發(fā)明領域本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法。本發(fā)明還涉及適合用于本發(fā)明的方法的組合物。序列表的參照本申請含有計算機可讀形式的序列表。在此將計算機可讀表格并入作為參考。
背景技術：
：由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇是本領域公知的。當今工業(yè)上使用兩種不同的方法。最常用的方法常稱作“傳統(tǒng)法”，包括在高溫下通常使用細菌α-淀粉酶使凝膠化的淀粉液化，然后在葡糖淀粉酶和發(fā)酵有機體的存在下同時進行糖化和發(fā)酵。另一種公知的方法常稱作“原淀粉水解”法(rsh法)，包括在初始凝膠化溫度以下通常在至少一種葡糖淀粉酶的存在下使顆粒淀粉同時糖化和發(fā)酵。盡管過去十年以來發(fā)酵產(chǎn)物制造方法取得顯著進步，但仍有大量的殘余淀粉材料未轉化成所需的發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。至少有一些未轉化的殘余淀粉材料，例如糖和糊精，處于不可發(fā)酵的美拉德(maillard)產(chǎn)物的形式。因此，對于與傳統(tǒng)方法相比較提供更高的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率或其他優(yōu)勢的由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的方法，仍存在有要求和需要。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及使用發(fā)酵有機體由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的方法。在第一方面，本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶；-在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和-任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶；ii)使用產(chǎn)生碳水化合物源的酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。在優(yōu)選的實施方式中，液化在80-90℃，例如大約85℃的溫度下進行。在優(yōu)選的實施方式中，液化在ph5.0-6.0的ph范圍下進行。在第二方面，本發(fā)明涉及一種酶組合物，其包括：i)α-淀粉酶；ii)在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和iii)任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶。任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶可以是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶和/或支鏈淀粉酶。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶，具體地為葡糖淀粉酶，是草酸青霉(penicilliumoxalicum)葡糖淀粉酶。附圖說明圖1顯示了分別在ph5.4和5.8下在85℃下在液化2小時的過程中加入和不加入蛋白酶pfu和/或葡糖淀粉酶pe001的α-淀粉酶1407的54小時乙醇發(fā)酵產(chǎn)率(％)的比較。具體實施方式本發(fā)明涉及使用發(fā)酵有機體由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的方法。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當在85℃下、在ph5.4或5.8下，用具有雙缺失(i181*+g182*)和取代n193f的seqidno:1所公開的成熟嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶以及強烈熾熱球菌(pyrococcusfuriosus)蛋白酶(pfus)或野生型橙橘嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)的熱穩(wěn)定性變體使含有淀粉的材料液化2小時時，得到的乙醇產(chǎn)率增加。在第一方面，本發(fā)明涉及用于制造發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選地乙醇的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶；-在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和任選地-產(chǎn)生碳水化合物源的酶；ii)使用產(chǎn)生碳水化合物源的酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。步驟ii)和iii)順序進行或同時進行。在一優(yōu)選的實施方式中，步驟ii)和iii)同時進行。α-淀粉酶、熱穩(wěn)定性蛋白酶和任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶(優(yōu)選為葡糖淀粉酶)、和/或任選的支鏈淀粉酶可以在液化步驟i)之前和/或該步驟過程中加入。本發(fā)明的組合物可以適用于本發(fā)明的方法中。但是，酶也可以分別加入。α-淀粉酶的例子可以見于下文“液化過程中存在和/或加入的α-淀粉酶”部分中。熱穩(wěn)定性蛋白酶的例子可以見于下文“液化過程中存在和/或加入的蛋白酶”部分中。合適的任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性的產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶的例子可見于下文“液化過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶”部分中。合適的任選的支鏈淀粉酶可見于下文“液化過程中存在和/或加入的支鏈淀粉酶”部分中。液化過程中的ph大于5.0，例如5.0-6.5，例如5.2-6.2，例如5.0-6.0，例如大約5.2，例如大約5.4，例如大約5.6，例如大約5.8。在一實施方式中，ph為5.0-5.5。根據(jù)本發(fā)明，溫度高于初始凝膠化溫度。術語“初始凝膠化溫度”是指通常通過加熱淀粉開始溶解的最低溫度。對于不同的淀粉，溫度可以變化。在一實施方式中，液化步驟i)中的溫度范圍在70-100℃，例如75-95℃，例如75-90℃，優(yōu)選80-90℃，例如大約85℃。在一實施方式中，本發(fā)明的方法在步驟i)之前還包括以下步驟：a)優(yōu)選地通過干磨降低含有淀粉的材料的粒徑；b)形成包括含有淀粉的材料和水的漿料?？梢岳缤ㄟ^研磨，降低含有淀粉的起始原料，例如全谷物的粒徑，以打開結構，增加表面積，使得可以進行進一步加工。通常有兩種類型的工藝：干磨和濕磨。在干磨中，將全谷粒研磨并使用。濕磨對胚芽和粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))提供較好的分離。濕磨常常在其中使用淀粉水解物制造例如糖漿的位置處應用。干磨和濕磨在淀粉加工領域均是公知的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選干磨。在一實施方式中，粒徑降低至0.05-3.0mm，優(yōu)選0.1-0.5mm，或者使得至少30％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少70％、再更優(yōu)選至少90％的含有淀粉的材料通過具有0.05-3.0mm篩網(wǎng)、優(yōu)選0.1-0.5mm篩網(wǎng)的篩子。在另一實施方式中，至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、特別是至少90％的含有淀粉的材料通過具有#6篩網(wǎng)的篩子。含水漿料可以包含含有淀粉的材料中的10-55w/w-％干固體(ds)，優(yōu)選25-45w/w-％干固體(ds)，更優(yōu)選30-40w/w-％干固體(ds)。漿料可以加熱至初始凝膠化溫度以上，優(yōu)選加熱至80-90℃，ph5.0-7.0，優(yōu)選5.0-6.0，加熱30分鐘至5小時，例如，大約2小時。可以在最初將α-淀粉酶、熱穩(wěn)定性蛋白酶和任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶(特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶)和/或任選的支鏈淀粉酶加入到含水漿料中，以開始液化(變稀)。在一實施方式中，僅將一部分酶加入到含水漿料中，而其余的酶在液化步驟i)過程中加入。液化步驟i)根據(jù)本發(fā)明進行0.5-5小時，例如1-3小時，例如通常大約2小時。在一實施方式中，在進行步驟i)中的液化之前，可以將含水漿料噴射烹煮(jet-cook)，以使?jié){料進一步凝膠化。噴射烹煮可以在110-145℃，優(yōu)選120-140℃，例如125-135℃，優(yōu)選大約130℃的溫度下進行大約1-15分鐘，優(yōu)選大約3-10分鐘，特別是大約5分鐘。糖化和發(fā)酵在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過程中可以存在和/或加入一種或多種產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶。產(chǎn)生碳水化合物源的酶可以優(yōu)選為葡糖淀粉酶，但也可以是選自β-淀粉酶、麥芽糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的酶。糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過程中加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶通常不同于任選地在液化步驟i)過程中加入的任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶。在一實施方式中，將產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶與真菌α-淀粉酶一起加入。產(chǎn)生碳水化合物源的酶，包括葡糖淀粉酶的例子可見于下文“糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶”部分中。當進行順序的糖化和發(fā)酵時，糖化步驟ii)可以在本領域公知的條件下進行。例如，糖化步驟ii)可以持續(xù)大約24至大約72小時。在一實施方式中，進行預糖化。預糖化通常在30-65℃，通常為大約60℃的溫度下進行40-90分鐘。預糖化之后，在同時糖化和發(fā)酵(“ssf”)中在發(fā)酵過程中進行糖化。糖化通常在20-75℃、優(yōu)選40-70℃、通常大約60℃的溫度下在4-5的ph下、通常在大約ph4.5下進行。同時糖化和發(fā)酵(“ssf”)在工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)物制造方法特別是乙醇制造方法中得以廣泛應用。當進行ssf時，糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)同時進行。糖化沒有保持階段，意味著發(fā)酵有機體例如酵母和酶可以一起加入。但是，也考慮分別地加入發(fā)酵有機體和酶。根據(jù)本發(fā)明ssf通常在25℃-40℃，例如28℃-35℃，例如30℃-34℃，優(yōu)選大約32℃的溫度下進行。在一實施方式中，發(fā)酵持續(xù)進行6-120小時，特別是24-96小時。在一實施方式中，ph為3.5-5，特別是3.8-4.3。發(fā)酵介質(zhì)“發(fā)酵介質(zhì)”是指進行發(fā)酵的環(huán)境。發(fā)酵介質(zhì)包括發(fā)酵底物，即通過發(fā)酵有機體代謝的碳水化合物來源。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵介質(zhì)可以包括用于發(fā)酵有機體的營養(yǎng)物和生長刺激劑。營養(yǎng)素和生長刺激劑在發(fā)酵領域廣泛應用，其包括氮源，例如氨；尿素、維生素和礦物質(zhì)或其組合。發(fā)酵有機體術語“發(fā)酵有機體”是指任何適合用于發(fā)酵過程并能夠產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物的有機體，包括細菌和真菌有機體，特別是酵母。特別合適的發(fā)酵有機體能夠使糖，例如葡萄糖或麥芽糖直接地或間接地發(fā)酵，即轉化成所需的發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。發(fā)酵有機體的例子包括真菌有機體，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(saccharomyces)菌株，特別是釀酒酵母(saccharomycescerevisae)。發(fā)酵過程例如ssf中活的發(fā)酵有機體的適當濃度是本領域公知的，或者可以由本領域技術人員很容易地確定。在一實施方式中，將發(fā)酵有機體，例如乙醇發(fā)酵酵母(例如釀酒酵母)加入到發(fā)酵介質(zhì)中，使得活的發(fā)酵有機體例如酵母相對于每ml發(fā)酵介質(zhì)計數(shù)范圍為105至1012，優(yōu)選107至1010，特別是大約5x107。市售酵母的例子包括，例如，redstartm和ethanolredtm酵母(獲自fermentis/lesaffre,usa)、fali(獲自fleischmann’syeast,usa)、superstart和thermosacctm新鮮酵母(獲自ethanoltechnology,wi,usa)、biofermaft和xr(獲自nabc-northamericanbioproductscorporation,ga,usa)、gertstrand(獲自gertstrandab,sweden)和fermiol(獲自dsmspecialties)。含有淀粉的材料根據(jù)本發(fā)明可以使用任何適當?shù)暮械矸鄣牟牧稀Ｆ鹗荚贤ǔ；谒璧陌l(fā)酵產(chǎn)物來選擇。適用于本發(fā)明方法的含有淀粉的材料的例子包括全谷物、玉米、小麥、大麥、黑麥、蜀黍(milo)、西米、木薯(cassava)、木薯粉(tapioca)、高粱(sorghum)、大米、豌豆、豆子或甜馬鈴薯，或其混合物或自其得到的淀粉，或谷類。另外考慮了蠟狀和非蠟狀的玉米和大麥。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明用于制造乙醇的含有淀粉的材料是玉米或小麥。發(fā)酵產(chǎn)物術語“發(fā)酵產(chǎn)物”是指通過包括使用發(fā)酵有機體的發(fā)酵步驟的方法制造的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明考慮的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇和肌醇)；有機酸(例如，檸檬素、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，h2和co2)；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、b12、β-胡蘿卜素)；和激素。在優(yōu)選的實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如燃料乙醇；飲用乙醇，即可飲用中性酒精(neutralspirits)；或可消費酒精工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品產(chǎn)品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的工業(yè)乙醇或產(chǎn)品。優(yōu)選的啤酒類型包括愛爾啤酒(ale)、司陶特啤酒(stouts)、波特啤酒(porters)、拉格啤酒(lagers)、苦啤酒(bitters)、麥芽酒(maltliquors)、happoushu、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒或淡啤酒。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于制造醇，例如乙醇。根據(jù)本發(fā)明得到的發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇可以用作燃料，其通常與汽油混合。但是，在乙醇的情況下，其也可以用作可飲用乙醇。回收在發(fā)酵或ssf之后，可以將發(fā)酵產(chǎn)物從發(fā)酵介質(zhì)中分離?？梢詫{料蒸餾，以提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物(例如，乙醇)?；蛘?，可以通過微過濾或膜過濾技術從發(fā)酵介質(zhì)中提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物也可以通過汽提或本領域公知的其他方法回收。液化過程中存在和/或加入的α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，在液化過程中與熱穩(wěn)定性蛋白酶和任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶和/或任選的支鏈淀粉酶一起存在和/或加入α-淀粉酶。液化步驟i)中加入的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。優(yōu)選細菌α-淀粉酶，其通常在液化過程中使用的溫度下是穩(wěn)定的。細菌α-淀粉酶術語“細菌α-淀粉酶”是指分類在ec3.2.1.1下的任何細菌α-淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明使用的細菌α-淀粉酶可以，例如，源自芽孢桿菌(bacillus)屬，其有時也稱作地芽孢桿菌(geobacillus)屬。在一實施方式中，芽孢桿菌α-淀粉酶源自解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的菌株，但也可以源自其他的芽孢桿菌屬。細菌α-淀粉酶的具體例子包括wo99/19467中seqidno:3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，wo99/19467中seqidno:5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，以及wo99/19467中seqidno:4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(在此將所有序列并入作為參考)。在一實施方式中，α-淀粉酶可以是與wo99/19467中seqidnos:3、4或5分別所示的序列中任意者具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性程度的酶。在一實施方式中，α-淀粉酶可以是與wo99/19467中seqidno:3或本文seqidno:1所示的任一序列具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性程度的酶。在優(yōu)選的實施方式中，α-淀粉酶源自嗜熱脂肪芽孢桿菌。嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶可以是成熟的野生型或者其成熟變體。成熟的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或其變體可以是重組產(chǎn)生的過程中天然截短的。例如，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶可以是截短的，使得其具有大約491個氨基酸(與wo99/19467中seqidno:3相比較)，例如480-495個氨基酸。芽孢桿菌α-淀粉酶也可以是變體和/或雜交體。這種變體的例子可以見于任一以下文獻中：wo96/23873、wo96/23874、wo97/41213、wo99/19467、wo00/60059和wo02/10355(在此將所有文件并入作為參考)。具體的α-淀粉酶變體公開于美國專利第6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723號(在此并入作為參考)，其包括具有以下突變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(常稱作bsgα-淀粉酶)變體：在r179、g180、i181和/或g182位具有一個或兩個氨基酸缺失，優(yōu)選wo96/23873–例如，參見第20頁第1-10行(在此并入作為參考)中公開的雙缺失，優(yōu)選與wo99/19467中所公開的seqidno:3或本文seqidno:1所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶氨基酸序列相比較相應于i181和g182位的缺失，或者氨基酸r179和g180的缺失，編號使用wo99/19467(在此將其并入作為參考)中seqidno:3或本文seqidno:1。再更優(yōu)選芽孢桿菌α-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其與wo99/19467中所公開的seqidno:3或本文的seqidno:1所示的野生型bsgα-淀粉酶氨基酸序列相比較，具有與181和182位的缺失相應的雙缺失，并進一步包括n193f取代(也稱作i181*+g182*+n193f)。細菌α-淀粉酶還可以在與wo99/19467中seqidno:4所示的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶或wo99/19467中seqidno:3或本文seqidno:1的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的s242變體中的s239相應的位置中具有取代。在一實施方式中，變體是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的s242a、e或q變體，優(yōu)選s242q變體(編號使用本文seqidno:1)。在一實施方式中，變體是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的位置e188變體，優(yōu)選e188p變體(編號使用本文seqidno:1)。在一實施方式中，細菌α-淀粉酶可以是截短的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。特別是，截短使得wo99/19467中seqidno:3或本文的seqidno:1中所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的長度為大約491個氨基酸，例如，長度為480-495個氨基酸。細菌雜交α-淀粉酶細菌α-淀粉酶還可以是雜交的細菌α-淀粉酶，例如，包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的445個c-端氨基酸殘基(示于wo99/19467的seqidno:4中)和源自解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的37個n-端氨基酸殘基(示于wo99/19467的seqidno:5中)的α-淀粉酶。在優(yōu)選的實施方式中，該雜交體具有一個或多個，特別是全部的以下取代：g48a+t49i+g107a+h156y+a181t+n190f+i201f+a209v+q264s(使用wo99/19467中seqidno:4的地衣芽孢桿菌編號)。另外，優(yōu)選具有一個或多個以下突變(或其他芽孢桿菌α-淀粉酶中的相應突變)的變體：h154y、a181t、n190f、a209v和q264s；和/或176位與179位之間的兩個殘基的缺失，優(yōu)選e178和g179缺失(位置編號使用wo99/19467的seqidno:5)。