產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明是基于申請日為2008年6月27日，申請?zhí)枮?200880021367. 4"（國際申 請?zhí)枮镻CT/US2008/068575)，發(fā)明名稱為"產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法"的專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及使用一種或多種發(fā)酵生物體從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的 方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 由于化石燃料的有限儲量和關(guān)于溫室氣體排放的擔(dān)憂，對于使用可再生能源有越 來越多的關(guān)注。
[0004] 從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物是本領(lǐng)域已知的，且包括將含木質(zhì)纖維素材 料預(yù)處理、水解和發(fā)酵。
[0005] 發(fā)酵步驟使用能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物體進(jìn)行。在將發(fā) 酵生物體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中后，它經(jīng)過許多階段。起始階段稱作"遲滯期"且為其中未產(chǎn) 生顯著量的發(fā)酵產(chǎn)物的適應(yīng)期。在接下來的生長增加的稱作"指數(shù)期"和作為在最大生長 后的階段的稱作"穩(wěn)定期"的兩個階段中，產(chǎn)生顯著量的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵循環(huán)通常可進(jìn)行多 至96小時或更長，使得每個循環(huán)耗時且昂貴。
[0006] 從含木質(zhì)纖維素材料或纖維素"生物質(zhì)"中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝還受到發(fā)酵生物 體對在發(fā)酵工藝中所使用的粗水解物中發(fā)現(xiàn)的許多毒素的耐受性的限制。從水解物中除去 毒素是困難、耗時且昂貴的。為了避免昂貴的毒素去除步驟，在水解物中固體的百分比常規(guī) 地保持低于10%總固體（w/w)，由此使毒素對發(fā)酵生物體的影響最小。不幸地，總固體濃度 的限制意味著較少可用的發(fā)酵底物和每批次較低的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率（yield)。
[0007]因此，高度期望利用具有高總固體濃度的粗水解物和降低從含木質(zhì)纖維素材料中 產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物所需的發(fā)酵時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及使用一種或多種發(fā)酵生物體從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的 方法。
[0009] 本發(fā)明涉及從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包括：
[0010] i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；
[0011] ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；
[0012] iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；
[0013] 其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵：
[0014] a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250 X 101(]個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或
[0015] b)發(fā)酵生物體濃度在2-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。
[0016] 本發(fā)明具體涉及：
[0017] 1.從含木質(zhì)纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包括：
[0018] i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；
[0019] ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；
[0020] iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；
[0021] 其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵：
[0022] a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250 X 1010個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或
[0023] b)發(fā)酵生物體濃度在2_90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。
[0024] 2.項(xiàng)1的方法，其中在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中除去不溶性固體。
[0025] 3.項(xiàng)1或2的方法，其中在步驟i)中預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料后除去不溶性固 體。
[0026] 4.項(xiàng)1-3任一項(xiàng)的方法，其中在步驟ii)中使該經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水 解后除去不溶性固體。
[0027] 5.項(xiàng)1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在20-250 X 1010個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的 發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0028] 6.項(xiàng)1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在50-250 X 1010個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的 發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0029] 7.項(xiàng)1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在100-250 X 1010個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的 發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0030] 8.項(xiàng)1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在200-250 X 1010個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的 發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0031] 9.項(xiàng)1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在3-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范 圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。
