特異性啟動(dòng)子與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，可以將組織特異性啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。用與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的感興趣基因轉(zhuǎn)化的植物可以專門或優(yōu)先在特定組織中生成轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)施方案中利用任何組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子。例示性組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子包括但不限于：根優(yōu)選性啟動(dòng)子，例如來自菜豆蛋白基因的啟動(dòng)子(murai等(1983)science23:476-82及sengupta-gopalan等(1985)proc.natl.acad.sci.u.s.a.82:3320-4)；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如來自cab或1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的啟動(dòng)子(simpson等(1985)emboj.4(11):2723-2729及timko等(1985)nature318:579-82)；花藥特異性啟動(dòng)子，例如來自lat52的啟動(dòng)子(twell等(1989)mol.gen.genetics217:240-5)；花粉特異性啟動(dòng)子，例如來自zm13的啟動(dòng)子(guerrero等(1993)mol.gen.genetics244:161-8)；和小孢子優(yōu)選性啟動(dòng)子，例如來自apg的啟動(dòng)子(twell等(1993)sex.plantreprod.6:217-24)?？梢砸揽繉⒕幋a信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因的5’和/或3’區(qū)域來實(shí)現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因生成的蛋白質(zhì)向亞細(xì)胞區(qū)室諸如葉綠體；液泡；過氧化物酶體；乙醛酸循環(huán)體；細(xì)胞壁；或線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)或者分泌入質(zhì)外體中。在基因的5’和/或3’端的靶向序列可以例如在蛋白質(zhì)合成和加工過程中決定編碼的蛋白質(zhì)最后可以在何處區(qū)室化(compartmentalized)?；蛘?，可以將此類亞細(xì)胞區(qū)室靶向性蛋白質(zhì)與納米顆粒直接連接以將用感興趣的分子包被的納米顆粒引導(dǎo)至期望的亞細(xì)胞區(qū)室。信號(hào)序列的存在可以將多肽引導(dǎo)至胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室，或者分泌至質(zhì)外體。許多信號(hào)序列是本領(lǐng)域中已知的。參見例如becker等(1992)plantmol.biol.20:49；close,p.s.,master’sthesis,iowastateuniversity(1993),knox等(1987)plantmol.biol.9:3-17；lerner等(1989)plantphysiol.91:124-9；fontes等(1991)plantcell3:483-96；matsuoka等(1991)proc.natl.acad.sci.u.s.a.88:834；gould等(1989)j.cell.biol.108:1657；creissen等(1991)plantj.2:129；kalderon等(1984)cell39:499-509；steifel等(1990)plantcell2:785-93。外來蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝學(xué)基因依照本發(fā)明的實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因植物可以以商業(yè)量生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)。如此，用于選擇和繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，它們以常規(guī)方式收獲。然后可以從感興趣的組織或總生物質(zhì)提取外來蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^由例如heney和orr(1981)anal.biochem.114:92-6所討論的已知方法來實(shí)現(xiàn)從植物生物質(zhì)的蛋白質(zhì)提取。在本發(fā)明的一些方面，為商業(yè)生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)提供的植物材料可以是植物、植物組織、或組織細(xì)胞。在一些方面，感興趣的生物質(zhì)可以是植物種子。對(duì)于顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以例如經(jīng)由常規(guī)的rflp、pcr和ssr分析(其鑒定整合dna分子的近似染色體位置)來產(chǎn)生遺傳圖譜。關(guān)于這方面的例示性方法，參見glick和thompson,methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnologycrcpress,bocaraton269:284(1993)。例如，關(guān)于染色體位置的圖譜信息對(duì)于主題轉(zhuǎn)基因植物的所有權(quán)保護(hù)或者對(duì)于安全性評(píng)估可以是有用的。如果可以進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖和與其它種質(zhì)進(jìn)行雜交，則可以將整合區(qū)域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較以確定后者是否與主題植物具有共同親本(parentage)。圖譜比較可以牽涉雜交、rflp、pcr、ssr和測(cè)序，它們都是常規(guī)技術(shù)。同樣地，可以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其后代中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體地，可以經(jīng)由本發(fā)明的方法對(duì)植物進(jìn)行遺傳工程化改造以表達(dá)農(nóng)藝學(xué)感興趣的各種表型?？梢栽谶@方面使用的例示性基因包括但不限于下文進(jìn)行歸類的基因。1.