在一實施方式中，細菌α-淀粉酶是richardson等人,2002,thejournalofbiologicalchemistry277(29):.267501-26507中公開的嵌合α-淀粉酶的成熟部分，稱作bd5088或其變體。該α-淀粉酶與wo2007134207中seqidno:2所示者相同。成熟的酶序列在1位的起始“met”氨基酸之后開始。熱穩(wěn)定性α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，α-淀粉酶可以是熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，例如，熱穩(wěn)定性細菌α-淀粉酶，優(yōu)選來自嗜熱脂肪芽孢桿菌。在一實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少15。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少20。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少25。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少30。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少40。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少50。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少60。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為10-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為15-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為20-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為25-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為30-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為40-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為50-70。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為60-70。在本發(fā)明一實施方式中，α-淀粉酶是細菌α-淀粉酶，優(yōu)選源自芽孢桿菌屬的細菌α-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的細菌α-淀粉酶，具體地wo99/19467中公開的的嗜熱脂肪芽孢桿菌的作為seqidno:3(本文的seqidno:1)的細菌α-淀粉酶，其在r179、g180、i181和/或g182位缺失一個或兩個氨基酸，具體地，缺失r179和g180，或者缺失i181和g182，具有以下列表的突變。在優(yōu)選的實施方式中，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶具有雙缺失i181+g182，和任選的取代n193f，進一步包括選自以下列表的突變：在優(yōu)選的實施方式中，α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文的seqidno:1)。應當理解到，當提到嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶及其變體時，其通常以截短的形式產(chǎn)生。具體地，截短可以使得wo99/19467中seqidno:3或本文的seqidno:1所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或其變體在c-端截短且通常長度為大約491個氨基酸，例如，長度為480-495個氨基酸。在優(yōu)選的實施方式中，α-淀粉酶變體可以是與wo99/19467中seqidno:3或本文的seqidno:1所示的序列具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％，但小于100％的同一性程度的酶。液化過程中存在和/或加入的蛋白酶根據(jù)本發(fā)明，在液化過程中與α-淀粉酶，例如熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，和任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶和/或任選的支鏈淀粉酶一起存在和/或加入熱穩(wěn)定性蛋白酶。蛋白酶基于其催化機理分類成以下幾組：絲氨酸蛋白酶(s)、半胱氨酸蛋白酶(c)、天冬氨酸蛋白酶(a)、金屬蛋白酶(m)和未知的或尚未分類的蛋白酶(u)，參見handbookofproteolyticenzymes,a.j.barrett,n.d.rawlings,j.f.woessner(eds),academicpress(1998)，特別是概述部分。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的熱穩(wěn)定性蛋白酶是定義為屬于ec3.4.24(金屬內(nèi)肽酶)，優(yōu)選ec3.4.24.39(酸性金屬蛋白酶)的“金屬蛋白酶”。為了確定給定的蛋白酶是否是金屬蛋白酶，參考上述的“handbookofproteolyticenzymes”和其中所述的原則。這種確定可以對于所有類型的蛋白酶進行，上述蛋白酶是天然出現(xiàn)的或野生型蛋白酶，或基因工程化或合成的蛋白酶。蛋白酶活性可以使用任何適當?shù)臋z定測量，其中采用底物，其包括與所考察蛋白酶的特異性相關聯(lián)的肽鍵。檢定ph和檢定溫度同樣地調(diào)節(jié)成適合于所考察的蛋白酶。檢定ph值的例子為ph6、7、8、9、10或11。檢定溫度的例子為30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80℃。蛋白酶底物的例子為酪蛋白，例如azurine-交聯(lián)的酪蛋白(azcl-酪蛋白)。下文“材料和方法”部分中描述了兩種蛋白酶檢定，其中所謂的“azcl-酪蛋白檢定”是優(yōu)選的檢定。在一實施方式中，通過“材料和方法”部分所述的azcl-酪蛋白檢定測定，熱穩(wěn)定性蛋白酶具有蛋白酶196變體或蛋白酶pfu的蛋白酶活性的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％。本發(fā)明的方法中使用的蛋白酶的來源沒有限制，只要其滿足以下定義的熱穩(wěn)定性特性即可。在一實施方式中，蛋白酶是真菌來源的。蛋白酶可以是，例如，野生型蛋白酶的變體，只要蛋白酶具有本文定義的熱穩(wěn)定性特性即可。在優(yōu)選的實施方式中，熱穩(wěn)定性蛋白酶是上文定義的金屬蛋白酶的變體。在一實施方式中，本發(fā)明的方法中使用的熱穩(wěn)定性蛋白酶是真菌來源的，例如，真菌金屬蛋白酶，例如，源自以下的真菌金屬蛋白酶：嗜熱子囊菌(thermoascus)屬菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)菌株，特別是橙橘嗜熱子囊菌cgmccno.0670(分類為ec3.4.24.39)。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性蛋白酶是以下的變體：wo2003/048353中所公開的seqidno:2所示的金屬蛋白酶的成熟部分，或wo2010/008841中的seqidno:1且示作本文seqidno:3的成熟部分，其進一步具有選自以下列表的突變：-s5*+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-s5*+n26r+d79l+s87p+a112p+d142l；-n26r+t46r+d79l+s87p+a112p+d142l；-t46r+d79l+s87p+t116v+d142l；-d79l+p81r+s87p+a112p+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+a126v+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+d142l；-s38t+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+s87p+n98c+a112p+g135c+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l+t141c+m161c；-s36p+d79l+s87p+a112p+d142l；-a37p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s49p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s50p+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+y97w+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+y97w+d104p+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+a126v+d142l；-y82f+s87g+s70v+d79l+d104p+a112p+d142l；-y82f+s87g+d79l+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d142l。在優(yōu)選的實施方式中，熱穩(wěn)定性蛋白酶是公開為以下的金屬蛋白酶的變體：wo2003/048353中所公開的seqidno:2的成熟部分，或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分，其具有以下突變：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在一實施方式中，蛋白酶變體與wo2003/048353中所公開的seqidno:2的多肽的成熟部分或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分具有至少75％的同一性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的同一性。熱穩(wěn)定性蛋白酶也可以源自任何細菌，只要蛋白酶具有根據(jù)本發(fā)明定義的熱穩(wěn)定性特性即可。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性蛋白酶源自熾熱球菌屬(pyrococcus)細菌的菌株，例如，強烈熾熱球菌(pyrococcusfuriosus)菌株(pfu蛋白酶)。在一實施方式中，蛋白酶是美國專利第6,358,726-b1號(takarashuzocompany)中的seqidno:1和本文的seqidno:13所示者。在另一實施方式中，熱穩(wěn)定性蛋白酶是本文的seqidno:13所公開者，或者與美國專利第6,358,726-b1號中seqidno:1或本文的seqidno:13具有至少80％同一性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。強烈熾熱球菌蛋白酶可以購自takarabio,japan。強烈熾熱球菌蛋白酶是根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定性蛋白酶。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，強烈熾熱球菌蛋白酶的市售產(chǎn)品(pfus)在ph4.5下如本文實施例2中所述測得的熱穩(wěn)定性為110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。在一實施方式中，本發(fā)明的方法中使用的熱穩(wěn)定性蛋白酶在80℃/70℃下如實施例2中所述測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％。在一實施方式中，蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％。在一實施方式中，蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為20-50％，例如20-40％，例如20％和30％。在一實施方式中，蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為50-115％，例如50-70％，例如50-60％，例如100-120％，例如105-115％。在一實施方式中，蛋白酶在85℃/70℃下如實施例2中所述測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于10％。在一實施方式中，蛋白酶在85℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性大于10％，例如，大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。在一實施方式中，蛋白酶在85℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為10-50％，例如10-30％，例如10-25％。在一實施方式中，蛋白酶在80℃下測定為殘余活性大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％；且/或在一實施方式中，蛋白酶在84℃下測定為殘余活性大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％?！跋鄬钚浴焙汀皻堄嗷钚浴钡臏y定如實施例2中所述進行。在一實施方式中，蛋白酶在85℃下使用實施例3中所公開的zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性大于90，例如大于100。在一實施方式中，蛋白酶在85℃下使用zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性大于60％，例如大于90％，例如大于100％，例如大于110％。在一實施方式中，蛋白酶在85℃下使用zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性為60-120％，例如70-120％，例如80-120％，例如90-120％，例如100-120％，例如110-120％。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性蛋白酶具有jtp196蛋白酶變體或蛋白酶pfu的活性的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％，其通過azcl-酪蛋白檢定測定。液化過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶根據(jù)本發(fā)明，在液化過程中可以與α-淀粉酶和熱穩(wěn)定性蛋白酶一起存在和/或加入產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶。如上所述，液化步驟i)過程中還可以存在和/或加入支鏈淀粉酶。術語“產(chǎn)生碳水化合物源的酶”包括任何產(chǎn)生可發(fā)酵糖的酶。產(chǎn)生碳水化合物源的酶能夠通過所討論的發(fā)酵有機體產(chǎn)生可用作能量來源的碳水化合物，例如，當用于本發(fā)明的方法時用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。所產(chǎn)生的碳水化合物可以直接或間接地轉化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇。根據(jù)本發(fā)明，可以使用產(chǎn)生碳水化合物源的酶的混合物。具體例子包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)、β-淀粉酶和麥芽糖淀粉酶(麥芽糖生成者)。在優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是熱穩(wěn)定性的。可以將產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶與α-淀粉酶和熱穩(wěn)定性蛋白酶一起或者分別加入。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶在85℃下如實施例4中所述測定的相對活性熱穩(wěn)定性為至少至少20％，至少30％，優(yōu)選至少35％(熱穩(wěn)定性)。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在最佳ph5.0的ph下如實施例4中所述測定的相對活性為至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％，例如100％的葡糖淀粉酶(ph最佳)。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在ph5.0下如實施例4中所述測定的ph穩(wěn)定性為至少至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶(ph穩(wěn)定性)。在具體和優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，優(yōu)選真菌來源的，優(yōu)選來自絲狀真菌，例如，來自青霉菌(penicillium)屬菌株，特別是草酸青霉(penicilliumoxalicum)菌株，特別是在公開為wo2011/127802的pct/cn10/071753(在此將其并入作為參考)中公開為seqidno:2且示于本文的seqidnos:9或14的草酸青霉葡糖淀粉酶。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶與wo2011/127802中的seqidno:2或本文中的seqidnos:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶是草酸青霉葡糖淀粉酶。在優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是具有k79v取代的公開為wo2011/127802中seqidno:2且示于本文中seqidno:9或14的草酸青霉葡糖淀粉酶的變體(稱作pe001)(編號使用seqidno:14所示的成熟序列)。相對于在共同未決的美國申請第61/531,189號或pct/us12/053779(在此將其并入作為參考)中公開的親本，k79v葡糖淀粉酶變體對于蛋白酶降解的敏感性降低。在一實施方式中，熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶是公開為wo2011/127802中seqidno:2且示于本文中seqidno:9和14的草酸青霉葡糖淀粉酶的變體。在優(yōu)選的實施方式中，草酸青霉葡糖淀粉酶是公開為wo2011/127802中seqidno:2且示于本文中seqidno:9和14的葡糖淀粉酶，其在79位具有val(v)(編號使用seqidno:14)?？紤]的草酸青霉葡糖淀粉酶變體公開于共同未決的pct申請pct/ep12/070127(在此將其并入作為參考)中。在一實施方式中，這些變體對于蛋白酶降解的敏感性降低。在一實施方式中，與親本相比較，變體的熱穩(wěn)定性提高。更具體地，在一實施方式中，葡糖淀粉酶具有與pe001變體相應的k79v取代(編號使用seqidno:14)，并進一步包括至少一種以下取代或取代的組合：t65a；或q327f；或e501v；或y504t；或y504*；或t65a+q327f；或t65a+e501v；或t65a+y504t；或t65a+y504*；或q327f+e501v；或q327f+y504t；或q327f+y504*；或e501v+y504t；或e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v；或t65a+q327f+y504t；或t65a+e501v+y504t；或q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+y504*；或t65a+e501v+y504*；或q327f+e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504*；e501v+y504t；或t65a+k161s；或t65a+q405t；或t65a+q327w；或t65a+q327f；或t65a+q327y；或p11f+t65a+q327f；或r1k+d3w+k5q+g7v+n8s+t10k+p11s+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或r1e+d3n+p4g+g6r+g7a+n8a+t10d+p11d+t65a+q327f；或p11f+t65a+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+s105p+q327w；或t65a+s105p+q327f；或t65a+q327w+s364p；或t65a+q327f+s364p；或t65a+s103n+q327f；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502t+p563s+k571e；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+n564d+k571s；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v325t+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+i375a+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k218a+k221d+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10d+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+f12y+t65a+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t568n；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+f80*+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k112s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+n502t+y504*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79g+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79i+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79l+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+l72v+q327f+e501v+y504t；或s255n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+e74n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+g220n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+y245n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q253n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+d279n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s359n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d370n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460t+p468t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t463n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s465n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t477n+e501v+y504t。