[0032] 10.項(xiàng)1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在3_50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基 范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。
[0033] 11.項(xiàng)1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在4_50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基 范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。
[0034] 12.項(xiàng)1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在10_50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng) 基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。
[0035] 13.項(xiàng)1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在10_40g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng) 基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。
[0036] 14.項(xiàng)1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在10_30g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng) 基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。
[0037] 15.項(xiàng)1-14任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體是固定化的。
[0038] 16.項(xiàng)1-15任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體在發(fā)酵后回收。
[0039] 17.項(xiàng)1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體通過將發(fā)酵生物體與發(fā)酵培養(yǎng)基 分離而回收。
[0040] 18.項(xiàng)1的方法，其中所述發(fā)酵生物體在發(fā)酵后回收并再使用。
[0041] 19.項(xiàng)1的方法，其中所述發(fā)酵生物體在發(fā)酵后與發(fā)酵培養(yǎng)基分離并再使用于項(xiàng)1 的方法中。
[0042] 20.項(xiàng)16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體通過使用壓濾機(jī)過濾或通過離 心從發(fā)酵培養(yǎng)基回收。
[0043] 21.項(xiàng)1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)作為SSF、HHF 或SHF進(jìn)行。
[0044] 22.項(xiàng)1-21任一項(xiàng)的方法，其中在水解過程中使用木糖異構(gòu)酶。
[0045] 23.項(xiàng)1-22任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括：
[0046] a)源自預(yù)處理步驟i)或水解步驟ii)的C6糖的發(fā)酵；
[0047] b)回收和再循環(huán)C6發(fā)酵生物體；
[0048] c)使C5糖發(fā)酵；
[0049] d)回收和再循環(huán)C6發(fā)酵生物體。
[0050] 24?項(xiàng)1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括：
[0051] 1)源自預(yù)處理步驟i)的C6糖的同時水解和發(fā)酵；
[0052] 2)使C5糖發(fā)酵。
[0053] 25.項(xiàng)1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括：
[0054] 1)源自預(yù)處理步驟i)的C6糖的同時水解和發(fā)酵；
[0055] 2)除去不溶性固體；
[0056] 3)使C5糖發(fā)酵；
[0057] 4)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。
[0058] 26.項(xiàng)1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括：
[0059] a)源自預(yù)處理步驟i)或水解步驟ii)的C5和C6糖的同時發(fā)酵；
[0060] b)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。
[0061] 27.項(xiàng)1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括：
[0062] 1)源自預(yù)處理步驟i)的C5和C6糖的同時水解和同時發(fā)酵。
[0063] 28.項(xiàng)1-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括：
[0064] 1)源自預(yù)處理步驟i)的C5和C6糖的同時水解和發(fā)酵；
[0065] 2)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。
[0066] 29.項(xiàng)1-28任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵或水解前使所述含木質(zhì)纖維素材料解毒。
[0067] 30.項(xiàng)1-29任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料是未解毒的。
[0068] 31.項(xiàng)1-30任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料已進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械或生物 預(yù)處理。
[0069] 32.項(xiàng)1-31任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料已通過用一種或多種纖維 素酶或半纖維素酶或其組合處理而水解。
[0070] 33.項(xiàng)32的方法，進(jìn)一步其中在水解過程中存在一種或多種具有纖維素分解增強(qiáng) 活性的多肽。
[0071] 34.項(xiàng)32或33的方法，其中具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽為家族GH61A多肽。
[0072] 35.項(xiàng)34的方法，其中所述家族GH61A多肽源自嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)的 菌株。
[0073] 36.項(xiàng)35的方法，其中所述嗜熱子囊菌屬的菌株為桔橙嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus)〇
[0074] 37.項(xiàng)36的方法，其中所述GH61A多肽為公開在WO2005/074656中的多肽。
[0075] 38.項(xiàng)34的方法，其中所述家族GH61A多肽源自梭孢殼屬（Thielavia)的菌株。
[0076] 39.項(xiàng)38的方法，其中所述梭孢殼屬的菌株為土生梭孢霉（Thielavia terrestris)〇
[0077] 40.項(xiàng)39的方法，其中所述GH61A多肽為公開在WO2005/074656中的多肽。
[0078] 41.項(xiàng)34的方法，其中所述家族GH61A多肽源自木霉屬（Trichoderma)的菌株。