賦予對(duì)害蟲或疾病的抗性的基因：a)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(r)產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)無毒力(avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種以工程化改造對(duì)特定病原體株有抗性的植物。參見例如jones等(1994)science266:789(克隆對(duì)黃枝孢霉(cladosporiumfulvum)有抗性的番茄cf-9基因)；martin等(1993)science262:1432(對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種(pseudomonassyringaepv.tomato)有抗性的番茄pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；mindrinos等(1994)cell78:1089(對(duì)丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)有抗性的rsp2基因)。b)對(duì)害蟲諸如大豆胞囊線蟲賦予抗性的基因。參見例如國(guó)際pct公開文本wo96/30517；及國(guó)際pct公開文本wo93/19181。c)蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)蛋白、其衍生物或以其為模型的合成多肽。參見例如geiser等(1986)gene48:109(btδ-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列)。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的dna分子可以購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection，manassas,va)，例如以atcc保藏號(hào)40098；67136；31995；和31998購(gòu)得。d)凝集素。參見例如vandamme等(1994)plantmolec.biol.24:25(數(shù)種君子蘭(cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列)。e)維生素結(jié)合蛋白，例如抗生物素蛋白。參見國(guó)際pct公開文本us93/06487(抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對(duì)蟲害的殺幼蟲劑的用途)。f)酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如abe等(1987)j.biol.chem.262:16793(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制劑的核苷酸序列)；huub等(1993)plantmolec.biol.21:985(編碼煙草蛋白水解酶抑制劑i的cdna的核苷酸序列)；sumitani等(1993)biosci.biotech.biochem.57:1243(硝孢鏈霉菌(streptomycesnitrosporeus)alpha-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)和美國(guó)專利no.5,494,813。g)昆蟲特異性激素或信息素，例如蛻皮類固醇或保幼激素，其變體、基于其的模擬物、或其拮抗劑或激動(dòng)劑。參見例如hammock等(1990)nature344:458(克隆的保幼激素酯酶(即一種保幼激素滅活劑)的桿狀病毒表達(dá))。h)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受到影響的害蟲的生理學(xué)。例如參見regan(1994)j.biol.chem.269:9(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的dna)；和pratt等(1989)biochem.biophys.res.comm.163:1243(可以在太平洋折翅蠊(diplopterapuntata)中鑒定出咽側(cè)體抑制素(allostatin))。還可參見美國(guó)專利no.5,266,317(編碼昆蟲特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因)。i)在自然界由蛇、黃蜂(wasp)或任何其它生物體生成的昆蟲特異性毒液。例如參見pang等(1992)gene116:165(編碼蝎昆蟲毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá))。j)酶，其負(fù)責(zé)超積累單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯丙烷衍生物或另一具有殺昆蟲活性的非蛋白質(zhì)分子。k)牽涉對(duì)生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶，例如，糖酵解酶；蛋白水解酶；脂肪分解酶；核酸酶；環(huán)化酶；轉(zhuǎn)氨酶；酯酶；水解酶；磷酸酶；激酶；磷酸化酶；聚合酶；彈性蛋白酶；殼多糖酶(chitinase)；或葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見國(guó)際pct公開文本wo93/02197(callase基因的核苷酸序列)。含有殼多糖酶編碼序列的dna分子可以例如從atcc以保藏號(hào)39637和67152獲得。還可參見kramer等(1993)insectbiochem.molec.biol.23:691(編碼煙草天蛾殼多糖酶的cdna的核苷酸序列)；和kawalleck等(1993)plantmolec.biol.21:673(歐芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)。l)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見botella等(1994)plantmolec.biol.24:757(關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列)；和griess等(1994)plantphysiol.104:1467(玉米鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列)。m)疏水矩肽(hydrophobicmomentpeptide)。參見國(guó)際pct公開文本wo95/16776(抑制真菌植物病原體的鱟抗菌肽(tachyplesin)的肽衍生物的公開內(nèi)容)；和國(guó)際pct公開文本wo95/18855(賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。n)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見jaynes等(1993)plantsci89:43(殺菌肽-β溶胞肽類似物(cecropin-βlyticpeptideanalog)的異源表達(dá)以使轉(zhuǎn)基因煙草植物對(duì)青枯假單胞菌(pseudomonassolanacearum)有抗性。