在優(yōu)選的實施方式中，草酸青霉葡糖淀粉酶變體具有與pe001變體相應的k79v取代(編號使用seqidno:14)，并進一步包括以下突變之一：p11f+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p11f+t65a+q327w+e501v+y504t。產(chǎn)生碳水化合物源的酶具體地可以以如下量加入：0.1-100μgep/g，例如0.5-50μgep/g，例如1-25μgep/g，例如2-12μgep/gds。液化過程中存在和/或加入的支鏈淀粉酶任選地，在液化步驟i)過程中可以與α-淀粉酶和熱穩(wěn)定性蛋白酶一起存在和/或加入支鏈淀粉酶。如上所述，液化步驟i)過程中還可以存在和/或加入產(chǎn)生碳水化合物源的酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶。在液化步驟i)和/或糖化步驟ii)或同時糖化和發(fā)酵的過程中可以存在和/或加入支鏈淀粉酶。支鏈淀粉酶(e.c.3.2.1.41，支鏈淀粉6-葡聚糖-水解酶)是脫支酶，其特征在于其能夠使例如膠淀粉(amylopectin)和支鏈淀粉(pullulan)中的α-1,6-糖苷鍵水解。根據(jù)本發(fā)明考慮的支鏈淀粉酶包括美國專利第4,560,651號(在此將其并入作為參考)中公開的來自bacillusamyloderamificans的支鏈淀粉酶，wo01/151620(在此將其并入作為參考)中公開為seqidno:2的支鏈淀粉酶，wo01/151620(在此將其并入作為參考)中公開為seqidno:4的bacillusderamificans，和wo01/151620(在此將其并入作為參考)中公開為seqidno:6并且還描述于femsmic.let.(1994)115,97-106中的來自嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(bacillusacidopullulyticus)的支鏈淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明考慮的其他的支鏈淀粉酶包括來自烏茲熾熱球菌(pyrococcuswoesei)的支鏈淀粉酶，特別是wo92/02614中公開的烏茲熾熱球菌dsmno.3773。在一實施方式中，支鏈淀粉酶是gh57家族支鏈淀粉酶。在一實施方式中，支鏈淀粉酶包括x47結構域，如公開為wo2011/087836(在此將其并入作為參考)的us61/289,040中所公開的。更具體地，支鏈淀粉酶可以源自高溫球菌(thermococcus)屬菌株，其包括嗜熱高溫球菌(thermococcuslitoralis)和熱水高溫球菌(thermococcushydrothermalis)，例如，剛好在x47結構域(即，本文seqidnos:11和12的氨基酸1-782)之后在x4位處截短的seqidno:11所示的熱水高溫球菌支鏈淀粉酶。支鏈淀粉酶還可以是嗜熱高溫球菌和熱水高溫球菌支鏈淀粉酶的雜交體，或熱水高溫球菌/嗜熱高溫球菌雜交酶，其具有x4位截短，如公開為wo2011/087836的us61/289,040(在此將其并入作為參考)中所公開或本文的seqidno:12所公開。在另一實施方式中，支鏈淀粉酶是包括wo2011/076123(novozymes)中所公開的x46結構域的支鏈淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，支鏈淀粉酶可以以有效量加入，其包括大約0.0001-10mg酶蛋白質(zhì)/克ds的優(yōu)選量，優(yōu)選0.0001-0.10mg酶蛋白質(zhì)/克ds，更優(yōu)選0.0001-0.010mg酶蛋白質(zhì)/克ds。支鏈淀粉酶活性可以測定為npun。用于測定npun的檢定如下文“材料和方法”部分中所述。合適的市售支鏈淀粉酶產(chǎn)品包括promozymed、promozymetmd2(novozymesa/s,denmark)、optimaxl-300(genencorint.,usa)和amano8(amano,japan)。糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶根據(jù)本發(fā)明，在糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入產(chǎn)生碳水化合物源的酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶。在優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是真菌來源的葡糖淀粉酶，優(yōu)選來自曲霉屬(aspergillus)菌株，優(yōu)選黑曲霉(a.niger)、泡盛曲霉(a.awamori)或米曲霉(a.oryzae)；或木霉素(trichoderma)菌株，優(yōu)選里氏木霉(t.reesei)；或踝節(jié)菌屬(talaromyces)菌株，優(yōu)選埃默森踝節(jié)菌(t.emersonii)。葡糖淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶可以源自任何適當?shù)膩碓?，例如，源自微生物或植物。?yōu)選的葡糖淀粉酶是真菌或細菌來源的，其選自曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉g1或g2葡糖淀粉酶(boel等人,(1984),emboj.3(5),p.1097-1102)或其變體，例如wo92/00381、wo00/04136和wo01/04273中所公開者(來自novozymes,denmark)；wo84/02921中公開的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(agric.biol.chem.(1991),55(4),p.941-949)或其變體或片段。其他曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括熱穩(wěn)定性提高的變體：g137a和g139a(chen等人,(1996),prot.eng.9,499-505)；d257e和d293e/q(chen等人,(1995),prot.eng.8,575-582)；n182(chen等人,(1994),biochem.j.301,275-281)；二硫鍵a246c(fierobe等人,(1996),biochemistry,35,8698-8704)；和在a435和s436位引入pro殘基(li等人,(1997),proteineng.10,1199-1204)。其他葡糖淀粉酶包括atheliarolfsii(之前表示為corticiumrolfsii)葡糖淀粉酶(參見美國專利第4,727,026號和nagasaka等人,(1998)“purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromcorticiumrolfsii,applmicrobiolbiotechnol50:323-330)，藍狀菌屬葡糖淀粉酶，特別是來自埃默森踝節(jié)菌(wo99/28448)、talaromycesleycettanus(美國專利第re.32,153號)、杜邦踝節(jié)菌(talaromycesduponti)、嗜熱踝節(jié)菌(talaromycesthermophilus)(美國專利第4,587,215號)。在優(yōu)選的實施方式中，糖化和/或發(fā)酵過程中使用的葡糖淀粉酶是wo99/28448中公開的埃默森踝節(jié)菌葡糖淀粉酶。考慮的細菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌(clostridium)屬，特別是熱解淀粉梭菌(c.thermoamylolyticum)(ep135,138)和熱硫化氫梭菌(c.thermohydrosulfuricum)(wo86/01831)的葡糖淀粉酶?？紤]的真菌葡糖淀粉酶包括瓣環(huán)栓菌(trametescingulata)、紙質(zhì)大紋飾孢菌(pachykytosporapapyracea)；和大白樁菇菌(leucopaxillusgiganteus)，其均公開于wo2006/069289；和peniophorarufomarginata，其公開于wo2007/124285；或其混合物。另外根據(jù)本發(fā)明還考慮雜交葡糖淀粉酶。例子包括wo2005/045018中公開的雜交葡糖淀粉酶。具體例子包括實施例1的表1和4中公開的雜交葡糖淀粉酶(在此將其雜交體并入作為參考)。在一實施方式中，葡糖淀粉酶源自密孔菌屬(pycnoporus)菌株，特別是公開為wo2011/066576的us61/264,977中所述的密孔菌屬菌株(seqidnos2、4或6)，或者源自褐褶菌(gloephyllum屬)菌株，特別是公開為wo2011/068803的us61/406,741中所述的褐褶菌屬菌株(seqidno:2、4、6、8、10、12、14或16)，或者黑層孔菌(nigrofomes)屬菌株，特別是us61/411,044或pct/us10/058375中公開的黑層孔菌屬菌株(seqidno:2)(在此將所有參考文獻均并入作為參考)。還考慮有與上述葡糖蛋白酶中任意者表現(xiàn)出高度同一性的葡糖淀粉酶，即與上述酶序列成熟部分任意者的同一性為至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％。在一實施方式中，葡糖淀粉酶可以以0.0001-20agu/gds、優(yōu)選0.001-10agu/gds、特別是0.01-5agu/gds，例如0.1-2agu/gds的量加入至糖化和/或發(fā)酵中。包括葡糖淀粉酶的市售組合物包括amg200l；amg300l；santmsuper、santmextral、spirizymetmplus、spirizymetmfuel、spirizymetmb4u、spirizymetmultra、spirizymetmexcel和amgtme(來自novozymesa/s)；optidextm300、gc480、gc417(來自genencorint.)；amigasetm和amigasetmplus(來自dsm)；g-zymetmg900、g-zymetm和g990zr(來自genencorint.)。麥芽糖淀粉酶糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶還可以是產(chǎn)生麥芽糖的α-淀粉酶。“產(chǎn)生麥芽糖的α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麥芽糖水解酶，e.c.3.2.1.133)能夠使直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成α-構型的麥芽糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株ncib11837的麥芽糖淀粉酶可購自novozymesa/s。產(chǎn)生麥芽糖的α-淀粉酶描述于美國專利第4,598,048、4,604,355和6,162,628號中，在此將其并入作為參考。在優(yōu)選的實施方式中，麥芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg總蛋白質(zhì)/克ds或0.05-5manu/gds的量加入。本發(fā)明優(yōu)選方法的例子在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和-任選的草酸青霉葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，其在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，其在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于105％，大于110％，大于115％，大于120％；例如，20-50％，20-40％，20-30％，50-115％，50-70％，50-60％，100-120％，105-115％；-任選的草酸青霉葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-6.0的ph范圍下在80-90℃的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，其在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，其在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于105％，大于110％，大于115％，大于120％；例如，20-50％，20-40％，20-30％，50-115％，50-70％，50-60％，100-120％，105-115％；-任選的草酸青霉葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182和任選的取代n193f；并任選地進一步具有以下組取代之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文中的seqidno:1)；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，其在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和-任選的具有選自以下的取代的seqidno:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(編號使用seqidno:14)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-6.0的ph范圍下在80-90℃的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182和任選的取代n193f；并任選地進一步具有以下組取代之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文中的seqidno:1)；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，其在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；任選地，和-任選的具有選自以下的取代的seqidno:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(編號使用seqidno:14)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。上述源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶(本文中seqidno:1)或其變體是成熟的α-淀粉酶或與seqidno:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟α-淀粉酶。上述源自強烈熾熱球菌(seqidno:13)和/或橙橘嗜熱子囊菌(seqidno:3)的蛋白酶或其變體是成熟的蛋白酶或分別與seqidno:13或seqidno:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟蛋白酶。上述源自草酸青霉的葡糖淀粉酶(本文的seqidno:14)或其變體是成熟的葡糖淀粉酶或與本文seqidno:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟葡糖淀粉酶。包括α-淀粉酶和熱穩(wěn)定性蛋白酶的組合物本發(fā)明的組合物包括α-淀粉酶，例如熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，以及熱穩(wěn)定性蛋白酶。組合物還可以進一步包括熱穩(wěn)定性的產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶，和/或也任選地包括支鏈淀粉酶。因此，在該方面，本發(fā)明涉及組合物，其包括：i)α-淀粉酶；ii)蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，其在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和iii)任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶。α-淀粉酶：α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶，例如，細菌α-淀粉酶，例如，源自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶。α-淀粉酶可以是熱穩(wěn)定性α-淀粉酶。熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)可以為至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。在一實施方式中，α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體，特別是截短成長度491個氨基酸，例如長度480-495個氨基酸，其具有選自以下的突變：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文的seqidno:1)。應當理解到，這些α-淀粉酶僅僅是具體的例子。上文“液化過程中存在和/或加入的α-淀粉酶”部分中公開的任何α-淀粉酶均可以用作本發(fā)明組合物中的α-淀粉酶成分。蛋白酶：本發(fā)明的組合物包括熱穩(wěn)定性蛋白酶。對蛋白酶成分的來源沒有限制，只要其滿足本文定義的熱穩(wěn)定性特性即可。在優(yōu)選的實施方式中，蛋白酶是上述橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶的變體，其在80℃/70℃下如實施例2中所述測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％。在具體的優(yōu)選實施方式中，蛋白酶是源自橙橘嗜熱子囊菌的金屬蛋白酶的變體，其公開為：wo2003/048353中所公開的seqidno:2的成熟部分，或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分，其具有以下突變：-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d142l；和-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在另一優(yōu)選實施方式中，蛋白酶源自強烈熾熱球菌菌株，例如，us6,358,726中seqidno:1或本文seqidno:13中所示者。應當理解到，這些蛋白酶僅僅是例子。上文在“液化過程中存在和/或加入的蛋白酶”部分中公開的任何蛋白酶均可以用作本發(fā)明組合物中的蛋白酶成分。產(chǎn)生碳水化合物源的酶：本發(fā)明的組合物還可以包括產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶，其在85℃、ph5.3下的熱穩(wěn)定性為至少30％，優(yōu)選至少35％。所述產(chǎn)生碳水化合物源的酶可以是在85℃下如實施例4中所述測定的相對活性熱穩(wěn)定性為至少20％、至少30％、優(yōu)選至少35％的熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶(熱穩(wěn)定性)。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在最佳ph5.0的ph下如實施例4中所述測定的相對活性為至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％，例如100％的葡糖淀粉酶(ph最佳)。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在ph5.0下如實施例4中所述測定的ph穩(wěn)定性為至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶(ph穩(wěn)定性)。在優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，優(yōu)選真菌來源的，優(yōu)選來自絲狀真菌，例如，來自青霉菌屬菌株，特別是草酸青霉菌株，在公開為wo2011/127802的pct/cn10/071753(在此將其并入作為參考)中公開為seqidno:2或其變體，且示于本文中的seqidnos:9或14。在一實施方式中，葡糖淀粉酶或其變體可以與wo2011/127802中的seqidno:2或本文中的seqidnos:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在具體和優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶是具有k79v取代的公開為wo2011/127802中seqidno:2且示于本文中seqidno:9和14的草酸青霉葡糖淀粉酶的變體(編號使用seqidno:14所示的成熟序列)。相對于在共同未決的美國申請第61/531,189號(在此將其并入作為參考)中公開的親本，k79v葡糖淀粉酶變體對于蛋白酶降解的敏感性降低。合適的熱穩(wěn)定性草酸青霉葡糖淀粉酶的例子在上文和以下實施例17和18中列出。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶具有支鏈淀粉酶副活性。應當理解到，這些產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶僅僅是例子。上文“液化過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶”部分中的任何產(chǎn)生碳水化合物源的酶均可以用作本發(fā)明組合物中的成分。支鏈淀粉酶：本發(fā)明的組合物還可以包括支鏈淀粉酶。在一實施方式中，支鏈淀粉酶是gh57家族支鏈淀粉酶。在優(yōu)選的實施方式中，支鏈淀粉酶包括公開為wo2011/087836的us61/289,040(在此將其并入作為參考)中公開的x47結構域。具體地，支鏈淀粉酶可以源自高溫球菌屬菌株，其包括嗜熱高溫球菌和熱水高溫球菌或其雜交體。支鏈淀粉酶可以是在x4位處截短的熱水高溫球菌支鏈淀粉酶，或者是具有x4位截短的熱水高溫球菌/嗜熱高溫球菌雜交酶，如公開為wo2011/087836的us61/289,040中所公開。在另一實施方式中，支鏈淀粉酶是包括wo2011/076123(novozymes)中所公開的x46結構域的支鏈淀粉酶。應當理解到，這些支鏈淀粉酶僅僅是具體的例子。上文“液化過程中存在和/或加入的支鏈淀粉酶”部分中公開的任何支鏈淀粉酶均可以用作本發(fā)明組合物中的任選的支鏈淀粉酶組分。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物包括：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶；-蛋白酶，源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和-任選的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物包括：-α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和-任選的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。