[0079] 42?項(xiàng)41的方法，其中所述木霉屬的菌株為里氏木霉（Trichoderma reesei)。
[0080] 43.項(xiàng)42的方法，其中所述GH61A多肽為公開在US 2007/0077630中的多肽。
[0081] 44.項(xiàng)1-43任一項(xiàng)的方法，其中在水解過程中存在一種或多種0 -葡糖苷酶。
[0082] 45.項(xiàng)44的方法，其中所述0 -葡糖苷酶源自曲霉屬（Aspergillus)的菌株。
[0083] 46.項(xiàng)45的方法，其中所述曲霉屬的菌株為米曲霉（Aspergillus oryzae)。
[0084] 47.項(xiàng)44的方法，其中所述0 -葡糖苷酶源自木霉屬的菌株。
[0085] 48.項(xiàng)47的方法，其中所述木霉屬的菌株為里氏木霉。
[0086] 49.項(xiàng)1-48任一項(xiàng)的方法，其中用于水解的纖維素酶為源自木霉屬的菌株的纖維 素分解制備物。
[0087] 50.項(xiàng)49的方法，其中所述木霉屬的菌株為里氏木霉的菌株。
[0088] 51?項(xiàng)1-50任一項(xiàng)的方法，其中在水解步驟ii)中使用纖維素酶制備物A。
[0089] 52.項(xiàng)1-51任一項(xiàng)的方法，其中將經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料用選自下組的一 種或多種淀粉降解酶進(jìn)一步處理：糖-產(chǎn)生酶、a-淀粉酶及其組合。
[0090] 53.項(xiàng)52的方法，其中所述糖-源產(chǎn)生酶選自下組：葡糖淀粉酶、0 -淀粉酶、產(chǎn)麥 芽糖淀粉酶、及其兩種或多種的混合物。
[0091] 54.項(xiàng)1-53任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。
[0092] 55.項(xiàng)1-54任一項(xiàng)的方法，其中使用C6或C5發(fā)酵生物體進(jìn)行所述發(fā)酵。
[0093] 56.項(xiàng)1-55任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體為酵母，優(yōu)選酵母屬 (Saccharomyces)的菌株，優(yōu)選釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)。
[0094] 57.項(xiàng)56的方法，其中所述酵母選自下組：釀酒酵母和樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)〇
[0095] 58.項(xiàng)1-57任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在25°C至40°C的溫度進(jìn)行。
[0096] 59.項(xiàng)58的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在29°C至35°C的溫度進(jìn)行。
[0097] 60.項(xiàng)58的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在30°C至34°C的溫度進(jìn)行。
[0098] 61.項(xiàng)58的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在約32°C的溫度進(jìn)行。
[0099] 62.項(xiàng)1-61任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵過程中的pH為3至7。
[0100] 63.項(xiàng)62的方法，其中在發(fā)酵過程中的pH為4至6。
[0101] 64.項(xiàng)1-63任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵進(jìn)行卜48小時。
[0102] 65.項(xiàng)64的方法，其中所述發(fā)酵進(jìn)行1-24小時。
[0103] 66.項(xiàng)1-65任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料源自玉米猜、玉米纖維、硬 木、軟木、谷類莖桿、柳枝稷、芒屬、稻殼、城市固體廢物、工業(yè)有機(jī)廢物、辦公紙張、或其混合 物。
[0104] 67.項(xiàng)1-66任一項(xiàng)的方法，其中引入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的所述含木質(zhì)纖維素材料 是未洗滌的。
[0105] 68.項(xiàng)1-67任一項(xiàng)的方法，其中引入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的所述含木質(zhì)纖維素材料 是未洗滌的且預(yù)處理的，而且所述含木質(zhì)纖維素材料選自下組：玉米秸、玉米穗軸、玉米纖 維、木材、柳枝稷、甘蔗渣和谷類莖桿。
[0106] 69.項(xiàng)1-68任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵是分批發(fā)酵。
[0107] 70.項(xiàng)1-68任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵是補(bǔ)料分批發(fā)酵。
[0108] 71.項(xiàng)1-71任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物在發(fā)酵后回收。
[0109] 72.項(xiàng)1-72任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵過程中的pH大于pH 5. 0。
【附圖說明】
[0110] 圖1表明各種量的糖溶液和經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸（PCS)酶水解物對在兩種不 同的酵母菌株中在96小時后的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。
[0111] 圖2表明高細(xì)胞密度的RED STAR?對在各種起始酵母細(xì)胞濃度的經(jīng)過濾的預(yù)處理 的玉米秸（PCS)酶水解物的乙醇分批發(fā)酵的影響。
[0112] 圖3表明高細(xì)胞密度的酵母RWB218對在各種起始酵母細(xì)胞濃度的預(yù)處理的玉米 秸（PCS)酶水解物的乙醇分批發(fā)酵的影響。
[0113] 圖4表明高細(xì)胞密度的RED STAR?和在pH5的細(xì)胞再循環(huán)對在40g/L的起始酵母 細(xì)胞濃度的經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸（PCS)酶水解物的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。
[0114] 圖5表明高細(xì)胞密度的RED STAR?和在pH 6的細(xì)胞再循環(huán)對在40g/L的起始酵 母細(xì)胞濃度的經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸（PCS)酶水解物的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。
[0115] 圖6a表明高細(xì)胞密度的酵母RWB218和細(xì)胞再循環(huán)對在20g/L的酵母細(xì)胞濃度的 經(jīng)離心的預(yù)處理的玉米秸（PCS)酶水解物的補(bǔ)料分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。
[0116] 圖6b表明高細(xì)胞密度的酵母RWB218對在20g/L的酵母細(xì)胞濃度從0至24小時 的經(jīng)離心的預(yù)處理的玉米秸（PCS)酶水解物的補(bǔ)料分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。
[0117] 圖7表明高密度的酵母RWB218對在各種起始酵母細(xì)胞濃度從對預(yù)處理的玉米秸 (PCS)酶水解物用各種預(yù)處理方法預(yù)處理的玉米秸（CS)的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0118] 本發(fā)明涉及使用一種或多種發(fā)酵生物體從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的 方法。