o)病毒侵入蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的積累賦予對(duì)由可衍生出該外殼蛋白基因的病毒及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見beachy等(1990)ann.rev.phytopathol.28:451。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予了針對(duì)苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯x病毒、馬鈴薯y病毒、煙草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。p)昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功能的抗體可以使受影響的酶失活，這殺死昆蟲。參見taylor等,摘要#497,seventhint’lsymposiumonmolecularplant-microbeinteractions(edinburgh,scotland)(1994)(經(jīng)由生成單鏈抗體片段進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因煙草中的酶促失活)。q)病毒特異性抗體。參見例如tavladoraki等(1993)nature366:469(表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)免于病毒攻擊)。r)在自然界由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌內(nèi)α-l,4-d-多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁同-α-1,4-d-半乳糖醛酸酶(galacturonase)來促進(jìn)真菌定殖(colonization)和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。參見lamb等(1992)bio/technology10:1436。還可見toubart等(1992)plantj.2:367(編碼豆內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征)。s)在自然界由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如logemann等(1992)bio/technology10:305(表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌疾病具有升高的抗性)。2.賦予對(duì)除草劑的抗性的基因：a)抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，例如咪唑啉酮或磺酰脲。在這類中的例示性基因編碼突變體als和ahas酶，如分別由例如lee等(1988)emboj.7:1241，及miki等(1990)theor.appl.genet.80:449所描述的。b)草甘膦抗性(分別由例如突變體5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(epsp)基因(經(jīng)由導(dǎo)入重組核酸和/或天然epsp基因的體內(nèi)誘變的各種形式)；aroa基因和草甘膦乙?；D(zhuǎn)移酶(gat)基因賦予)；其它膦?；衔镏T如草銨膦(glufosinate)(來自鏈霉菌屬物種(streptomycesspecies)，包括吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)和綠色產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesviridichromogenes)的膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(pat)基因)；和吡啶氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(acc酶抑制劑編碼基因)。見例如美國(guó)專利no.4,940,835；和美國(guó)專利6,248,876(可以對(duì)植物賦予草甘膦抗性的epsp形式的核苷酸序列)。編碼突變體aroa基因的dna分子可以以atcc保藏號(hào)39256獲得，還可見美國(guó)專利no.4,769,061(突變體aroa基因的核苷酸序列)。歐洲專利申請(qǐng)no.0333033和美國(guó)專利no.4,975,374披露了對(duì)除草劑諸如l-膦絲菌素賦予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。例示性pat基因的核苷酸序列可以在歐洲申請(qǐng)no.0242246,及degreef等(1989)bio/technology7:61(生成表達(dá)編碼pat活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物)中提供。賦予對(duì)苯氧基丙酸和環(huán)己酮，諸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括marshall等(1992)theor.appl.genet.83:435描述的acc1-s1、acc1-s2和acc1-s3基因。能夠賦予草甘膦抗性的gat基因記載于例如wo2005012515。賦予對(duì)2,4-d、fop和吡啶基氧基生長(zhǎng)素除草劑的抗性的基因記載于例如wo2005107437。c)抑制光合作用的除草劑，諸如三嗪(psba和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。見例如przibila等(1991)plantcell3:169(用編碼突變體的psba基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣滴蟲(chlamydomonas))。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于美國(guó)專利no.4,810,648，并且含有這些基因的dna分子可以以atcc保藏號(hào)53435；67441；和67442獲得。還可見hayes等(1992)biochem.j.285:173(編碼谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶的dna的克隆和表達(dá))。3.賦予或促成增值(value-added)性狀的基因，諸如：a)經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-acp去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以提高植物的硬脂酸含量。參見knultzon等(1992)proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:2624。b)降低的肌醇六磷酸鹽含量。