在優(yōu)選的實施方式中，組合物包括：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182和任選的取代n193f；并任選地進一步具有以下組取代之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文的seqidno:1)；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和-任選的具有選自以下的取代的seqidno:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(編號使用seqidno:14)。在一實施方式中，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(本文中seqidno:1)或其變體是成熟的α-淀粉酶或與seqidno:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟α-淀粉酶。在一實施方式中，強烈熾熱球菌蛋白酶(seqidno:13)和/或橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶(seqidno:3)或其變體是成熟的蛋白酶或分別與seqidno:13或seqidno:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟蛋白酶。在一實施方式中，草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的seqidno:14)或其變體是成熟的葡糖淀粉酶或與本文seqidno:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟葡糖淀粉酶。在一實施方式中，產(chǎn)生碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶是草酸青霉葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以任選地被以上“支鏈淀粉酶”部分中所述的、優(yōu)選地源自嗜熱高溫球菌或熱水高溫球菌的支鏈淀粉酶代替或與其組合。本發(fā)明的α-淀粉酶變體在最后一方面，本發(fā)明涉及一種α-淀粉酶變體。α-淀粉酶是適合用于本發(fā)明的方法的熱穩(wěn)定性變體。α-淀粉酶變體也可以是本發(fā)明的組合物中的α-淀粉酶(例如，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶)。α-淀粉酶變體的穩(wěn)定性增加。通過與參照α-淀粉酶相比較，可以如本文實施例1所述對穩(wěn)定性進行測試。本發(fā)明的α-淀粉酶變體可以如wo2011/082425(在此將其并入作為參考)中所述制備。具體地，在本發(fā)明的方法中在實施例20中使用具體考慮的變體(aa369)。在該方面，本發(fā)明涉及變體α-淀粉酶，其在與59、89、129、177、179、254、284位相對應的位置處包括突變，其中變體與seqidno:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且變體具有α-淀粉酶活性。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與59位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp或tyr，特別是以ala、gln、glu、gly、ile、leu、pro或thr進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與89位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以arg、his或lys進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與129位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以ala、thr或val進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與177位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以arg、leu或met進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與179位相對應的位置處包括以ala、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以gln、glu、ile、leu、lys或val進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與254位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以ala、ser或thr進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體在與284位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以his、thr或val進行的取代。在一實施方式中，本發(fā)明的變體包括以下突變或由以下突變組成：v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v。在一實施方式中，本發(fā)明的變體是來自以下多肽的親代α-淀粉酶的變體：上述多肽與本文seqidno:1的成熟多肽或者具有α-淀粉酶活性的seqidno:1的成熟多肽的片段具有至少60％的序列同一性。在一實施方式中，本發(fā)明的變體親本α-淀粉酶與seqidno:1的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，和100％的序列同一性。在一實施方式中，本發(fā)明的變體親本α-淀粉酶包括seqidno:1的成熟多肽的氨基酸序列或者由其組成。在一實施方式中，本發(fā)明的變體親本α-淀粉酶是seqidno:1的成熟多肽的氨基酸序列的片段，其中該片段具有α-淀粉酶活性。在一實施方式中，本發(fā)明的變體是親本野生型α-淀粉酶的變體。在一實施方式中，本發(fā)明的變體親本α-淀粉酶是芽孢桿菌屬α-淀粉酶。在一實施方式中，親本α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌。在一實施方式中，親本α-淀粉酶是包括以下突變的seqidno:1所示的α-淀粉酶：i181+g182位的雙缺失，以及任選的n193f取代，或r179+g180位的雙缺失。在一實施方式中，本發(fā)明的變體包括以下突變或者由其組成：i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v(編號使用seqidno:1)。在一實施方式中，本發(fā)明的變體與親本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。在一實施方式中，本發(fā)明的變體與seqidno:1的成熟多肽具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。在一實施方式中，α-淀粉酶變體具有(天然)截短的本文seqidno:1所示的序列，使得其長度為大約491個氨基酸，例如長度為480-495個氨基酸。在具體的實施方式中，本發(fā)明的α-淀粉酶是具有以下突變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶：i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v，截短至491個氨基酸(編號使用seqidno:1)。在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的變體用于洗滌和/或洗碗的用途。在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的變體用于使紡織品退漿的用途。在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的變體用于制造焙烤產(chǎn)品的用途。在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的變體用于使含有淀粉的材料液化的用途。在一方面，本發(fā)明涉及制造液化淀粉的方法，其包括用本發(fā)明的變體使含有淀粉的材料液化。在一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的變體的分離的多核苷酸。在一方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的核酸構建物。在一方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的核酸構建物的表達載體。在一方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的核酸構建物的宿主細胞。在一方面，本發(fā)明涉及制造變體α-淀粉酶的方法，其包括：a.在適合于變體表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞；和b.從培養(yǎng)介質(zhì)中回收變體。在一實施方式中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。在一實施方式中，本發(fā)明涉及用于獲得變體α-淀粉酶的方法，其包括：a.在與59、89、129、177、179、254、284位相對應的位置處向親本α-淀粉酶中引入突變，其中變體與seqidno:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且變體具有α-淀粉酶活性；和b.回收變體。在一實施方式中，成熟多肽是包括以下突變的seqidno:1所示的α-淀粉酶：i181+g182位的雙缺失，和任選的n193f取代。材料和方法材料：α-淀粉酶a(aaa)：截短至491個氨基酸的具有突變i181*+g182*+n193f的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(seqidno:1)。α-淀粉酶1407(aaa1407)：截短至491個氨基酸的具有突變i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(seqidno:1)。α-淀粉酶369(aaa369)：截短至491個氨基酸的具有突變i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(seqidno:1)。蛋白酶wt：公開為本文seqidno:3中氨基酸1-177和wo2003/048353中seqidno:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜熱子囊菌gcmccno.0670的金屬蛋白酶。蛋白酶036：公開為本文seqidno:3中氨基酸1-177和wo2003/048353中seqidno:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜熱子囊菌gcmccno.0670的金屬蛋白酶，其具有以下突變：d079l+s87p+0142l。蛋白酶050：公開為本文seqidno:3中氨基酸1-177和wo2003/048353中seqidno:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜熱子囊菌gcmccno.0670的金屬蛋白酶，其具有以下突變：d79l+s87p+a112p+d142l。蛋白酶196：公開為本文seqidno:3中氨基酸1-177和wo2003/048353中seqidno:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜熱子囊菌gcmccno.0670的金屬蛋白酶，其具有以下突變：a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。蛋白酶pfu：作為pfuproteases購自takarabio(japan)的源自強烈熾熱球菌的蛋白酶(活性10.5mg/ml)，也顯示于本文seqidno:13中。葡糖淀粉酶po：公開為wo2011/127802的pct/cn10/071753中公開為seqidno:2并示于本文seqidno:9的草酸青霉葡糖淀粉酶的成熟部分。葡糖淀粉酶pe001：編號使用seqidno:14所示成熟序列的具有k79v取代的草酸青霉葡糖淀粉酶的變體。葡糖淀粉酶493(ga493)：進一步具有以下突變p11f+t65a+q327f的草酸青霉葡糖淀粉酶變體pe001的變體(編號使用seqidno:14)。葡糖淀粉酶bl：wo99/28448中公開為seqidno:7的埃默森踝節(jié)菌葡糖淀粉酶和wo06/069289中公開的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶的比例大約9:1的混合物。葡糖淀粉酶bl2：包括wo99/28448中公開的埃默森踝節(jié)菌葡糖淀粉酶、wo06/69289中公開的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶和wo2006/069290表5中公開為v039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶連接物和sbd作為副活性的微小根毛霉(rhizomucorpusillus)α-淀粉酶的混合物(比例大約65:15:1)。酵母：redstarethanolredtm，獲自redstar/lesaffre,usa。實施例6和20中的底物：磨碎的玉米和backset在美國獲自商用植物。方法同一性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性通過參數(shù)“同一性”描述。出于本發(fā)明的目的，兩個氨基酸序列之間的同一性程度，以及兩個核苷酸序列之間的同一性程度可以通過程序“對比”測定，其為needleman-wunsch比對(即，全局比對)。該程序用于對多肽以及核苷酸序列進行比對。缺省的評分矩陣blosum50用于多肽比對，缺省的同一性矩陣用于核苷酸比對。對于多肽，對于間隙第一殘基的補償為-12，對于核苷酸為-16。對于多肽，對于間隙其他殘基的補償為-2，對于核苷酸為-4?！氨葘Α笔莊asta軟件版本v20u6的一部分(參見w.r.pearson和d.j.lipman(1988),"improvedtoolsforbiologicalsequenceanalysis",pnas85:2444-2448，以及w.r.pearson(1990)"rapidandsensitivesequencecomparisonwithfastpandfasta,"methodsinenzymology183:63-98)。fasta蛋白質(zhì)比對使用對間隙大小沒有限制的smith-waterman算法(參見"smith-watermanalgorithm",t.f.smith和m.s.waterman(1981)j.mol.biol.147:195-197)。蛋白酶檢定azcl-酪蛋白檢定將0.2％藍色底物azcl-酪蛋白溶液混懸在硼砂/nah2po4緩沖液ph9中，同時加以攪拌。在攪拌的同時將溶液分布在微量滴定板上(每孔100微升)，加入30微升酶樣品，并將板在eppendorfthermomixer中在45℃、600rpm下孵育30分鐘。使用變性的酶樣品(100℃煮沸20分鐘)作為空白。孵育之后，通過將微量滴定板轉移至冰上停止反應，并通過在4℃下在3000rpm下離心將有色溶液與固體分離。將60微升上清液轉移至微量滴定板，并使用biorad酶標儀測量595nm處的吸光度。pna-檢定將50微升含有蛋白酶的樣品加入到微量滴定板中，并通過加入100微升1mmpna底物(5mg，溶解于100微升dmso中，并進一步用硼砂/nah2po4緩沖液ph9.0稀釋至10ml)開始檢定。在室溫下監(jiān)測od405的增加，作為蛋白酶活性的度量。葡糖淀粉酶活性(agu)葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶單位(agu)測量。novo葡糖淀粉酶單位(agu)定義為在以下的標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶的量：37℃，ph4.3，底物：麥芽糖23.2mm，緩沖液：乙酸鹽0.1m，反應時間5分鐘?？梢允褂米詣臃治鰞x系統(tǒng)。將變旋酶加入到葡萄糖脫氫酶試劑中，使得任何存在的α-d-葡萄糖變?yōu)棣?d-葡萄糖。葡萄糖脫氫酶在上述反應中特異性地與β-d-葡萄糖反應，形成nadh，將其在340nm下使用光度計測定，作為初始葡萄糖濃度的度量。amg孵育：底物：麥芽糖23.2mm緩沖液：乙酸鹽0.1mph：4.30±0.05孵育溫度：37℃±1反應時間：5分鐘酶工作范圍：0.5-4.0agu/ml顯色反應：glucdh：430u/l變旋酶：9u/lnad：0.21mm緩沖液：磷酸鹽0.12m；0.15mnaclph：7.60±0.05孵育溫度：37℃±1反應時間：5分鐘波長：340nm更詳細地描述該分析方法的資料(eb-sm-0131.02/01)可應要求獲自novozymesa/s,denmark，在此將該資料并入作為參考。α-淀粉酶活性(knu)α-淀粉酶活性可以使用馬鈴薯淀粉作為底物測定。該方法基于改性馬鈴薯淀粉被酶分解，并且反應之后將淀粉/酶溶液樣品與碘溶液混合。最初，形成藍黑色，但在淀粉分解過程中，藍色變得較弱，逐漸變?yōu)榧t褐色，將其與有色玻璃標準相比較。一kilonovoα-淀粉酶單位(knu)定義為在標準條件下(即，37℃+/-0.05；0.0003mca2+；和ph5.6)使可溶的5260mg淀粉干物質(zhì)merckamylum糊精化的酶的量。更詳細地描述該分析方法的資料eb-sm-0009.02/01可應要求獲自novozymesa/s,denmark，在此將該資料并入作為參考。測定支鏈淀粉酶活性(npun)內(nèi)切支鏈淀粉酶的npun活性相對于novozymes支鏈淀粉酶標準測量。一支鏈淀粉酶單位(npun)定義為在標準條件下(0.7％紅色支鏈淀粉(redpullulan)(megazyme)，ph5，40℃，20分鐘)每分鐘釋放出1微摩爾葡萄糖的酶的量?；钚允褂眉t色支鏈淀粉以npun/ml測量。將1ml稀釋的樣品或標準品在40℃下孵育2分鐘。加入0.5ml2％紅色支鏈淀粉、0.5mkcl、50mm檸檬酸ph5，并混合。將試管在40℃下孵育20分鐘，并通過加入2.5ml80％乙醇停止。將試管在室溫下靜置10-60分鐘，之后在4000rpm下離心10分鐘。然后在510nm測量上清液的od，并使用標準曲線計算活性。本發(fā)明在以下實施例中進一步詳述，提供這些實施例是為了對本發(fā)明進行說明，而絕非是要限定要求保護的本發(fā)明的范圍。在此將所有引用的參考文獻具體地并入，以對于本文所述內(nèi)容加以參考。實施例實施例1α-淀粉酶變體的穩(wěn)定性通過將參照α-淀粉酶(截短至491個氨基酸的具有突變i181*+g182*+n193f的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(seqidno:1編號))和變體在ph4.5和5.5以及75℃和85℃的溫度下與0.12mmcacl2一起孵育，然后使用底物(ultra淀粉酶檢定試劑盒，e33651，molecularprobes)進行殘余活性測定，測定參照α-淀粉酶及其α-淀粉酶變體的穩(wěn)定性。將純化的酶樣品在酶稀釋緩沖液(10mm乙酸鹽，0.01％tritonx100，0.12mmcacl2，ph5.0)中稀釋至0.5和1或5和10ppm(微克/ml)的工作濃度。將20微升酶樣品轉移至48孔pcrmtp，并向每孔中加入180微升穩(wěn)定性緩沖液(150mm乙酸鹽，150mmmes，0.01％tritonx100，0.12mmcacl2，ph4.5或5.5)，并混合。檢定使用兩種濃度的酶重復進行兩次。在75℃或85℃下孵育之前，取出20微升，并儲存在冰上作為對照樣品。在pcr機中在75℃和85℃下進行孵育。孵育之后，將樣品在殘余活性緩沖液(100mm乙酸鹽，0.01％tritonx100，0.12mmcacl2，ph5.5)中稀釋至15ng/ml，并將25微升稀釋的酶轉移至黑色384-mtp。使用enzchek底物，通過向每孔中加入25微升底物溶液(100微克/ml)，測定殘余活性。使用485-pnm的激發(fā)濾光片和555nm的發(fā)射濾光片(熒光讀取儀為polarstar,bmg)每分鐘測定熒光，測15分鐘。對于每次設定，將殘余活性標準化至對照樣品。假定對數(shù)衰減半衰期(t1/2(分鐘))使用以下方程計算：t1/2(分鐘)＝t(分鐘)*ln(0.5)/ln(％ra/100)，其中t是以分鐘計的檢定孵育時間，且％ra是檢定中測定的％殘余活性。使用該檢定設定，測定參照α-淀粉酶及其變體的半衰期，如表1所示。表1nd未測定結果表明，相比于參照α-淀粉酶，α-淀粉酶變體具有顯著更大的半衰期和穩(wěn)定性。實施例2制備蛋白酶變體和熱穩(wěn)定性測試菌株和質(zhì)粒將大腸桿菌(e.coli)dh12s(獲自gibcobrl)用于酵母質(zhì)粒拯救。pjtp000是tpi啟動子控制下的釀酒酵母和大腸桿菌穿梭載體，其構建自wo01/92502中所述的pjc039，其中已經(jīng)插入有橙橘嗜熱子囊菌m35蛋白酶基因(wo03/048353)。釀酒酵母yng318感受態(tài)細胞：將matadpep4[cir+]ura3-52、leu2-d2、his4-539用于蛋白酶變體的表達。其描述于j.biol.chem.272(15),pp9720-9727,1997中。介質(zhì)和底物10x基礎溶液：酵母氮基w/o氨基酸(difco)66.8g/l，琥珀酸鹽100g/l，naoh60g/l。sc-葡萄糖：20％葡萄糖(即，最終濃度2％＝2g/100ml)100ml/l，5％蘇氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10x基礎溶液100ml/l。使用孔徑0.20微米的濾器對溶液滅菌。將瓊脂(2％)和h2o(約761ml)一起高壓滅菌，并將單獨滅菌的sc-葡萄糖溶液加入到瓊脂溶液中。ypd：細菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。ypd+zn：ypd+0.25mmznso4。peg/liac溶液：40％peg400050ml，5m乙酸鋰1ml。96孔玉米蛋白微量滴定板：每孔含有200微升0.05-0.1％玉米蛋白(sigma)、0.25mmznso4和20mm乙酸鈉緩沖液ph4.5中的1％瓊脂。dna操作除非另外指出，dna操作和轉化使用以下文獻所述的分子生物學標準方法進行：sambrook等人,(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlab.coldspringharbor,ny；ausubel,f.m.等人,(eds.)"currentprotocolsinmolecularbiology",johnwileyandsons,1995；harwood,c.r.和cutting,s.m.(eds.)。酵母轉化酵母轉化使用乙酸鋰方法進行。將0.5微升載體(用限制性核酸內(nèi)切酶轉化)和1微升pcr片段混合。將dna混合物、100微升yng318感受態(tài)細胞和10微升yeastmaker載體dna(clontech)加入到12ml聚丙烯管(falcon2059)中。加入0.6mlpeg/liac溶液并輕緩混合。在30℃和200rpm下孵育30分鐘，然后在42℃下孵育30分鐘(熱休克)。轉移至微量離心管中，離心5秒。去除上清液，再溶解在3mlypd中。將細胞懸浮液在30℃下在200rpm下孵育45分鐘。將懸浮液倒入sc-葡萄糖板，并在30℃下孵育3天，使群落生長。通過zymoprep酵母質(zhì)粒微制備試劑盒(zymoresearch)提取酵母總dna。dna測序通過電穿孔(bio-radgenepulser)進行大腸桿菌轉化，用于進行dna測序。通過堿性方法(分子克隆(molecularcloning),coldspringharbor)或用質(zhì)粒試劑盒制備dna質(zhì)粒。