[0119] 根據(jù)本發(fā)明，可通過在整個發(fā)酵中在非常高細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行發(fā)酵而顯著縮短發(fā)酵時 間。即使每發(fā)酵生物體的發(fā)酵速度可以不高于在常規(guī)發(fā)酵工藝中的速度，在整個發(fā)酵中發(fā) 酵生物體的絕對數(shù)量高的事實(shí)也導(dǎo)致期望的發(fā)酵產(chǎn)物的快速產(chǎn)生（以每時間單位的發(fā)酵 產(chǎn)物的絕對量確定）。
[0120] 此外，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵生物體可如下所述回收和再使用。與常規(guī)方法相比，縮短 的發(fā)酵時間和發(fā)酵生物體的任選的再使用降低了本發(fā)明方法的總成本。
[0121] 因此，本發(fā)明涉及從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包 括：
[0122] i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；
[0123] ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；
[0124] iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；
[0125] 其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵：
[0126] a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250 X 101(]個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或
[0127] b)發(fā)酵生物體濃度在2_90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。
[0128] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在發(fā)酵前除去不溶性固體（包括木質(zhì)素和未轉(zhuǎn)化的多 糖）。例如，可在步驟i)中預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料后除去不溶性固體。根據(jù)本發(fā)明，然后 可使已除去不溶性固體的源自預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的材料發(fā)酵。在另一實(shí)施方式中，可在 步驟ii)中使該預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解后除去不溶性固體。根據(jù)本發(fā)明，然后可 使已除去不溶性固體的源自水解的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的材料發(fā)酵。
[0129] 待發(fā)酵的源自木質(zhì)纖維素的可發(fā)酵糖為來自預(yù)處理或水解步驟i)或ii)或來自 步驟i)和ii)兩者的液體形式（例如，濾出液）。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟ii)中的 水解和步驟iii)中的發(fā)酵作為單獨(dú)的水解和發(fā)酵步驟（SHF)、作為混合的水解和發(fā)酵步驟 (HHF)或作為同時的水解和發(fā)酵步驟（SSF)進(jìn)行。SSF、HHF和SHF步驟是本領(lǐng)域公知的。
[0130] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵可在20-250 X101(]個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍 內(nèi)，更優(yōu)選在50-250 X 101(]個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在100-250 X 10 個細(xì)胞 /L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在150-250X 101(]個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，例如在 200-250X 101(]個細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行。
[0131] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵可在3_90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基、3_50g 干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，優(yōu)選在4-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的 范圍內(nèi)，優(yōu)選在5-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在10-50g干重發(fā)酵 生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在10_40g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍 內(nèi)，特別地在10_30g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度進(jìn)行。
[0132] 根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵生物體可為固定化的。例如，發(fā)酵生物體可固定在惰性的高 表面積的支持物上，該支持物懸浮在發(fā)酵罐/容器中，通過該發(fā)酵罐/容器供給（feed) 待發(fā)酵的源自水解和/或預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的材料。根據(jù)本發(fā)明可使用任何固定 化技術(shù)。用于固定化發(fā)酵生物體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。合適的固定化技術(shù)的實(shí)例可 在例如以下中找到：Kesava 等，1996，"Ethanol production by immobilized whole cells of Zymomonas mobilis in a continuous flow expanded bed bioreactor and a continuous flow stirred tank bioreactor"，Journal of Industrial Microbiology 17:11-14 ;Gough 等，1998，"Production of ethanol from molasses at 45 degrees C using Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in calcium alginate gels and poly(vinyl alcohol) cryogel"，Bioprocess Engineering 19:87-90 ;Love 等，1998， "Continuous ethanol fermentation at 45degrees C using Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in Calcium alginate and kissiris"，Bioprocess Engineering 18:187-189 ；Abbi 等，1996， ''Bioconversion of pentose sugars to ethanol by free and immobilized cells of Candida shehatae(NCL-3501):