肌醇六磷酸酶編碼基因的導(dǎo)入會(huì)增強(qiáng)肌醇六磷酸鹽的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多游離的磷酸鹽。例如，參見vanhartingsveldt等(1993)gene127:87(黑曲霉(aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列)?？梢詫?dǎo)入基因以降低肌醇六磷酸鹽含量。例如在玉米中，這可以如下實(shí)現(xiàn)，即克隆與單一等位基因有關(guān)的dna，然后再次導(dǎo)入，所述單一等位基因可以負(fù)責(zé)特征為低水平肌醇六磷酸的玉米突變體。參見raboy等(1990)maydica35:383。c)例如通過用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來實(shí)現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳水化合物組成。參見例如shiroza等(1988)j.bacteol.170:810(鏈球菌(streptococcus)突變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)；steinmetz等(1985)mol.gen.genet.20:220(果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因)；pen等(1992)bio/technology10:292(α-淀粉酶)；elliot等(1993)plantmolec.biol.21:515(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；sogaard等(1993)j.biol.chem.268:22480(大麥α-淀粉酶基因)；及fisher等(1993)plantphysiol.102:1045(玉米胚乳淀粉分支酶ii)。c.納米顆粒依照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了將感興趣的線性核酸分子導(dǎo)入包含細(xì)胞壁的細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)中的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法可以包括將用感興趣的線性核酸分子包被的納米顆粒與細(xì)胞置于接觸中，并且容許納米顆粒穿過細(xì)胞壁的攝取。在具體的實(shí)施方案中，納米顆?？梢钥赡娴鼗虿豢赡娴睾?、包被有、或以其它方式結(jié)合和/或攜帶感興趣的線性核酸分子。在某些實(shí)施方案中，可以將感興趣的線性核酸分子在與具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞接觸前或與將納米顆粒導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞同時(shí)引入納米顆粒。可以在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的納米顆粒的例子包括但不限于單獨(dú)的或與半導(dǎo)體納米顆粒、帶正電荷的納米顆粒；金納米顆粒；金包被的納米顆粒；多孔性納米顆粒；中孔性納米顆粒；硅土納米顆粒；聚合物納米顆粒，包括樹枝狀聚合物；鎢納米顆粒；明膠納米顆粒；納米殼；納米核心；納米球；納米棒；和磁性納米微粒組合的量子點(diǎn)。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞可以是包含完整且整個(gè)細(xì)胞壁的任何植物細(xì)胞。具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的例子包括但不限于：藻；煙草；胡蘿卜；玉蜀黍；蕓苔；油菜籽；棉；棕櫚；花生；大豆；甘蔗；稻屬物種(oryzasp.)；擬南芥屬物種(arabidopsissp.)；和蓖麻屬物種(ricinussp.)。本發(fā)明的實(shí)施方案可以包括來自任何組織或發(fā)現(xiàn)其的任何地方，包括但不限于：在胚；分生細(xì)胞；愈傷組織；花粉，包括單倍體和雙單倍體小孢子；葉；花藥；根；根尖；花；種子；莢果；莖；和組織培養(yǎng)物中的包含細(xì)胞壁的細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，感興趣的線性核酸分子可以是任何核酸分子，其可以投遞至依照本發(fā)明的具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。感興趣的核酸分子可以包含但不限于：dna；rna；rnai分子；基因；質(zhì)粒；粘粒；yac；和bac?？梢詫⒏信d趣的核酸分子與例如但不限于：多肽；酶；激素；糖肽；糖；脂肪；信號(hào)傳導(dǎo)肽；抗體；維生素；信使；第二信使；氨基酸；camp；藥物；除草劑；殺真菌劑；抗生素；和/或其組合同時(shí)導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，可以將納米顆粒的表面官能化(functionalized)，這可以例如容許靶向性攝取或者容許將其它物質(zhì)可逆或不可逆地結(jié)合至納米顆粒的表面。作為非限制性例子，可以用例如烷烴硫醇鹽(alkanethiolate)的自身裝配單層官能化納米顆粒(例如，量子點(diǎn))的表面，所述烷烴硫醇鹽可以進(jìn)一步官能化或衍生化。在又一個(gè)非限制性例子中，可以用接頭衍生化納米顆粒的表面，所述接頭自身可以進(jìn)一步官能化或衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將納米顆粒進(jìn)行peg化。在其它實(shí)施方案中，納米顆?？梢园铝幸环N或多種，或者可以用下列一種或多種多官能化：核心(活性或無活性)、空間外層(stericcoat)(活性或惰性)、可切割連接；和/或靶向分子或配體?？梢允褂胐ubertret等(2002)science298:1759的方案；或者通過依照熟練技術(shù)人員的判斷自其修改的方案用peg官能化納米顆粒，諸如量子點(diǎn)。例如，可以將經(jīng)topo(三辛基氧膦(tri-octylphosphineoxide))包被的cdse/zns量子點(diǎn)用氯仿中的peg-pe懸浮，接著蒸發(fā)溶劑，并用水溶解所得的peg化的量子點(diǎn)。在本發(fā)明的各方面中，可以將納米顆粒吸收入細(xì)胞的各部分中?？梢晕盏募{米顆粒的位置的例子包括但不限于：胞質(zhì)溶膠；細(xì)胞核；液泡形成體；質(zhì)體；黃化質(zhì)體；色質(zhì)體；白色體；油質(zhì)體；蛋白質(zhì)體；造粉體；葉綠體；和雙層膜的腔。在其它實(shí)施方案中，可以經(jīng)由共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑發(fā)生納米顆粒攝取入包含細(xì)胞壁的細(xì)胞中。d.穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞依照本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以是能夠通過納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用感興趣的線性核酸分子轉(zhuǎn)化的任何植物細(xì)胞。