通過qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。使用ptc-200dna擴增儀進行pcr。將abiprismtm310基因分析儀用于測定所有的dna序列。構建蛋白酶表達載體將themoascusm35蛋白酶基因用引物對protf(seqidno:4)和protr(seqidno:45)擴增。將所得的pcr片段與用限制酶消化的pjc039載體(描述于wo2001/92502)一起引入到釀酒酵母yng318中，以去除特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)角質(zhì)酶基因?；厥誷c-葡萄糖板上的酵母克隆中的質(zhì)粒，以確認內(nèi)部序列，并稱作pjtp001。構建酵母文庫和定點變體通過soepcr方法構建酵母文庫和定點變體(通過重疊延伸拼接，參見“pcr:apracticalapproach”,p.207-209,oxforduniversitypress,eds.mcpherson,quirke,taylor)，然后進行酵母體內(nèi)重組。擴增和測序的通用引物使用引物am34(seqidno:5)和am35(seqidno:6)，通過與簡并引物(am34+反向引物am35+正向引物)一起的soe方法制造含有任意突變片段的dna片段，或僅擴增整個蛋白酶基因(am34+am35)。通過qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。將所得的純化片段與載體消化物混合。將混合溶液引入到釀酒酵母中，以通過體內(nèi)重組構建文庫或定點變體。相對活性檢定將sc-葡萄糖上的酵母克隆接種到含有ypd+zn介質(zhì)的96孔微量滴定板的孔中，并在28℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)物上清液應用于96孔玉米蛋白微量滴定板，并在至少2個溫度下(例如，60℃和65℃，70℃和75℃，70℃和80℃)孵育4小時以上或過夜。測量板中玉米蛋白的濁度作為a630，并測定相對活性(較高/較低溫度)作為熱活性提高的指標。選擇相對活性比親本變體更高的克隆，并測定序列。殘余活性檢定將sc-葡萄糖上的酵母克隆接種到96孔微量滴定板的孔中，并在28℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)物上清液在20mm乙酸鈉緩沖液ph4.5中在某一溫度下(80℃或84℃，4℃作為參照)孵育10分鐘之后，使用偶氮酪蛋白(megazyme)在65℃下測量蛋白酶活性，以測定殘余活性。選擇殘余活性比親本變體更高的克隆，并測定序列。偶氮酪蛋白檢定將20微升樣品與150微升底物溶液(96ml20mm乙酸鈉ph4.5中4ml乙醇中12.5％偶氮酪蛋白，含有0.01％triton-100和0.25mmznso4)混合，并孵育4小時或更久。加入20微升/孔100％三氯乙酸(tca)溶液之后，將板離心，并將100微升上清液用移液器吸出，測量a440。米曲霉中蛋白酶變體的表達使用包括蛋白酶變體基因的構建物來構建曲霉表達載體。曲霉表達載體由表達組件組成，該表達組件基于與構巢曲霉(aspergillusnidulans)磷酸丙糖異構酶非翻譯前導序列(pna2/tpi)融合的黑曲霉中性淀粉酶ii啟動子以及黑曲霉淀粉糖苷酶終止子(tamg)。質(zhì)粒上另外存在有使得能夠在作為唯一氮源的乙酰胺上生長的來自構巢曲霉的曲霉選擇性標記物amds。將蛋白酶變體的表達質(zhì)粒轉化到曲霉中，如lassen等人,(2001),appl.environ.microbiol.67,4701-4707所述。對于每種構建物，分離出10-20菌株，將其純化，并在搖瓶中培養(yǎng)。純化表達的變體1.將0.22μm過濾的發(fā)酵樣品的ph調(diào)節(jié)至4.0。2.將樣品置于磁力攪拌下的冰浴中。以小的等份加入(nh4)2so4(相應于大約2.0-2.2m(nh4)2so4，不考慮加入化合物時的體積增加)。3.最后加入(nh4)2so4之后，將樣品在輕緩磁力攪拌下的冰浴上孵育45分鐘。4.離心：裝有r20a2轉頭的hitachihimaccr20g高速冷凍離心機，5℃，20,000rpm，30分鐘。5.將形成的沉淀物溶解在200ml50mm乙酸鈉ph4.0中。6.使用0.22μmpesplus膜(iwaki)將樣品通過真空抽吸過濾。7.在冷室中使用超濾(vivacell250，來自vivascience，裝有5kdamwcopes膜)將樣品脫鹽/緩沖液交換至50mm乙酸鈉ph4.0過夜。將保留的樣品用50mm乙酸鈉ph4.0稀釋至200ml。優(yōu)選樣品電導率小于5ms/cm。8.將樣品裝載到用50mm乙酸鈉ph4.0平衡的陽離子交換柱中。使用3倍柱體積的結合緩沖液(50mm乙酸鈉ph4.0)將未結合的樣品從柱上洗出，并使用線性梯度以10倍柱體積0-100％洗脫緩沖液(50mm乙酸鈉+1mnaclph4.0)洗脫樣品。9.將收集的部分通過內(nèi)切蛋白酶檢定(參考下文)進行檢定，之后對選擇的部分進行標準sds-page(還原性條件)?；趦?nèi)切蛋白酶檢定和sds-page收集這些部分。內(nèi)切蛋白酶檢定1.將protazymeol片/5ml250mm乙酸鈉ph5.0通過磁力攪拌溶解(底物：內(nèi)切蛋白酶protazymeak片獲自megazyme–cat.#prak11/08)。2.在攪拌下，將250微升底物溶液轉移至1.5ml微量離心管中。3.將25微升樣品加入到每個管中(空白為樣品緩沖液)。4.將管在thermomixer上在50℃震搖(1000rpm)孵育15分鐘。5.將250微升1mnaoh加入到每個管中，然后進行渦流。6.在16,100×g和25℃下離心3分鐘。7.將200微升上清液轉移至mtp，并記錄590nm處的吸光度。結果實施例3使用純化酶的所選擇變體的溫度圖譜純化選擇出的顯示出較好熱穩(wěn)定性的變體，并在下文所述玉米蛋白-bca檢定中使用純化的酶。將酶在所示升高的溫度孵育60分鐘之后在60℃測定殘余蛋白酶活性。玉米蛋白-bca檢定：進行玉米蛋白-bca檢定，以檢測各種溫度下通過變體蛋白酶從玉米蛋白中釋放的可溶蛋白質(zhì)定量。方案：1)將10微升10微克/ml酶溶液和100μl0.025％玉米蛋白溶液在微量滴定板(mtp)中混合。2)在各種溫度下孵育60分鐘。3)加入10微升100％三氯乙酸(tca)溶液。4)在3500rpm下離心mtp5分鐘。5)將15微升取出至含有100微升bca檢定溶液(piercecat#:23225，bca蛋白質(zhì)檢定試劑盒)的新mtp。6)在60℃下孵育30分鐘。7)測量a562。結果示于表5中。與wt蛋白酶相比較，所有測試的變體均表現(xiàn)出提高的熱穩(wěn)定性。表5.玉米蛋白-bca檢定.實施例4草酸青霉葡糖淀粉酶的表征草酸青霉葡糖淀粉酶公開于本文seqidno:9中。底物.底物：去離子水中1％可溶性淀粉(sigmas-9765)反應緩沖液：ph5.3的0.1m乙酸鹽緩沖液葡萄糖濃度測定試劑盒：wako葡萄糖檢定試劑盒(labassayglucose,wako,cat#298-65701)。反應條件.將20微升可溶性淀粉和50微升ph5.3的乙酸鹽緩沖液混合。加入30微升酶溶液(50微克酶蛋白質(zhì)/ml)，至最終體積為100微升，然后在37℃下孵育15分鐘。通過wako試劑盒測定葡萄糖濃度。所有工作均平行進行。溫度優(yōu)化.為評價草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳溫度，在20、30、40、50、60、70、80、85、90和95℃下進行上述的“反應條件”檢定。結果示于表6。表6溫度優(yōu)化溫度(℃)20304050607080859095相對活性(％)63.671.786.499.494.6100.092.992.582.782.8從結果可以看出，在給定條件下草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳溫度為50℃至70℃，并且葡糖淀粉酶在95℃下保持大于80％的活性。熱穩(wěn)定性.為了評價草酸青霉葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性，對反應條件檢定進行修改，其中酶溶液和乙酸鹽緩沖液在20、30、40、50、60、70、75、80、85、90和95℃下預孵育15分鐘。孵育之后，將20微升淀粉加入到溶液中，并如上所述進行檢定。結果示于表7。表7熱穩(wěn)定性從結果可以看出，預孵育15分鐘之后，草酸青霉葡糖淀粉酶在直至70℃是穩(wěn)定的，其中保持大于80％的活性。ph優(yōu)化.為了評價草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳ph，在ph2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0下進行上述的反應條件檢定。使用以下緩沖液代替反應條件檢定中所述的乙酸鹽緩沖液：100mm琥珀酸、hepes、ches、capso、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100，ph用hcl或naoh調(diào)節(jié)至2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。結果示于表8。表8ph優(yōu)化從結果可以看出，在給定條件下草酸青霉葡糖淀粉酶在ph5下活性最高。草酸青霉葡糖淀粉酶在很寬的ph范圍內(nèi)是有活性的，其在ph2-7時保持大于50％的活性。ph穩(wěn)定性.為了評價草酸青霉葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性，對反應條件檢定進行修改，其中使用ph優(yōu)化中所述的緩沖液，將酶溶液(50微克/ml)在ph2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液中預孵育20小時。預孵育之后，向溶液中加入20微升可溶性淀粉，至最終體積為100微升，并如上所述進行檢定。結果示于表9。表9ph穩(wěn)定性從結果可以看出，草酸青霉葡糖淀粉酶在ph3至ph7的條件下在預孵育20小時之后是穩(wěn)定的，并在ph8下其活性降低。實施例5蛋白酶pfu的熱穩(wěn)定性使用與實施例2相同的方法測試購自takarabioinc,(japan)的強烈熾熱球菌蛋白酶(pfus)的熱穩(wěn)定性。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在ph4.5下熱穩(wěn)定性(相對活性)為110％(80℃/70℃)和103(90℃/70℃)。實施例6使用α-淀粉酶1407和蛋白酶pfu用于液化的乙醇制造該實驗的目的在于評價在85℃下分別在ph5.4和5.8下液化2小時的過程中加入的源自強烈熾熱球菌的蛋白酶pfu的應用性能。液化(labomat)每次液化接收磨碎的玉米(84.19％ds)、backset(6.27％ds)和自來水，目標為總重量100g，32.50％干固體(ds)。backset以總漿料重量的30％w/w混合。最初的漿料ph大約為5.2，并在液化之前使用50％w/w氫氧化鈉調(diào)節(jié)至ph5.4或5.8。根據(jù)以下表11中列出的實驗設計加入所有的酶。液化使用以下條件在labomat中發(fā)生：5℃/分鐘躍變，躍變17分鐘，85℃下103分鐘保持時間，整個運行中40rpm，200ml不銹鋼罐(canister)。液化之后，將所有的筒在冰浴中冷卻，并在ssf下基于以下列出的方案準備發(fā)酵。同時糖化和發(fā)酵(ssf)將各個醪液用50％w/w氫氧化鈉或40％v/v硫酸調(diào)節(jié)至ph5.0。向各個醪液應用青霉素，至總濃度為3ppm。通過相對于每15ml預先打孔以允許co2釋放的試管中等分大約4.5g醪液，將試管準備為具有醪液。將試管在4℃下靜置過夜，直到次日早晨。將所有醪液的試管從冷貯藏中移出，并在步入式孵育室中升溫至32℃。一經(jīng)升溫，將葡糖淀粉酶bl2以0.50agu/gds投放至每個醪液試管，加水，使得所有試管均接收120μl液體并且各個醪液樣品均接收100μl再水化的酵母。再水化的酵母通過將5.5gfermentisredstar混合到100ml32℃自來水中至少15分鐘而制備。隨著時間監(jiān)測co2重量損失，將每單位產(chǎn)生和損失的co2通過以下轉化成每克干固體產(chǎn)生的乙醇克數(shù)(getoh/gds)：hplc分析通過每次處理取3管，發(fā)酵54小時后進行發(fā)酵取樣。每個樣品用50μl40％v/vh2so4滅活，渦流，在1460×g下離心10分鐘，并通過0.45μmwhatmanpp濾器過濾。在hplc下分析54小時樣品而無需進一步稀釋。在hplc分析之前和過程中，樣品貯存在4℃。該方法使用乙醇校正標準(％w/v)對分析物進行定量。使用包括原點的四點校正進行定量。當適用時，使用jmp軟件(cary,nc)以使用tukey-kramerhsd或dunnett’s進行配對的單因素方差分析來對數(shù)據(jù)進行分析。通過將單因素方差分析的標準誤差乘以1.96，建立表示95％置信水平的誤差條。表11.實驗計劃結果：實施例7用α-淀粉酶a和熱穩(wěn)定性蛋白酶050和蛋白酶036制造乙醇該實驗的目的在于評價在ph5.4下在85℃下液化2小時的過程中加入的橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶的兩種熱穩(wěn)定性蛋白酶變體的應用性能。液化將磨碎的玉米、backset和自來水混合至32.50％ds，并用50％v/v氫氧化鈉調(diào)節(jié)至ph5.4。加入每種分別的蛋白酶，較好混合，然后以0.02％(w/w)/g玉米的劑量加入α-淀粉酶a。將樣品在設定為85℃的水浴中孵育2小時，并接受在孵育的前15分鐘過程中和之后每15分鐘的頻繁混合。液化之后，將所有醪液再冷藏，并保持其中，直至發(fā)酵。同時糖化和發(fā)酵(ssf)根據(jù)需要在ssf之前將醪液用自來水調(diào)節(jié)至32％ds，并投放總濃度500ppm的尿素和3ppm的青霉素。液化之后，對ssf不進行ph調(diào)節(jié)。將大約4.5g醪液加入到在頂部預先打孔以允許co2釋放的15ml試管中。以0.50agu/gds的劑量投放葡糖淀粉酶bl2，并加水至每個試管中，以保證所有樣品均在相同的固體含量下處理。通過將5.5gfermentisredstar混合到100ml32℃自來水中至少15分鐘來制備再水化的酵母，并對每個試管接種100μl，其相應于3千萬細胞/ml醪液。選擇所有54小時發(fā)酵樣品用于hplc分析，并將其用50μl40％v/vh2so4滅活，渦流，在1460×g下離心10分鐘，然后通過0.45μmwhatman濾器過濾。hplc分析之前樣品在4℃下貯存。hplc分析如實施例6中所述進行。隨著時間監(jiān)測co2重量損失，使用實施例6中的公式，將每單位損失的co2轉化成每克干固體產(chǎn)生的乙醇克數(shù)(getoh/gds)。所有液化中包括α-淀粉酶a。實施例8克隆草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因制備草酸淀粉酶菌株cdna遵照3’rapidamplifictionofcdnaendsystem(invitrogencorp.,carlsbad,ca,usa)的說明書合成cdna。克隆草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因使用以下所示設計成自5’端擴增葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物克隆草酸青霉葡糖淀粉酶基因。上游引物：5’-atgcgtctcactctattatcaggtg-3’(seqidno:15)使用platinumhifitaqdna聚合酶(invitrogencorp.,carlsbad,ca,usa)，用上游引物和auap(由3’rapidamplifictionofcdnaendsystem提供)通過pcr擴增全長基因。擴增反應由5μl10xpcr緩沖液、2μl25mmmgcl2、1μl10mmdntp、1μl10um上游引物、1μl10umauap、2μl第一鏈cdna、0.5μlhifitaq和37.5μl去離子水組成。pcr程序為：94℃，3分鐘；10次循環(huán)，94℃40秒，60℃40秒，每循環(huán)降1℃；25次循環(huán)，94℃40秒，50℃40秒，68℃2分鐘；最后在68℃下延伸10分鐘。使用pgem-t載體體系(promegacorporation,madison,wi,usa)，將得到的pcr片段克隆到pgem-t載體(promegacorporation,madison,wi,usa)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒amg1。質(zhì)粒amg1中插入的葡糖淀粉酶基因經(jīng)測序確認。將含有質(zhì)粒amg1(指定為nn059173)的大腸桿菌菌株top10于2009年11月23日保藏于deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz)，指定的編號為dsm23123。實施例9表達克隆的草酸青霉葡糖淀粉酶使用以下所示的兩個克隆引物f和引物r，其基于已知的序列設計，并添加通過in-fusiontm策略直接克隆的標記，通過pcr將草酸青霉葡糖淀粉酶基因從質(zhì)粒amg1中再克隆到曲霉表達載體中。引物f：5’acacaactggggatccaccatgcgtctcactctattatc(seqidno:16)引物r：5’agatctcgagaagcttaaaactgccacacgtcgttgg(seqidno:17)用質(zhì)粒amg1進行pcr反應，以擴增全長基因。pcr反應由40μg質(zhì)粒amg1dna、1μl各引物(100μm)、12.5μl2xextensorhi-fidelity混合液(extensorhi-fidelitymastermix,abgene,unitedkingdom)和9.5μlpcr級的水組成。pcr反應使用dyadpcr機(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)進行，程序設定如下：94℃下2分鐘；然后是25次循環(huán)，94℃下15秒，50℃下30秒和72℃下1分鐘；然后在72℃下10分鐘。使用1xtae緩沖液通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離反應產(chǎn)物，其中將大約1.9kbpcr產(chǎn)物條帶從凝膠上切除，并使用pcrdna和凝膠條帶純化試劑盒(gehealthcare,unitedkingdom)根據(jù)制造商說明書進行純化。使用in-fusiontmdry-downpcr克隆試劑盒(bdbiosciences,paloalto,ca,usa)，根據(jù)制造商說明書，將與草酸青霉葡糖淀粉酶基因相對應的dna克隆到用bamhi和hindiii線性化的曲霉表達載體中。線性化載體的構建如wo2005/042735a1中所述。使用2μl體積的連接溶液，轉化25μl的fusionblue大腸桿菌細胞(包括在in-fusiontmdry-downpcr克隆試劑盒中)。在42℃下熱休克45秒且在冰上冷卻之后，加入250μlsoc介質(zhì)，并將細胞在37℃下在225rpm下孵育90分鐘，然后鋪在含有50μg氨芐青霉素/ml的lb瓊脂板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。將所選擇的克隆接種到3ml補充有50μg氨芐青霉素/ml的lb介質(zhì)中并在37℃下在225rpm下孵育過夜。根據(jù)制造商說明書使用minijetstar(genomed,germany)純化來自所選擇克隆的質(zhì)粒dna。在異源表達之前，通過sanger測序證實草酸青霉葡糖淀粉酶基因序列。選擇一個質(zhì)粒用于進一步表達，且命名為xyzxyz1471-4。如wo95/02043中所述制備黑曲霉mbin118的原生質(zhì)體。將100μl原生質(zhì)體懸浮液與2.5μgxyz1471-4質(zhì)粒混合，加入250微升60％peg4000(applichem)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mmcacl2和10mmtris-hclph7.5，并輕緩混合。將混合物在37℃下孵育30分鐘，將原生質(zhì)體在補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖(cove,1996,biochim.biophys.acta133:51-56)(1m)板中與6％低熔點瓊脂糖(biowhittakermolecularapplications)混合，并作為頂層加到補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖(1m)板上用于轉化體選擇(4ml頂層瓊脂/板)。在37℃下孵育5天之后，撿取16種轉化體的孢子，并種在96深孔mt板中的750μlyp-2％麥芽糖介質(zhì)上。在30℃下靜止培養(yǎng)5天之后，對來自每孔的10μl培養(yǎng)肉湯在sds-page(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠、gritonxtprecastgel(biorad,ca,usa)上進行分析，以基于產(chǎn)生大量葡糖淀粉酶的能力識別最好的轉化體。將選擇的轉化體在原始轉化板上識別，并作為孢子保藏在20％甘油儲液中，冷凍貯存(-80℃)。培養(yǎng).將選擇的轉化體接種在100mlmlc介質(zhì)中，并在旋轉搖蕩器上在500ml搖瓶中在30℃下培養(yǎng)2天。將3ml培養(yǎng)肉湯接種至100mlm410介質(zhì)，并在30℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)肉湯離心，并將上清液使用0.2μm膜濾器過濾。α-環(huán)糊精親和凝膠.將10克環(huán)氧活化的瓊脂糖6b(gehealthcare,chalfontst.giles,u.k)粉末懸浮在蒸餾水中，并在燒結玻璃濾器上用蒸餾水洗滌。將凝膠懸浮在偶聯(lián)溶液(100ml12.5mg/mlα-環(huán)糊精，0.5mnaoh)中，并在室溫下輕緩震搖下孵育一天。將凝膠在燒結玻璃濾器上用蒸餾水洗滌，懸浮在100ml1m乙醇胺ph10中，并在50℃下孵育4小時用于封閉。然后將凝膠交替用50mmph8tris-hcl和50mmph4.0naoac洗滌數(shù)次。最后，使用平衡緩沖液(50mmnaoac，150mmnacl，ph4.5)將凝膠裝填到35-40ml柱中。從培養(yǎng)肉湯中純化葡糖淀粉酶.將來自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉mbin118發(fā)酵的培養(yǎng)肉湯通過0.22μmpes濾器過濾，并應用于之前在50mmnaoac、150mmnaclph4.5緩沖液中平衡過的α-環(huán)糊精親和凝膠柱。用平衡緩沖液從柱中洗去未結合的材料，并使用含有10mmβ-環(huán)糊精的3倍柱體積以上的相同緩沖液洗脫葡糖淀粉酶?？疾煜疵撘旱钠咸堑矸勖富钚裕耘袛嗥咸堑矸勖甘欠褚呀?jīng)與α-環(huán)糊精親和凝膠結合。然后將純化的葡糖淀粉酶樣品針對20mmnaoacph5.0透析。最后通過sds-page確認純度，僅發(fā)現(xiàn)單一條帶。實施例10草酸青霉葡糖淀粉酶(pe001)定點變體的構建和表達用實施例9中所述的質(zhì)粒xyz1471-4進行兩個pcr反應，使用以下所示的引物k79vf和k79vr，其設計成將成熟序列79位的賴氨酸k取代成纈氨酸v，并且使用以下所示的引物f-np003940和r-np003940，其基于已知的序列設計并添加通過in-fusiontm策略直接克隆的標記。引物k79vf18mergcagtctttccaattgac(seqidno:18)引物k79vr18meraattggaaagactgcccg(seqidno:19)引物f-np003940：5’acacaactggggatccaccatgcgtctcactctattatc(seqidno:20)引物r-np003940：5’agatctcgagaagcttaaaactgccacacgtcgttgg(seqidno:21)。使用ptc-200dna擴增儀在下述條件下進行pcr。通過qiagen凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商說明書從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。使用in-fusiontmdry-downpcr克隆試劑盒(bdbiosciences,paloalto,ca,usa)，根據(jù)制造商說明書，將所得的純化的兩個片段克隆到用bamhi和hindiii線性化的曲霉表達載體中。線性化載體的構建描述于wo2005/042735a1中。使用連接混合物來轉化大腸桿菌dh5α細胞(toyobo)。將選擇的克隆接種到補充有50μg氨芐青霉素/ml的3mllb介質(zhì)中，并在37℃下在225rpm下孵育過夜。將來自所選擇的克隆的質(zhì)粒dna使用qiagen質(zhì)粒小型試劑盒(qiagen)根據(jù)制造商說明書純化。異源表達之前，驗證草酸青霉葡糖淀粉酶定點變體基因序列，并選擇一個質(zhì)粒用于進一步的表達，并命名為ppope001。如wo95/02043中所述制備黑曲霉mbin118的原生質(zhì)體。將100微升原生質(zhì)體懸浮液與2.5μgppope001質(zhì)?；旌?，加入250微升60％peg4000(applichem)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mmcacl2和10mmtris-hclph7.5，并輕緩混合。將混合物在37℃下孵育30分鐘，將原生質(zhì)體在補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖(cove,1996,biochim.biophys.acta133:51-56)中與1％瓊脂糖l(nippongene)混合，并作為頂層加到補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖板上用于轉化體選擇(4ml頂層瓊脂/板)。在37℃下孵育5天之后，撿取16種轉化體的孢子，并種在96深孔mt板中的750μlyp-2％麥芽糖介質(zhì)上。在30℃下靜止培養(yǎng)5天之后，對來自每孔的10μl培養(yǎng)肉湯在sds-page凝膠上進行分析，以基于產(chǎn)生大量葡糖淀粉酶的能力識別最好的轉化體。實施例11純化定點poamg變體pe001將選擇的變體的轉化體和實施例8所述的表達野生型草酸青霉葡糖淀粉酶的菌株在100mlyp-2％麥芽糖介質(zhì)中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物通過0.22μmpes濾器過濾，并應用于之前在50mmnaoac、150mmnaclph4.5緩沖液中平衡過的α-環(huán)糊精親和凝膠柱。用平衡緩沖液從柱中洗去未結合的材料，并使用含有10mmβ-環(huán)糊精的3倍柱體積以上的相同緩沖液洗脫葡糖淀粉酶?？疾煜疵撘旱钠咸堑矸勖富钚?，以判斷葡糖淀粉酶是否已經(jīng)與α-環(huán)糊精親和凝膠結合。然后將純化的葡糖淀粉酶樣品針對20mmnaoacph5.0透析。實施例12表征pe001蛋白酶穩(wěn)定性將40μl于50mm乙酸鈉緩沖液ph4.5中的酶溶液(1mg/ml)與1/10體積的1mg/ml蛋白酶溶液，例如biochemj.1975apr；147(1):45-53中所述的aspergillopepsini或來自sigma的市售產(chǎn)品以及biochemicaljournal[0264-6021]ichishima,2003,371(2):541中所述的aorsin混合，并在4或32℃下孵育過夜。作為對照實驗，將h2o代替蛋白酶加入到樣品中。將樣品裝載到sds-page上，以判斷葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。在sds-page中，pe001僅顯示出一條條帶，其與完整的分子相對應，而野生型葡糖淀粉酶則被蛋白酶降解，在60kca顯示出分子大小較低的條帶。表12蛋白酶處理之后的sds-page結果n.d.：未檢測到。實施例13培養(yǎng)過程中切割較少將變體的曲霉轉化體和野生型草酸青霉葡糖淀粉酶在含有補充有10mm乙酸鈉緩沖液ph4.5的4x稀釋yp-2％麥芽糖介質(zhì)的6孔mt板中在32℃下培養(yǎng)1周。將培養(yǎng)物上清液裝載到sds-page上。表13培養(yǎng)物上清液的sds-page結果n.d.：未檢測到。野生型葡糖淀粉酶在發(fā)酵過程中被宿主蛋白酶切割，而變體僅產(chǎn)生完整的分子。實施例14與親本相比較變體pe001的葡糖淀粉酶活性對于野生型草酸青霉的純化酶和變體葡糖淀粉酶，如上所述考察測量為agu的葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶單位(agu)定義為在標準條件下(37℃，ph4.3，底物：麥芽糖100mm，緩沖液：乙酸鹽0.1m，反應時間6分鐘)每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶的量。表14相對特異性活性agu/mg草酸青霉wt100％草酸青霉pe001(seqidno:14+v79k)102％實施例15純化熱穩(wěn)定性增加的葡糖淀粉酶變體以類似于實施例10所述的方法，可以構建并表達顯示出熱穩(wěn)定性增加的變體。所有變體均源自pe001。在ypm介質(zhì)中表達之后，如下微純化包括t65a或q327f取代的變體：通過0.22μm濾器過濾，回收菌絲體。將50μl柱材料(α-環(huán)糊精，其根據(jù)制造商推薦與mini-leak二乙烯砜活化的瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián))加入到過濾板(whatman,unifilter800μl,25-30μmmbpp)的孔中。柱材料用結合緩沖液(200mm乙酸鈉ph4.5)平衡，通過兩次加入200μl緩沖液，劇烈震搖10分鐘(heidolph,titramax101，1000rpm)并真空除去緩沖液(whatman,univac3)。隨后，加入400μl培養(yǎng)物上清液和100μl結合緩沖液，并在劇烈震搖下孵育板30分鐘。真空除去未結合的材料，并重復結合步驟。通常每個變體使用4孔。然后如下進行3次洗滌步驟：加入200μl離子強度降低的緩沖液(50/10/5mm乙酸鈉，ph4.5)，震搖15分鐘，并真空除去緩沖液。通過兩次加入100μl洗脫緩沖液(250mm乙酸鈉，0.1％α-環(huán)糊精，ph6.0)，震搖15分鐘，并通過真空在微量滴定板中收集洗脫的材料來實現(xiàn)結合amg的洗脫。使用10kda截留的離心過濾裝置(milliporemicroconultracelym-10)將合并的洗脫液濃縮，并將緩沖液換成50mm乙酸鈉ph4.5。將微純化的樣品在-18℃下貯存，直至進行熱穩(wěn)定性測試。實施例16蛋白質(zhì)熱去折疊分析(tsa，熱偏移檢定)使用syproorange(in-vitrogen,s-6650)監(jiān)測t65a和q327f變體的蛋白質(zhì)熱去折疊(thermalunfolding)，并使用實時pcr儀器(appliedbiosystems；step-one-plus)進行。在96孔板中，將25微升大約100微克/ml的50mm乙酸鹽ph4.5中的微純化的樣品與syproorange(所得濃度＝5x；來自供應商的貯存液＝5000x)混合(5:1)。將板用光學pcr封條密封。pcr儀器設定成掃描速率76℃/小時，開始于25℃，結束于96℃。使用syproorange(in-vitrogen,s-6650)監(jiān)測e501v+y504t變體的蛋白質(zhì)熱誘導去折疊，并使用實時pcr儀器(appliedbiosystems；step-one-plus)進行。在96孔板中，在存在或不存在200ppm阿卡波糖(sigmaa8980)的條件下，將15微升大約50微克/ml的50mm乙酸鹽ph4.5中的純化的樣品與syproorange(所得濃度＝5x；來自供應商的貯存液＝5000x)混合(1:1)。將板用光學pcr封條密封。pcr儀器設定成掃描速率76℃/小時，開始于25℃，結束于96℃。使用內(nèi)置的led激發(fā)藍光和rox-濾器(610nm，發(fā)射)，每20秒監(jiān)測熒光。tm-值計算為一階導數(shù)(df/dk)的最大值(參見：gregory等人,2009,j.biomol.screen.14:700)。表15a表15b實施例17通過差示掃描量熱法(dsc)進行熱穩(wěn)定性分析基本上如實施例10所述構建在特定位置處具有取代和/或缺失的其他位點特異性變體，并如實施例11中所述純化。使用vp-毛細管差示掃描量熱計(microcalinc.,piscataway,nj,usa)，通過差示掃描量熱法(dsc)，在ph4.0或4.8(50mm乙酸鈉)下，測定純化的源自po-amgpe001的變體的熱穩(wěn)定性。熱變性溫度td(℃)取為以恒定的程序化加熱速率200k/小時對所選的緩沖液(50mm乙酸鈉，ph4.0或4.8)中的酶溶液加熱之后得到的熱解曲線(cpvs.t)中變性峰(主要吸熱峰)的頂點。將樣品和參照溶液(大約0.3ml)從10℃貯存條件裝載到量熱計中(參照：沒有酶的緩沖液)，并且在20℃到110℃的dsc掃描之前，在20℃下預先熱平衡10分鐘。變性溫度以大約+/-1℃的精度測定。分離的變體和dsc數(shù)據(jù)公開于下表16中。表16實施例18通過熱應激測試和pnpg檢定分析熱穩(wěn)定性從來自實施例10的一種識別的取代變體(識別為pe008)開始，通過熱應激檢定對其他變體進行測試，其中在83℃下熱休克5分鐘之后，檢定來自生長培養(yǎng)物的上清液的葡糖淀粉酶(amg)活性。熱休克之后，測量變體的殘余活性，并在未應激的樣品中測量。po-amgpnpg活性檢定說明：草酸青霉葡糖淀粉酶pnpg活性檢定是光譜測定的終點檢定，其中將樣品分成兩份，并經(jīng)熱應激和不經(jīng)熱應激測量。因此，輸出的數(shù)據(jù)是應激樣品中殘余活性的度量。生長：將無菌微量滴定板(mtp)每孔加入200微升富生長介質(zhì)(ftx-14，無dowfax)。將興趣菌株直接從冷凍的貯液接種到mtp中，接種三份。將基準接種到20孔中。具有介質(zhì)的未接種的孔用作檢定空白。將mtp置于含有濕紙巾的塑料箱中，以防止孵育過程中孔的蒸發(fā)。塑料箱置于34℃下4天。檢定：將50微升上清液轉移至50微升0.5mnaacph4.8中，以得到正確的樣品ph。將50微升稀釋液轉移至pcr板，并在pcr機中在83℃下熱應激5分鐘。剩余一半稀釋液保持在rt下。將20微升兩種應激和未應激的樣品轉移至標準mtp。加入20微升pnpg-底物，使反應開始。將板在rt下孵育1小時。終止反應，并通過加入50微升0.5mna2co3顯色。在405nm處在讀板儀(moleculardevices)上測量黃色。緩沖液：0.5mnaacph4.80.25mnaacph4.8底物，6mmpnpg：15mg4-硝基苯基d-吡喃葡萄糖苷，10ml0.25naacph4.8中終止/顯色溶液：0.5mna2co3數(shù)據(jù)處理：在excel中，將來自應激和未應激樣品的原始abs405數(shù)據(jù)均減去其各自的空白。計算殘余活性(％殘余活性＝(abs未應激(abs未應激–abs應激))/abs未應激*100％)，并相對于基準po-amg0008作圖。表17表18實施例19測試根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定性變體的葡糖淀粉酶活性使用實施例18中所述的pnpg檢定，確認表16、17和18中公開的所有上述變體在培養(yǎng)物上清液上的葡糖淀粉酶活性。實施例20使用(α-淀粉酶1407或369)和蛋白酶pfu用于液化的乙醇制造該實驗的目的在于評價α-淀粉酶1407和α-淀粉酶369與源自強烈熾熱球菌的蛋白酶pfu組合在ph4.8、5.3和5.8下在85℃下液化2小時的過程中加入的應用性能。液化(labomat)每次液化接收磨碎的玉米(85.6％ds)、backset(6.27％ds)和自來水，目標為總重量140g，32.50％干固體(ds)。backset以總漿料重量的30％w/w混合。最初的漿料ph大約為5.2，并在液化之前使用50％w/w氫氧化鈉或40％v/v硫酸調(diào)節(jié)至ph4.8、5.3或5.8。根據(jù)以下表19中列出的實驗設計加入所有的酶。液化使用以下條件在labomat中發(fā)生：5℃/分鐘躍變，躍變17分鐘，103分鐘保持時間，整個運行中40rpm，200ml不銹鋼筒。液化之后，將所有的筒在冰浴中冷卻，并在ssf下基于以下列出的方案準備發(fā)酵。同時糖化和發(fā)酵(ssf)將各個醪液用50％w/w氫氧化鈉或40％v/v硫酸調(diào)節(jié)至ph5.0。向各個醪液應用青霉素，至總濃度為3ppm。通過相對于每15ml預先打孔以允許co2釋放的試管中等分大約4.5g醪液，將試管準備為具有醪液。將葡糖淀粉酶bl2以0.54agu/gds投放至每個醪液試管，每個試管中加最少的水，以使固體標準化，并且每個醪液樣品均接收100μl再水化的酵母。再水化的酵母通過將5.5gfermentisredstar混合到100ml32℃自來水中至少15分鐘而制備。hplc分析發(fā)酵大約54小時后進行發(fā)酵取樣。每個樣品用50μl40％v/vh2so4滅活，渦流，在1460×g下離心10分鐘，并通過0.45μmwhatmanpp濾器過濾。在hplc下分析54小時樣品而無需進一步稀釋。在hplc分析之前和過程中，樣品貯存在4℃。該方法使用乙醇校正標準(％w/v)對分析物進行定量。使用包括原點的四點校正進行定量。當適用時，使用jmp軟件(cary,nc)以使用tukey-kramerhsd或dunnett’s進行配對的單因素方差分析來對數(shù)據(jù)進行分析。通過將單因素方差分析的標準誤差乘以1.96，建立表示95％置信水平的誤差條。表19.液化實驗設計結果：這些結果表明，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和熱穩(wěn)定性蛋白酶在液化中可以一起使用，以便與單獨的α-淀粉酶a(aaa)相比較增加乙醇的產(chǎn)率。總結性段落本發(fā)明在權利要求和所附說明書中定義。出于方便起見，本發(fā)明的其他方面在此通過編號段落的方式給出：1.一種由含有淀粉的材料制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶；-在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和-任選的產(chǎn)生碳水化合物源的酶；ii)使用產(chǎn)生碳水化合物源的酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。2.根據(jù)段落1所述的方法，其在液化步驟i)之前還包括以下步驟：a)優(yōu)選地通過干磨降低含有淀粉的材料的粒徑；b)形成包括含有淀粉的材料和水的漿料。3.根據(jù)段落1-2中任一段所述的方法，其中將至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、特別是至少90％的含有淀粉的材料通過具有#6篩網(wǎng)的篩子。4.根據(jù)段落1-3中任一段所述的方法，其中液化過程中ph為大于5.0至6.5，例如大于5.0至6.0，例如大于5.0至5.5，例如5.2-6.2，例如大約5.2，例如大約5.4，例如大約5.6，例如大約5.8。5.根據(jù)段落1-4中任一段所述的方法，其中液化過程中溫度范圍為70-100℃，例如75-95℃，例如75-90℃，優(yōu)選80-90℃，例如，大約85℃。6.根據(jù)段落1-5中任一段所述的方法，其中在步驟i)中的液化之后進行噴射烹煮(jet-cooking)步驟。7.根據(jù)段落6所述的方法，其中噴射烹煮在110-145℃，優(yōu)選120-140℃，例如125-135℃，優(yōu)選大約130℃的溫度下進行大約1-15分鐘，優(yōu)選大約3-10分鐘，特別是大約5分鐘。8.根據(jù)段落1-7中任一段所述的方法，其中糖化和發(fā)酵順序進行或同時進行。9.根據(jù)段落1-8中任一段所述的方法，其中糖化在20-75℃，優(yōu)選40-70℃，例如大約60℃的溫度下，在4-5的ph下進行。10.根據(jù)段落1-9中任一段所述的方法，其中發(fā)酵或同時的糖化和發(fā)酵(ssf)在25℃-45℃，例如28℃-35℃，例如30℃-34℃，優(yōu)選大約32℃的溫度下進行。在一實施方式中，發(fā)酵持續(xù)進行6-120小時，特別是24-96小時。11.根據(jù)段落1-10中任一段所述的方法，其中在發(fā)酵之后，例如通過蒸餾，回收發(fā)酵產(chǎn)物。12.根據(jù)段落1-11中任一段所述的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇，優(yōu)選乙醇，特別是燃料乙醇、可飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇。13.根據(jù)段落1-12中任一段所述的方法，其中含有淀粉的起始原料是全谷物。14.根據(jù)段落1-13中任一段所述的方法，其中含有淀粉的材料源自玉米、小麥、大麥、黑麥、蜀黍(milo)、西米、木薯(cassava)、樹薯(manioc)、木薯粉(tapioca)、高粱、大米或馬鈴薯。15.根據(jù)段落1-14中任一段所述的方法，其中發(fā)酵有機體是酵母，優(yōu)選酵母屬(saccharomyces)菌株，特別是釀酒酵母(saccharomycescerevisae)菌株。16.根據(jù)段落1-15中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶是細菌或真菌α-淀粉酶。17.根據(jù)段落1-16中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶來自芽孢桿菌(bacillus)屬，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，例如wo99/019467中的seqidno:3或本文seqidno:1所示者。18.根據(jù)段落17所述的方法，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或其變體截短的，優(yōu)選至具有大約491個氨基酸，例如480-495個氨基酸。19.根據(jù)段落17或18中任一段所述的方法，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶具有i181+g182位處的雙缺失以及任選的n193f取代，或r179和g180缺失(編號使用seqidno:1)。20.根據(jù)段落17-19中任一段所述的方法，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在s242位具有取代，優(yōu)選s242q取代。21.根據(jù)段落17-20中任一段所述的方法，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在e188位具有取代，優(yōu)選e188p取代。22.根據(jù)段落1-21中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。24.根據(jù)段落1-22中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶選自除i181*+g182*和任選的n193f以外還具有以下突變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體：24.根據(jù)段落1-22中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用seqidno:1)。25.根據(jù)段落1-24中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于25％。26.根據(jù)段落1-25中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％。27.根據(jù)段落1-26中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為20-50％，例如20-40％，例如20-30％。28.根據(jù)段落1-27中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為50-115％，例如50-70％，例如50-60％，例如100-120％，例如105-115％。29.根據(jù)段落1-28中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性大于10％，例如，大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。30.根據(jù)段落1-29中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為10-50％，例如10-30％，例如10-25％。31.根據(jù)段落1-30中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃下使用zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性大于60％，例如大于90％，例如大于100％，例如大于110％。32.根據(jù)段落1-31中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃下使用zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性為60-120％，例如70-120％，例如90-120％，例如100-120％，例如110-120％。33.根據(jù)段落1-32中任一段所述的方法，其中蛋白酶是真菌來源的。34.根據(jù)段落1-33中任一段所述的方法，其中蛋白酶是源自以下的金屬蛋白酶的變體：嗜熱子囊菌屬菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)菌株，特別是嗜熱子囊菌cgmccno.0670。35.根據(jù)段落1-34中任一段所述的方法，其中蛋白酶是公開為以下的金屬蛋白酶的變體：wo2003/048353中所公開的seqidno:2的成熟部分，或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分，突變選自以下：-s5*+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-s5*+n26r+d79l+s87p+a112p+d142l；-n26r+t46r+d79l+s87p+a112p+d142l；-t46r+d79l+s87p+t116v+d142l；-d79l+p81r+s87p+a112p+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+a126v+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+d142l；-s38t+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+s87p+n98c+a112p+g135c+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l+t141c+m161c；-s36p+d79l+s87p+a112p+d142l；-a37p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s49p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s50p+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+y97w+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+y97w+d104p+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+a126v+d142l；-y82f+s87g+s70v+d79l+d104p+a112p+d142l；-y82f+s87g+d79l+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+d142l；和-d79l+s87p+d142l。36.