因而，可以自雙子葉植物或單子葉植物分離或培養(yǎng)植物細(xì)胞。植物細(xì)胞也可以存在于植物組織或全植物中。依照本發(fā)明的來自雙子葉植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的非限制性例子包括：苜蓿；菜豆(bean)；花莖甘藍(lán)(broccoli)；甘藍(lán)(cabbage)；胡蘿卜；花椰菜(cauliflower)；芹菜；白菜(chinesecabbage)；棉；黃瓜；茄子；萵苣；甜瓜(melon)；豌豆(pea)；胡椒(pepper)；花生；馬鈴薯；南瓜(pumpkin)；蘿卜；油菜籽；菠菜；大豆；南瓜(squash)；甜菜；向日葵；煙草；番茄；和西瓜，依照本發(fā)明的來自單子葉植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的非限制性例子包括：玉米；洋蔥；稻；高粱；小麥；黑麥；黍(millet)；甘蔗；燕麥；小黑麥(triticale)；柳枝稷；和草地草(turfgrass)。可以自通過本發(fā)明的方法生成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生依照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。可以以任何方式使用或栽培此類植物，其中感興趣的核酸分子的存在是期望的。因而，可以通過經(jīng)由納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用線性核酸分子轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)基因植物工程化改造為具有一種或多種期望的性狀，等等，并通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法種植并栽培。提供以下實(shí)施例以例示某些具體的特征和/或?qū)嵤┓桨?。?shí)施例不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限于例示的具體特征或?qū)嵤┓桨?。?shí)施例實(shí)施例1：制備納米顆粒以轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞質(zhì)粒dna的制備將pdab3831質(zhì)粒dna(圖1)分離并制備以進(jìn)行線性dna/peg化的量子點(diǎn)(pqd)介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。此質(zhì)粒含有由擬南芥泛素10啟動(dòng)子(atubi10)驅(qū)動(dòng)的pat選擇標(biāo)志基因和由木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(csvmv)驅(qū)動(dòng)的杯水母(philadium)黃色熒光蛋白基因(phiyfp)。將含有所述質(zhì)粒的大腸桿菌(escherichiacoli)菌株接種，并在含有氨芐青霉素的luria-bertani培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)至混濁。使用qiagen質(zhì)粒midi-prep試劑盒(qiagen,valencia,ca)分離dna。經(jīng)由限制性酶消化線性化分離的dna。使用限制酶kpni消化dna，由此生成線性化的質(zhì)粒dna。線性dna-pqd復(fù)合物的形成量子點(diǎn)獲自oceannanotechnology(springdale,az)。將2mg經(jīng)topo(三辛基氧膦)包被的cdse/zns量子點(diǎn)用氯仿中的0.15gm(5.5umol)peg-pe(1.2-二?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基-聚(乙二醇)])(avantipolarlipids,alabaster,al)懸浮，接著蒸發(fā)溶劑，并用水溶解。完成peg綴合以針對(duì)細(xì)胞毒性提供保護(hù)。將pqd與線性質(zhì)粒dna綴合。將2mgpqd于約60-70℃用4mghs-peg-och3(prochimia,zacisze,poland)懸浮過夜。將溶劑在真空烘箱中除去。然后，將殘余在1ml水(18m)中懸浮。最后一步伴隨著紅色殘余至橙色、光學(xué)澄清、透明溶液的變化。為了將線性化質(zhì)粒dna包被至h3co-pet-sh-qd上以進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將0.02mg純化的線性化質(zhì)粒dna(pdab3831)于23℃在黑暗中與2ml水中的所得pqd綴合物一起溫育2小時(shí)。torney等(2007)naturenanotechnol.2:295-300。實(shí)施例2：轉(zhuǎn)化擬南芥芽對(duì)于植物內(nèi)遺傳轉(zhuǎn)化，用kpni限制酶消化pdab3831質(zhì)粒以線性化dna。在限制酶消化后，在特定比率的peg、qd、和線性dna中使用線性化dna。將線性化dna與量子點(diǎn)、peg混合，并溫育30分鐘。然后，將由納米顆粒和線性化質(zhì)粒dna溶液組成的納米復(fù)合物與在含0.02-0.04％silwet-l77的水中具有5％蔗糖溶液的工作溶液混合。供植物內(nèi)轉(zhuǎn)化的植物材料種子的同步萌發(fā)對(duì)于確保t0植物中花形成的一致性是重要的。將擬南芥哥倫比亞栽培種種子在0.1％(w/v)瓊脂溶液中懸浮，并于4℃溫育48小時(shí)以完成分層。稱重60mg種子，并將其轉(zhuǎn)移至15ml管。添加13ml0.1％(w/v)瓊脂溶液，并旋渦振蕩，直至將種子均勻分散。這生成4.6mg種子/1ml0.1％(w/v)瓊脂溶液(或約230個(gè)種子/ml)的種子溶液濃度。制備6管(72ml溶液)以播種4個(gè)淺苗床，其在每個(gè)盤中含有18個(gè)(31/2英寸)盆。將種子溶液于4℃溫育48小時(shí)以完成分層。以每盆1.0ml分層種子溶液?jiǎn)为?dú)播種每個(gè)盆。在播種完所有盆時(shí)，將增殖罩(propagationdome)在盤上放置以保持土壤濕潤(rùn)。在播種日后5天除去該罩。將種子萌發(fā)，并將植物在(cmp4030和cmp3244型,controlledenvironmentslimited,winnipeg,manitoba,canada)中在長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下以120-150μmol/m2/sec的光強(qiáng)度在恒定的溫度(22℃)和濕度(40-50％)下培養(yǎng)。在播種植物后10至14天用霍格蘭(hoagland)氏溶液，隨后用di水給植物澆水，以保持土壤潤(rùn)而不濕。在播種日后4周后，將花切下以產(chǎn)生次生花(secondaryflower)的更均勻生長(zhǎng)。在播種后第5周中，將植物準(zhǔn)備好進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程。