根據(jù)段落1-35中任一段所述的方法，其中蛋白酶是公開為以下的金屬蛋白酶的變體：wo2003/048353中所公開的seqidno:2的成熟部分，或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分，其具有以下突變：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。37.根據(jù)段落1-36中任一段所述的方法，其中蛋白酶變體與wo2003/048353中所公開的seqidno:2的多肽的成熟部分或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分具有至少75％同一性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％同一性。38.根據(jù)段落1-37中任一段所述的方法，其中seqidno:3中所示的橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶的蛋白酶變體是以下之一：-d79ls87pd142l-d79ls87pa112pd142l-d79ly82fs87pa112pd142l-s38td79ls87pa112pa126vd142l-d79ly82fs87pa112pa126vd142l-a27kd79ls87pa112pa126vd142l-s49pd79ls87pa112pd142l-s50pd79ls87pa112pd142l-d79ls87pd104pa112pd142l-d79ly82fs87ga112pd142l-s70vd79ly82fs87gy97wa112pd142l-d79ly82fs87gy97wd104pa112pd142l-s70vd79ly82fs87ga112pd142l-d79ly82fs87gd104pa112pd142l-d79ly82fs87ga112pa126vd142l-y82fs87gs70vd79ld104pa112pd142l-y82fs87gd79ld104pa112pa126vd142l-a27kd79ly82fs87gd104pa112pa126vd142l。39.根據(jù)段落1-38中任一段所述的方法，其中蛋白酶是細菌來源的。40.根據(jù)段落1-39中任一段所述的方法，其中蛋白酶源自熾熱球菌屬(pyrococcus)菌株，優(yōu)選強烈熾熱球菌(pyrococcusfuriosus)菌株。41.根據(jù)段落1-40中任一段所述的方法，其中蛋白酶是us6,358,726中的seqidno:1或本文的seqidno:13所示者。42.根據(jù)段落1-41中任一段所述的方法，其中蛋白酶是與us6,358,726中的seqidno:1或本文的seqidno:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。43.根據(jù)段落1-42中任一段所述的方法，其中在液化步驟i)過程中存在和/或加入產(chǎn)生碳水化合物源的酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶。44.根據(jù)段落1-43中任一段所述的方法，其中在液化步驟i)過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在85℃、ph5.3的條件下熱穩(wěn)定性為至少20％，例如至少30％，優(yōu)選至少35％的葡糖淀粉酶。45.根據(jù)段落43-44中任一段所述的方法，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在最佳ph5.0的ph下相對活性為至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％的葡糖淀粉酶。46.根據(jù)段落43-45中任一段所述的方法，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在ph5.0下ph穩(wěn)定性為至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶。47.根據(jù)段落43-46中任一段所述的方法，其中在液化步驟i)過程中存在和/或加入的產(chǎn)生碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，其優(yōu)選源自青霉菌(penicillium)屬菌株，特別是草酸青霉(penicilliumoxalicum)菌株，公開為wo2011/127802中的seqidno:2或本文中的seqidnos:9或14。48.根據(jù)段落43-47中任一段所述的方法，其中葡糖淀粉酶與wo2011/127802中的seqidno:2或本文中的seqidnos:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。49.根據(jù)段落43-48中任一段所述的方法，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是具有k79v取代的公開為wo2011/127802中的seqidno:2的源自草酸青霉菌株的葡糖淀粉酶的變體(編號使用seqidno:14所示的成熟序列)。50.根據(jù)段落43-49中任一段所述的方法，其中草酸青霉葡糖淀粉酶具有k79v取代(編號使用seqidno:14)以及以下之一：t65a；或q327f；或e501v；或y504t；或y504*；或t65a+q327f；或t65a+e501v；或t65a+y504t；或t65a+y504*；或q327f+e501v；或q327f+y504t；或q327f+y504*；或e501v+y504t；或e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v；或t65a+q327f+y504t；或t65a+e501v+y504t；或q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+y504*；或t65a+e501v+y504*；或q327f+e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504*；e501v+y504t；或t65a+k161s；或t65a+q405t；或t65a+q327w；或t65a+q327f；或t65a+q327y；或p11f+t65a+q327f；或r1k+d3w+k5q+g7v+n8s+t10k+p11s+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或r1e+d3n+p4g+g6r+g7a+n8a+t10d+p11d+t65a+q327f；或p11f+t65a+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+s105p+q327w；或t65a+s105p+q327f；或t65a+q327w+s364p；或t65a+q327f+s364p；或t65a+s103n+q327f；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502t+p563s+k571e；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+n564d+k571s；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v325t+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+i375a+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k218a+k221d+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10d+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+f12y+t65a+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t568n；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+f80*+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k112s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+n502t+y504*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79g+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79i+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79l+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+l72v+q327f+e501v+y504t；或s255n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+e74n+v79k+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+g220n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+y245n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q253n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+d279n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s359n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d370n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460t+p468t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t463n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s465n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t477n+e501v+y504t。51.根據(jù)段落43-50中任一段所述的方法，進一步地，其中在糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入葡糖淀粉酶。52.根據(jù)段落1-51中任一段所述的方法，其中糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶是真菌來源的，優(yōu)選來自曲霉屬(aspergillus)菌株，優(yōu)選黑曲霉(a.niger)、泡盛曲霉(a.awamori)或米曲霉(a.oryzae)；或木霉屬(trichoderma)菌株，優(yōu)選里氏木霉(t.reesei)；或踝節(jié)菌屬(talaromyces)菌株，優(yōu)選埃默森踝節(jié)菌(t.emersonii)，或密孔菌屬(pycnoporus)菌株，或褐褶菌屬(gloephyllum菌株)，或黑層孔菌屬(nigrofomes)菌株。53.根據(jù)段落1-52中任一段所述的方法，進一步地，其中在液化和/或糖化過程中存在支鏈淀粉酶。54.根據(jù)段落53所述的方法，其中在液化步驟i)過程中存在或加入的支鏈淀粉酶是gh57家族支鏈淀粉酶，其中支鏈淀粉酶優(yōu)選包括wo2011/087836中公開的x47結構域。55.根據(jù)段落53-54所述的方法，其中支鏈淀粉酶源自thermococcus屬菌株，其包括嗜熱高溫球菌和熱水高溫球菌或其雜交體。56.根據(jù)段落53-55中任一段所述的方法，其中支鏈淀粉酶是在x4位截短的熱水高溫球菌支鏈淀粉酶，或具有截短x4位的熱水高溫球菌/嗜熱高溫球菌雜交酶，公開于wo2011/087836或示于本文的seqidno:12。57.根據(jù)段落1-56中任一段所述的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶；-在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的源自強烈熾熱球菌或橙橘嗜熱子囊菌的蛋白酶；和-任選的草酸青霉葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。58.根據(jù)段落1-56所述的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。59.根據(jù)段落1-56所述的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-6.0的ph范圍下在80-90℃的溫度下使含有淀粉的材料液化：-α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。60.根據(jù)段落1-56所述的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-7.0的ph范圍下在高于初始凝膠化溫度的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182和任選的取代n193f；并任選地進一步具有以下組取代之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文中的seqidno:1)；-源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌的在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和任選地，-具有選自以下的取代的seqidno:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(編號使用seqidno:14)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。61.根據(jù)段落1-56中任一段所述的方法，其包括以下步驟：i)在5.0-6.0的ph范圍下在80-90℃的溫度下使用以下物質(zhì)使含有淀粉的材料液化：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182和任選的取代n193f；并任選地進一步具有以下組取代之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文中的seqidno:1)；-源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌的在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和任選地，-具有選自以下的取代的seqidno:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(編號使用seqidno:14)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵有機體進行發(fā)酵。62.根據(jù)段落57-61中任一段所述的方法，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(本文中seqidno:1)是成熟的α-淀粉酶或與seqidno:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟α-淀粉酶。63.根據(jù)段落57-61中任一段所述的方法，其中強烈熾熱球菌蛋白酶(seqidno:13)和/或橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶(seqidno:3)是成熟的蛋白酶或分別與seqidno:13或seqidno:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟蛋白酶。64.根據(jù)段落57-61中任一段所述的方法，其中草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的seqidno:14)或其變體是成熟的葡糖淀粉酶或與本文seqidno:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟葡糖淀粉酶。65.一種酶組合物，其包括：i)α-淀粉酶；ii)在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和任選地，iii)產(chǎn)生碳水化合物源的酶。66.根據(jù)段落65所述的組合物，其中α-淀粉酶是細菌或真菌的α-淀粉酶。67.根據(jù)段落65-66中任一段所述的組合物，其中α-淀粉酶來自芽孢桿菌屬，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，例如wo99/019467中的seqidno:3或本文seqidno:1所示者。68.根據(jù)段落67所述的組合物，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或其變體是截短的，優(yōu)選至具有大約491個氨基酸，例如480-495個氨基酸。69.根據(jù)段落65-68中任一段所述的組合物，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶具有i181+g182位處的雙缺失以及任選的n193f取代，或者r179和g180缺失(編號使用seqidno:1)。70.根據(jù)段落65-69中任一段所述的組合物，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在s242位具有取代，優(yōu)選s242q取代。71.根據(jù)段落65-70中任一段所述的組合物，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在e188位具有取代，優(yōu)選e188p取代。72.根據(jù)段落65-71中任一段所述的組合物，其中α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。73.根據(jù)段落65-72中任一段所述的組合物，其中α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s。74.根據(jù)段落65-73中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于25％。75.根據(jù)段落65-74中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％。76.根據(jù)段落65-75中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為20-50％，例如20-40％，例如20％和30％。77.根據(jù)段落65-76中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為50-115％，例如50-70％，例如50-60％，例如100-120％，例如105-115％。78.根據(jù)段落65-77中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在85℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性大于10％，例如，大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。79.根據(jù)段落65-78中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在85℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性為10-50％，例如10-30％，例如10-25％。80.根據(jù)段落65-79中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在85℃下使用zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性大于60％，例如大于90％，例如大于100％，例如大于110％。81.根據(jù)段落65-80中任一段所述的組合物，其中蛋白酶在85℃下使用zein-bca檢定測定的熱穩(wěn)定性為60-120％，例如70-120％，例如80-120％，例如90-120％，例如100-120％，例如110-120％。82.根據(jù)段落65-81中任一段所述的組合物，其中蛋白酶是真菌來源的。83.根據(jù)段落65-82中任一段所述的組合物，其中蛋白酶是源自以下的金屬蛋白酶的變體：嗜熱子囊菌屬菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌菌株，特別是橙橘嗜熱子囊菌cgmccno.0670。84.根據(jù)段落65-83中任一段所述的組合物，其中蛋白酶是公開為以下的金屬蛋白酶的變體：wo2003/048353中所公開的seqidno:2的成熟部分，或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分，其具有以下突變：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。85.根據(jù)段落65-84中任一段所述的組合物，其中蛋白酶變體與wo2003/048353中所公開的seqidno:2的多肽的成熟部分或wo2010/008841中的seqidno:1或本文的seqidno:3的成熟部分具有至少75％的同一性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的同一性。86.根據(jù)段落65-85中任一段所述的組合物，其中seqidno:3所示的橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶的蛋白酶變體是以下之一：-d79ls87pd142l-d79ls87pa112pd142l-d79ly82fs87pa112pd142l-s38td79ls87pa112pa126vd142l-d79ly82fs87pa112pa126vd142l-a27kd79ls87pa112pa126vd142l-s49pd79ls87pa112pd142l-s50pd79ls87pa112pd142l-d79ls87pd104pa112pd142l-d79ly82fs87ga112pd142l-s70vd79ly82fs87gy97wa112pd142l-d79ly82fs87gy97wd104pa112pd142l-s70vd79ly82fs87ga112pd142l-d79ly82fs87gd104pa112pd142l-d79ly82fs87ga112pa126vd142l-y82fs87gs70vd79ld104pa112pd142l-y82fs87gd79ld104pa112pa126vd142l-a27kd79ly82fs87gd104pa112pa126vd142l。87.根據(jù)段落65-86中任一段所述的組合物，其中蛋白酶是細菌來源的。88.根據(jù)段落65-87中任一段所述的組合物，其中蛋白酶源自熾熱球菌屬菌株，優(yōu)選強烈熾熱球菌菌株。89.根據(jù)段落65-88中任一段所述的組合物，其中蛋白酶是us6,358,726中的seqidno:1或本文的seqidno:13所示者。90.根據(jù)段落65-89中任一段所述的組合物，其中蛋白酶是與us6,358,726中的seqidno:1或本文的seqidno:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。91.根據(jù)段落65-90中任一段所述的組合物，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶。92.根據(jù)段落65-91中任一段所述的組合物，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在85℃、ph5.3的條件下熱穩(wěn)定性為至少20％，例如至少30％，優(yōu)選至少35％的葡糖淀粉酶。93.根據(jù)段落64-92中任一段所述的組合物，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在最佳ph5.0的ph下相對活性為至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％的葡糖淀粉酶。94.根據(jù)段落65-93中任一段所述的組合物，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是在ph5.0下ph穩(wěn)定性為至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶。95.根據(jù)段落65-94中任一段所述的組合物，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，其優(yōu)選源自青霉菌屬菌株，特別是草酸青霉菌株，公開為wo2011/127802中的seqidno:2或本文中的seqidnos:9或14。96.根據(jù)段落65-95中任一段所述的組合物，其中葡糖淀粉酶與wo2011/127802中的seqidno:2或本文中的seqidnos:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，再更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，再最優(yōu)選至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。97.根據(jù)段落65-96中任一段所述的組合物，其中產(chǎn)生碳水化合物源的酶是具有k79v取代的公開為wo2011/127802中的seqidno:2的源自草酸青霉菌株的葡糖淀粉酶的變體(編號使用seqidno:14所示的成熟序列)。98.根據(jù)段落65-96中任一段所述的組合物，還包括葡糖淀粉酶。99.根據(jù)段落65-98中任一段所述的組合物，其中糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶是真菌來源的，優(yōu)選來自曲霉屬菌株，優(yōu)選黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉屬菌株，優(yōu)選里氏木霉；或踝節(jié)菌屬菌株，優(yōu)選埃默森踝節(jié)菌，或密孔菌屬菌株，或褐褶菌屬菌株，或黑層孔菌屬菌株。100.根據(jù)段落65-98中任一段所述的組合物，還包括支鏈淀粉酶。101.根據(jù)段落100所述的組合物，其中支鏈淀粉酶是gh57家族支鏈淀粉酶，其中支鏈淀粉酶優(yōu)選包括wo2011/087836中公開的x47結構域。102.根據(jù)段落100-101所述的組合物，其中支鏈淀粉酶源自thermococcus屬菌株，其包括嗜熱高溫球菌和熱水高溫球菌或其雜交體。103.根據(jù)段落100-102中任一段所述的組合物，其中支鏈淀粉酶是在x4位截短的熱水高溫球菌支鏈淀粉酶，或具有截短x4位的熱水高溫球菌/嗜熱高溫球菌雜交酶，公開于wo2011/087836或示于本文的seqidno:12。104.根據(jù)段落65-103中任一段所述的組合物，其包括：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶；-在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的源自強烈熾熱球菌或橙橘嗜熱子囊菌的蛋白酶；和-任選的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。105.根據(jù)段落65-104所述的組合物，其包括：-α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2的條件下的t1/2(分鐘)為至少10；-蛋白酶，優(yōu)選源自強烈熾熱球菌或橙橘嗜熱子囊菌，在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％；和-任選的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。106.根據(jù)段落64-104所述的組合物，其包括：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182和任選的取代n193f；并任選地進一步具有以下組取代之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(編號使用本文中的seqidno:1)；-優(yōu)選源自強烈熾熱球菌和/或橙橘嗜熱子囊菌的在80℃/70℃下測定為相對活性的熱穩(wěn)定性值大于20％的蛋白酶；和-任選的具有選自以下的取代的seqidno:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(編號使用seqidno:14)。107.根據(jù)段落65-106中任一段所述的組合物，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(本文中seqidno:1)或其變體是成熟的α-淀粉酶或與seqidno:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟α-淀粉酶。108.根據(jù)段落65-107中任一段所述的組合物，其中強烈熾熱球菌蛋白酶(seqidno:13)和/或橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶(seqidno:3)或其變體是成熟的蛋白酶或分別與seqidno:13或seqidno:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟蛋白酶。109.根據(jù)段落65-108中任一段所述的組合物，其中草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的seqidno:14)或其變體是成熟的葡糖淀粉酶或與本文seqidno:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相應的成熟葡糖淀粉酶。110.一種變體α-淀粉酶，其在與59、89、129、177、179、254、284位相對應的位置處包括突變，其中變體與seqidno:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且變體具有α-淀粉酶活性。111.根據(jù)段落110所述的變體，其在與59位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp或tyr，特別是以ala、gln、glu、gly、ile、leu、pro或thr進行的取代。112.根據(jù)段落110或111所述的變體，其在與89位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以arg、his或lys進行的取代。113.根據(jù)段落110-112中任一段所述的變體，其在與129位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以ala、thr或val進行的取代。114.根據(jù)段落110-113中任一段所述的變體，其在與177位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以arg、leu或met進行的取代。115.根據(jù)段落110-114中任一段所述的變體，其在與179位相對應的位置處包括以ala、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以gln、glu、ile、leu、lys或val進行的取代。116.根據(jù)段落110-115中任一段所述的變體，其在與254位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以ala、ser或thr進行的取代。117.根據(jù)段落110-116中任一段所述的變體，其在與284位相對應的位置處包括以ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val，特別是以his、thr或val進行的取代。118.根據(jù)段落110-117中任一段所述的變體，其包括以下突變或由以下突變組成：v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v。119.根據(jù)段落110-1120中任一段所述的變體，其是來自以下多肽的親本α-淀粉酶的變體：上述多肽與本文seqidno:1的成熟多肽或者具有α-淀粉酶活性的seqidno:1的成熟多肽的片段具有至少60％的序列同一性。120.根據(jù)段落119所述的變體，其中親本α-淀粉酶與seqidno:1的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，和100％的序列同一性。121.根據(jù)段落120所述的變體，其中親本α-淀粉酶包括seqidno:1的成熟多肽的氨基酸序列或者由其組成。122.根據(jù)段落121所述的變體，其中親本α-淀粉酶是seqidno:1的成熟多肽的氨基酸序列的片段，其中該片段具有α-淀粉酶活性。123.根據(jù)段落110-122中任一段所述的變體，其是親本野生型α-淀粉酶的變體。124.根據(jù)段落123所述的變體，其中親本α-淀粉酶是芽孢桿菌屬α-淀粉酶。125.根據(jù)段落124所述的變體，其中親本α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶。126.根據(jù)段落110-125中任一段所述的變體，其中α-淀粉酶是包括以下突變的seqidno:1所示的α-淀粉酶：i181+g182位的雙缺失以及任選的n193f取代，或r179+g180位的雙缺失。127.根據(jù)段落126所述的變體，其包括以下突變或者由其組成：i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v(編號使用seqidno:1)。128.根據(jù)段落110-127中任一段所述的變體，其與親本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。129.根據(jù)段落110-1128中任一段所述的變體，其與seqidno:1的成熟多肽具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。130.根據(jù)段落110-129中任一段所述的變體，其中α-淀粉酶變體具有(天然)截短的本文seqidno:1所示的序列，使得其長度為大約491個氨基酸，例如長度為480-495個氨基酸。131.根據(jù)段落110-130中任一段所述的變體，其中α-淀粉酶變體是具有以下突變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶：i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v，截短至491個氨基酸(編號使用seqidno:1)。132.根據(jù)段落110-131中任一段所述的變體用于洗滌和/或洗碗的用途。133.根據(jù)段落110-131中任一段所述的變體用于使紡織品退漿的用途。134.根據(jù)段落110-131中任一段所述的變體用于制造焙烤產(chǎn)品的用途。135.根據(jù)段落110-131中任一段所述的變體用于使含有淀粉的材料液化的用途。136.一種制造液化淀粉的方法，其包括用段落110-131中任一段所述的變體使含有淀粉的材料液化。137.一種分離的多核苷酸，其編碼段落110-131中任一段所述的變體。138.一種核酸構建物，其包括段落137所述的多核苷酸。139.一種表達載體，其包括段落138所述的核酸構建物。140.一種宿主細胞，其包括段落136所述的核酸構建物。141.一種制造變體α-淀粉酶的方法，其包括：a.在適合于變體表達的條件下培養(yǎng)段落140所述的宿主細胞；和b.從介質(zhì)中回收變體。142.一種用段落137所述的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。143.一種用于獲得變體α-淀粉酶的方法，其包括：a.在與59、89、129、177、179、254、284位相對應的位置處向親本α-淀粉酶中引入突變，其中變體與seqidno:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且變體具有α-淀粉酶活性；和b.回收變體。144.根據(jù)段落143所述的變體，其中成熟多肽是包括以下突變的seqidno:1所示的α-淀粉酶：i181+g182位的雙缺失，和任選的n193f取代，或r179+g180位的雙缺失。本文描述并要求保護的發(fā)明范圍并不受在此公開的具體方面的限制，因為這些方面是要作為本發(fā)明若干方面的示例說明。任何等同的方面是要落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除本文示出和描述的之外，根據(jù)前述描述得出本發(fā)明的各種修改方式對于本領域技術人員來說也是顯而易見的。這些修改方式也要落入所附權利要求的范圍之內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本發(fā)明的公開內(nèi)容為準。序列表<110>諾維信公司r·戴因哈默j·克雷格松井知子高木忍s·克拉克j·馬修斯a·g·尤爾曼德c-l·宋<120>用于制造發(fā)酵產(chǎn)物的方法<130>12075-wo-pct<160>21<170>專利版本3.5<210>1<211>515<212>prt<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌<220><221>mat_peptide<222>(1)..(515)<400>1alaalapropheasnglythrmetmetglntyrpheglutrptyrleu151015proaspaspglythrleutrpthrlysvalalaasnglualaasnasn202530leuserserleuglyilethralaleutrpleuproproalatyrlys354045glythrserargseraspvalglytyrglyvaltyraspleutyrasp505560leuglyglupheasnglnlysglythrvalargthrlystyrglythr65707580lysalaglntyrleuglnalaileglnalaalahisalaalaglymet859095glnvaltyralaaspvalvalpheasphislysglyglyalaaspgly100105110thrglutrpvalaspalavalgluvalasnproseraspargasngln115120125gluileserglythrtyrglnileglnalatrpthrlyspheaspphe130135140proglyargglyasnthrtyrserserphelystrpargtrptyrhis145150155160pheaspglyvalasptrpaspgluserarglysleuserargiletyr165170175lyspheargglyileglylysalatrpasptrpgluvalaspthrglu180185190asnglyasntyrasptyrleumettyralaaspleuaspmetasphis195200205progluvalvalthrgluleulysasntrpglylystrptyrvalasn210215220thrthrasnileaspglypheargleuaspalavallyshisilelys225230235240pheserphepheproasptrpleusertyrvalargserglnthrgly245250255lysproleuphethrvalglyglutyrtrpsertyraspileasnlys260265270leuhisasntyrilethrlysthrasnglythrmetserleupheasp275280285alaproleuhisasnlysphetyrthralaserlysserglyglyala290295300pheaspmetargthrleumetthrasnthrleumetlysaspglnpro305310315320thrleualavalthrphevalaspasnhisaspthrgluproglygln325330335alaleuglnsertrpvalaspprotrpphelysproleualatyrala340345350pheileleuthrargglngluglytyrprocysvalphetyrglyasp355360365tyrtyrglyileproglntyrasnileproserleulysserlysile370375380aspproleuleuilealaargargasptyralatyrglythrglnhis385390395400asptyrleuasphisseraspileileglytrpthrarggluglyval405410415thrglulysproglyserglyleualaalaleuilethraspglypro420425430glyglyserlystrpmettyrvalglylysglnhisalaglylysval435440445phetyraspleuthrglyasnargseraspthrvalthrileasnser450455460aspglytrpglygluphelysvalasnglyglyservalservaltrp465470475480valproarglysthrthrvalserthrilealaargproilethrthr485490495argprotrpthrglygluphevalargtrpthrgluproargleuval500505510alatrppro515<210>2<211>1068<212>dna<213>橙橘嗜熱子囊菌<220><221>cds<222>(1)..(1065)<220><221>misc_signal<222>(1)..(57)<220><221>misc_feature<222>(58)..(534)<220><221>mat_peptide<222>(535)..(1068)<400>2atgcggctcgttgcttccctaacggccttggtggccttgtccgta45metargleuvalalaserleuthralaleuvalalaleuserval-175-170-165cctgtctttcccgctgctgtcaacgtgaagcgtgcttcgtcctac90provalpheproalaalavalasnvallysargalasersertyr-160-155-150ctggagatcactctgagccaggtcagcaacactctgatcaaggcc135leugluilethrleuserglnvalserasnthrleuilelysala-145-140-135gtggtccagaacactggtagcgacgagttgtccttcgttcacctg180valvalglnasnthrglyseraspgluleuserphevalhisleu-130-125-120aacttcttcaaggaccccgctcctgtcaaaaaggtatcggtctat225asnphephelysaspproalaprovallyslysvalservaltyr-115-110-105cgcgatgggtctgaagtgcagttcgagggcattttgagccgctacaaa273argaspglysergluvalglnphegluglyileleuserargtyrlys-100-95-90tcgactggcctctctcgtgacgcctttacttatctggctcccggagag321serthrglyleuserargaspalaphethrtyrleualaproglyglu-85-80-75tccgtcgaggacgtttttgatattgcttcgacttacgatctgaccagc369servalgluaspvalpheaspilealaserthrtyraspleuthrser-70-65-60ggcggccctgtaactatccgtactgagggagttgttccctacgccacg417glyglyprovalthrileargthrgluglyvalvalprotyralathr-55-50-45-40gctaacagcactgatattgccggctacatctcatactcgtctaatgtg465alaasnserthraspilealaglytyrilesertyrserserasnval-35-30-25ttgaccattgatgtcgatggcgccgctgctgccactgtctccaaggca513leuthrileaspvalaspglyalaalaalaalathrvalserlysala-20-15-10atcactcctttggaccgccgcactaggatcagttcctgctccggcagc561ilethrproleuaspargargthrargilesersercysserglyser-5-115agacagagcgctcttactacggctctcagaaacgctgcttctcttgcc609argglnseralaleuthrthralaleuargasnalaalaserleuala10152025aacgcagctgccgacgcggctcagtctggatcagcttcaaagttcagc657asnalaalaalaaspalaalaglnserglyseralaserlyspheser303540gagtacttcaagactacttctagctctacccgccagaccgtggctgcg705glutyrphelysthrthrserserserthrargglnthrvalalaala455055cgtcttcgggctgttgcgcgggaggcatcttcgtcttcttcgggagcc753argleuargalavalalaargglualaserserserserserglyala606570accacgtactactgcgacgatccctacggctactgttcctccaacgtc801thrthrtyrtyrcysaspaspprotyrglytyrcysserserasnval758085ctggcttacaccctgccttcatacaacataatcgccaactgtgacatt849leualatyrthrleuprosertyrasnileilealaasncysaspile9095100105ttctatacttacctgccggctctgaccagtacctgtcacgctcaggat897phetyrthrtyrleuproalaleuthrserthrcyshisalaglnasp110115120caagcgaccactgcccttcacgagttcacccatgcgcctggcgtctac945glnalathrthralaleuhisgluphethrhisalaproglyvaltyr125130135agccctggcacggacgacctggcgtatggctaccaggctgcgatgggt993serproglythraspaspleualatyrglytyrglnalaalametgly140145150ctcagcagcagccaggctgtcatgaacgctgacacctacgctctctat1041leuserserserglnalavalmetasnalaaspthrtyralaleutyr155160165gcgaatgccatataccttggttgctaa1068alaasnalailetyrleuglycys170175<210>3<211>355<212>prt<213>橙橘嗜熱子囊菌<400>3metargleuvalalaserleuthralaleuvalalaleuserval-175-170-165provalpheproalaalavalasnvallysargalasersertyr-160-155-150leugluilethrleuserglnvalserasnthrleuilel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