植物內(nèi)轉(zhuǎn)化使用來自clough和bent的修改方案來完成線性dna/pqd介導(dǎo)的擬南芥哥倫比亞栽培種轉(zhuǎn)化。clough和bent(1998)plantj.16:735-43。以0.5mg線性dna和4nmpqd的濃度用線性dna/pqd復(fù)合物溶液生成20ml懸浮液，并用于處理擬南芥植物(主要為未成熟的花簇及一些已受精的長(zhǎng)角果)。在浸漬植物前，將濃度0.05％(w/v)(250μl/500ml)-0.005％的silwetl-77添加至線性dna/pqd溶液，并充分混合。將植物的地上部分在線性dna/pqd溶液中浸漬30秒，期間溫和攪動(dòng)。將經(jīng)處理的植物在合規(guī)則的位置于22-24℃在陰影中放置30分鐘。將植物在如上文所描述的條件下轉(zhuǎn)移至convirons，并允許其生長(zhǎng)至成熟，并收集種子。使用選擇盤(10.5”x21”x1”盤)來篩選來自t0植物的大量收獲種子，每個(gè)盆上約10,000粒種子。使用兩個(gè)對(duì)照來確保正確地完成選擇噴霧；col-0陰性轉(zhuǎn)化體對(duì)照和摻入有在pat(膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶)選擇標(biāo)志方面純合的種子的哥倫比亞col-0野生型作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體對(duì)照。為了實(shí)現(xiàn)同步，將種子在播種前在0.1％(w/v)瓊脂溶液中分層48小時(shí)。為了提供每個(gè)選擇盤10,000粒種子，將200mg種子添加至0.1％(w/v)瓊脂溶液，并渦旋振蕩，直至將種子均勻地懸浮。然后，將分層的種子在用sunshine混合物lp5填充并用霍格蘭氏溶液在下灌溉(sub-irrigated)的選擇盤上播種。為了使選擇噴霧有效，重要的是，將40ml懸浮種子均勻地播種至選擇盤上。播種后，將增殖罩在每個(gè)選擇盤上放置，并種植植物以進(jìn)行選擇，在播種后約5天除去增殖罩。實(shí)施例3：對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的擬南芥的分析選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物容許新鮮收獲的t1種子于室溫干燥7天。將t1種子在26.5x51cm萌發(fā)盤中播種，每個(gè)萌發(fā)盤接受200mg等分試樣的分層t1種子(約10,000粒種子)，其先前已經(jīng)在40ml0.1％(w/v)瓊脂糖溶液中懸浮，并于4℃貯存2天以完成休眠需要并確保同步種子萌發(fā)。將sunshine混合物lp5用細(xì)蛭石覆蓋，并用霍格蘭氏溶液在下灌溉，直至潮濕，然后允許重力排水。用移液管將每個(gè)40ml等分試樣的分層種子均勻地播種至蛭石上，并用濕度罩覆蓋4-5天。除去罩，之后一天使用出現(xiàn)后草銨膦噴霧進(jìn)行初始轉(zhuǎn)化體選擇。種植后7天(dap)，使用每次應(yīng)用投遞有效率280gae/ha草銨膦的devilbiss壓縮空氣噴霧尖端用liberty除草劑(200gae/l草銨膦,bayercropsciences,kansascity,mo)的0.2％(w/v)溶液以噴霧體積10ml/盤(703l/ha)在5天內(nèi)將t1植物(分別為子葉和2-4-lf階段)噴霧5次。在最終的噴霧后4-7天鑒定存活者(活躍生長(zhǎng)的植物)，并個(gè)別地移植入用盆栽培養(yǎng)基(metromix360)制備的3英寸盆中。將移植的植物用濕度罩覆蓋3-4天，并如先前那樣在22℃生長(zhǎng)室中放置或直接移到溫室。隨后，將罩除去，并將植物在溫室(22±5℃,50±30％rh,14小時(shí)光照:10小時(shí)黑暗，最小值500μe/m2s1自然光+補(bǔ)充光)中培養(yǎng)。分子和生物化學(xué)分析對(duì)pat和yfp向植物基因組中的整合實(shí)施分子分析。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并與轉(zhuǎn)基因序列比較。在擬南芥(哥倫比亞栽培種)的t1后代中轉(zhuǎn)基因的基因組整合的分子分析和證據(jù)使用植物dnazoltm(invitrogen)依照制造商的用法說明書自六周齡植物的葉材料提取來自擬南芥轉(zhuǎn)基因植物的基因組dna。設(shè)計(jì)pcr引物以檢測(cè)yfp和pat轉(zhuǎn)基因。yfp引物以seqidno:1和seqidno:2呈現(xiàn)。pat引物以seqidno:3和seqidno:4呈現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因的gdnapcr擴(kuò)增使用takaraextaqtm試劑盒(takara,otsu,shiga,japan)來完成pat和yfp的pcr擴(kuò)增反應(yīng)。將基因產(chǎn)物在50μl的總反應(yīng)體積中擴(kuò)增。pcr反應(yīng)含有100ng基因組dna模板、1xextaq反應(yīng)緩沖液、0.2mmdntp、10pmol每種引物、和0.025個(gè)單位/μlextaq。使用以下pcr條件：于96℃持續(xù)5分鐘的1個(gè)循環(huán)和下列條件的31個(gè)循環(huán)：94℃達(dá)15秒，65℃達(dá)30秒，72℃達(dá)1分鐘，及72℃達(dá)7分鐘的最終延伸。將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物通過0.8％tae瓊脂糖凝膠電泳分析，并通過溴化乙啶染色顯現(xiàn)。使用qiaextmii凝膠純化試劑盒(qiagen,valencia,ca)自瓊脂糖凝膠純化dna片段。使用先進(jìn)的sanger測(cè)序技術(shù)(mwgbiotech,huntsville,al)使用pat正向引物(seqidno:3)和yfp反向引物(seqidno:1)來對(duì)pcr片段測(cè)序。使用sequencher軟件來分析序列數(shù)據(jù)。pat和yfppcr擴(kuò)增子的測(cè)序結(jié)果與這些基因預(yù)期的核苷酸序列匹配。這些結(jié)果清楚指示使用peg化的量子點(diǎn)和線性dna轉(zhuǎn)化方案將來自pdab3831的pat和yfp序列穩(wěn)定整合入擬南芥的gdna中。將pat和yfp(黃色熒光標(biāo)簽,evrogen)基因產(chǎn)物的pcr在50μl總反應(yīng)體積的混合物中擴(kuò)增，所述混合物含有100ng基因組模板dna、1xextaq反應(yīng)緩沖液(takarabio)、0.2mmdntp、10pmol引物、和0.025個(gè)單位/μlextaq。使用如下的pcr條件：于96c持續(xù)5分鐘的1個(gè)循環(huán)和以下pcr程序的31個(gè)循環(huán)：94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，1分鐘。于72℃實(shí)施最終的延伸達(dá)7分鐘以完成pcr產(chǎn)物合成。使用bioradgel成像系統(tǒng)獲得凝膠圖像。圖1和2。使用凝膠純化試劑盒(qiageninc.)依照制造商的用法說明書將擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠純化。使用先進(jìn)的sanger測(cè)序技術(shù)(mwgbiotechnologies,inc.)使用pat正向引物和yfp正向引物來對(duì)pcr片段測(cè)序，并使用sequencher軟件(公司)來分析序列。本結(jié)果清楚地指示經(jīng)由實(shí)施例1中帶正電荷的納米顆粒介導(dǎo)的線性化dna投遞來投遞的pat和yfp序列，并且如此提供轉(zhuǎn)基因在擬南芥t1植物的基因組dna中的穩(wěn)定基因組整合的證據(jù)。實(shí)施例4：納米顆粒介導(dǎo)的將線性核酸分子投遞至培養(yǎng)的植物細(xì)胞制備單細(xì)胞植物材料。例如，使用by2細(xì)胞和nt1細(xì)胞兩者。by2細(xì)胞是一種非綠色、快速生長(zhǎng)的煙草細(xì)胞系。nt1細(xì)胞是自煙草分離的光合自養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化前3至4天，通過將2mlnt1或by2培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至250ml燒瓶中含有50nmdas-pmti-1(微管抑制劑)和0.5-0.1％(v/v)dmso的40mlnt1b或lsby2培養(yǎng)基中來將1周齡懸浮培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)至新鮮的培養(yǎng)基。在微管抑制劑處理后4天或7天時(shí)收集單細(xì)胞。將使用的by2單細(xì)胞經(jīng)由beckman流式細(xì)胞儀加工以對(duì)活細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用與共聚焦成像系統(tǒng)附接的微分干涉相差(dic)顯微鏡檢查細(xì)胞以測(cè)定單細(xì)胞包含遍及細(xì)胞胞質(zhì)分布的大量質(zhì)體(造粉體)。通過轉(zhuǎn)移3.0od600的1ml懸浮液來將細(xì)胞以每14天傳代培養(yǎng)一次。使用培養(yǎng)的細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。納米顆粒制備和細(xì)胞處理將質(zhì)粒dna分離，并制備以進(jìn)行線性dna/peg化的量子點(diǎn)(pqd)介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒含有由擬南芥泛素10啟動(dòng)子(atubi10)驅(qū)動(dòng)的pat選擇標(biāo)志基因和由木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(csvmv)驅(qū)動(dòng)的杯水母黃色熒光蛋白基因(phiyfp)。將含有所述質(zhì)粒的大腸桿菌菌株接種，并在含有氨芐青霉素的luria-bertani培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)至混濁。使用qiagen質(zhì)粒midi-prep試劑盒(qiagen,valencia,ca)分離dna。經(jīng)由限制性酶消化線性化分離的dna。使用限制酶kpni消化dna，由此生成線性化的質(zhì)粒dna量子點(diǎn)獲自oceannanotechnology(springdale,az)。將2mg經(jīng)topo(三辛基氧膦)包被的cdse/zns量子點(diǎn)用氯仿中的0.15gm(5.5umol)peg-pe(1.2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基-聚(乙二醇)])(avantipolarlipids,alabaster,al)懸浮，接著蒸發(fā)溶劑，并用水溶解。完成peg綴合以針對(duì)細(xì)胞毒性提供保護(hù)。將pqd與線性質(zhì)粒dna綴合。將2mgpqd于約60-70℃用4mghs-peg-och3(prochimia,zacisze,poland)懸浮過夜。將溶劑在真空烘箱中除去。然后，將殘余在1ml水(18m)中懸浮。最后一步伴隨著紅色殘余至橙色、光學(xué)澄清、透明溶液的變化。為了將線性化質(zhì)粒dna包被至h3co-pet-sh-qd上以進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將0.02mg純化的線性化質(zhì)粒dna(pdab3831)于23℃在黑暗中與2ml水中的所得pqd綴合物一起溫育2小時(shí)。torney等(2007)naturenanotechnol.2:295-300。將1-3μl/ml濃度pqd添加至24孔微量滴定板中的500μl細(xì)胞，并在黑暗中在搖動(dòng)器上溫和旋轉(zhuǎn)20分鐘。將納米顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞壁。實(shí)施例5：多官能化納米顆粒介導(dǎo)的擬南芥植物內(nèi)轉(zhuǎn)化可以使用自clough和bent,1998修改的方案實(shí)施擬南芥的植物內(nèi)轉(zhuǎn)化。優(yōu)化與歸巢蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(ptd)和nls單元的分子一起的多官能化納米顆粒上的dna的濃度以實(shí)現(xiàn)增加的轉(zhuǎn)化效率。植物材料：將健康的擬南芥植物在長(zhǎng)日照下在盆中在土壤中培養(yǎng)，直至開花。將第一次抽苔物(firstbolt)剪下以促進(jìn)許多次生抽苔物(secondarybolt)增殖。剪下后大約4-6天準(zhǔn)備好植物。選擇擬南芥哥倫比亞(col-0)生態(tài)型作為花植物內(nèi)轉(zhuǎn)化的背景(t0植物)。種子的同步萌發(fā)對(duì)于確保t0植物中花形成的一致性是重要的。將野生型種子在0.1％瓊脂溶液中懸浮，并于4℃溫育48小時(shí)以完成分層。在稱重紙上稱重60mg種子，并將其轉(zhuǎn)移至15ml管。添加13ml0.1％瓊脂溶液，并旋渦振蕩，直至將種子均勻分散。這生成4.6mg種子/1ml溶液(或約230個(gè)種子/ml)的濃度。制備6管(72ml溶液)以播種在每個(gè)盤中含有18個(gè)(31/2英寸)盆的4個(gè)淺苗床，并播種總共2個(gè)盆。將溶液于4℃溫育48小時(shí)以完成分層。以每盆1.0ml分層種子溶液?jiǎn)为?dú)播種每個(gè)盆。在播種完所有盆時(shí)，將增殖罩在盤上放置以保持土壤濕潤(rùn)。在播種日后5天除去該罩。將種子萌發(fā)，并將植物在(cmp4030和cmp3244型,controlledenvironmentslimited,winnipeg,manitoba,canada)中在長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下以120-150μmol/m2/sec的光強(qiáng)度在恒定的溫度(22℃)和濕度(40-50％)下培養(yǎng)。在播種植物后10至14天用霍格蘭(hoagland)氏溶液，隨后用di水給植物澆水，以保持土壤潤(rùn)而不濕。在播種日后4周后，將花切下以產(chǎn)生次生花(secondaryflower)的更均勻生長(zhǎng)。在播種后第5周中，將植物準(zhǔn)備好進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程。納米綴合物制備以進(jìn)行花處理：選擇2-120nm大小范圍的納米顆粒/量子點(diǎn)進(jìn)行處理，并將其用片段純化的pdab3138和歸巢肽單元依照derufus等(2007)多官能化。具有655或705nm的發(fā)射最大值并用peg和氨基修飾的量子點(diǎn)獲自quantumdotcorporation(itk氨基)。使用由供應(yīng)商提供的消光系數(shù)通過595nm的光學(xué)吸光度測(cè)量qd濃度。使用的交聯(lián)劑是sulfo-lc-spdp(磺基琥珀酸亞氨基6-(3’-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸鹽)(pierce)和sulfo-smcc(磺基琥珀酸亞氨基4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)已烷-1-羧酸鹽)(sigma)。使用sulfo-lc-spdp和sulfo-smcc交聯(lián)劑將經(jīng)氨基修飾的qd與含有硫醇的質(zhì)粒dna和歸巢肽綴合。使用amiconultra-4(100kda截留)濾器，將qd在50mm磷酸鈉、150mm氯化鈉，ph7.2中重懸。將交聯(lián)劑(1000倍過量)添加至qd，并容許起反應(yīng)達(dá)1小時(shí)。將樣品在nap-5重力柱(以除去過量的交聯(lián)劑)上過濾，進(jìn)入補(bǔ)充有10mmedta的類似緩沖液中。將線性化的質(zhì)粒dna，即pdab3831用0.1mdtt處理1小時(shí)，并在nap-5柱上過濾，進(jìn)入含有edta的緩沖液中。通常，自凍干粉末使用肽。將肽和線性化的質(zhì)粒dna添加至經(jīng)過濾的qd，并容許于4℃起反應(yīng)過夜。使用三個(gè)amicon濾器，將產(chǎn)物用dulbecco氏磷酸鹽緩沖液鹽水(pbs)過濾兩次，用高鹽緩沖液(1.0m氯化鈉、100mm檸檬酸鈉，ph7.2)過濾兩次，并用pbs再過濾兩次。需要高鹽清洗以除去靜電結(jié)合的dna和肽，其僅用pbs清洗沒有除去。sulfo-smcc具有在一端的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)酯(其與經(jīng)氨基修飾的qd起反應(yīng)以形成酰胺鍵)和在另一端的馬來酰亞胺基團(tuán)(其與硫醇化(thiolated)的質(zhì)粒dna起反應(yīng)以形成硫醚)。sulfo-lc-spdp也含有氨基反應(yīng)性n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)酯，其與任何含有伯胺的分子快速起反應(yīng)，由此形成穩(wěn)定的酰胺鍵。植物內(nèi)轉(zhuǎn)化并篩選t1抗性植物：用納米顆粒、歸巢肽和質(zhì)粒dna(nhpd)綴合物溶液生成終體積250-500ml懸浮液，然后使用擬南芥植物(主要為未成熟的花簇及一些已受精的長(zhǎng)角果)進(jìn)行處理。在浸漬植物前，將濃度0.05％(250μl/500ml)-0.005％的silwetl-77添加至nhpd綴合物溶液，并充分混合。將植物的地上部分在nhpd綴合物溶液中浸漬2至30秒，期間溫和攪動(dòng)。將經(jīng)處理的植物在罩或覆蓋物下于22-24℃放置16至24小時(shí)。將植物轉(zhuǎn)移至convirons，并允許其生長(zhǎng)至成熟，并收集種子。使用選擇盤(10.5”x21”x1”盤)來篩選來自t0植物的大量收獲種子，每個(gè)盆上約10,000粒種子。使用兩個(gè)對(duì)照來確保正確地完成選擇噴霧；col-0陰性轉(zhuǎn)化體對(duì)照和摻入有在pat(膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶)選擇標(biāo)志方面純合的種子的哥倫比亞col-0野生型作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體對(duì)照。為了實(shí)現(xiàn)同步，將種子在播種前在0.1％(w/v)瓊脂溶液中分層48小時(shí)。為了提供每個(gè)選擇盤10,000粒種子，將200mg種子添加至0.1％(w/v)瓊脂溶液，并渦旋振蕩，直至將種子均勻地懸浮。然后，將分層的種子在用sunshine混合物lp5填充并用霍格蘭氏溶液在下灌溉(sub-irrigated)的選擇盤上播種。為了使選擇噴霧有效，重要的是，將40ml懸浮種子均勻地播種至選擇盤上。播種后，將增殖罩在每個(gè)選擇盤上放置，并種植植物以使用較早提及的條件進(jìn)行選擇。在播種后約5天除去增殖罩。使用每次應(yīng)用投遞有效率280g/ha草銨膦的devilbiss壓縮空氣噴霧尖端，用噴霧體積10ml/盤(703l/ha)中的草銨膦(來自bayercropsciences的除草劑)的0.2％(v/v)溶液(20μl/10mldh2o)在播種后5天噴霧幼苗，并在播種后10天再次噴霧幼苗。如下計(jì)算準(zhǔn)備的量：(703l/ha噴霧體積＝280gpa)。(280gai/ha)x(1ha/703l)x(1l/200gai草銨膦)＝0.20％溶液(或20μl/10ml)。對(duì)于要噴霧的每個(gè)盤，將10ml溶液移液入20ml閃爍瓶中。使用水平和垂直應(yīng)用模式投遞噴霧。第二次噴霧后4至7天，鑒定除草劑抗性植物。序列表<110>陶氏益農(nóng)公司(dowagrosciencesllc)samboju,narashimacyau,kerrmyburroughs,frankgsamuel,jayakumarpwebb,stevenr<120>使用peg化的量子點(diǎn)以在植物中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的線性dna分子投遞<130>297110046.1pc(68331-wo-pct)<150>61/362,224<151>2010-07-07<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>yfp基因的正向引物(forwardprimerforyfpgene)<400>1tgttccacggcaagatcccctacg24<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>yfp基因的反向引物(reverseprimerforyfpgene)<400>2tattcatctgggtgtgatcggcca24<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>pat基因的正向引物(forwardprimerforpatgene)<400>3ggagaggagaccagttgagattag24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>pat基因的反向引物(reverseprimerforpatgene)<400>4agatctgggtaactggcctaactg24當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12