本發(fā)明涉及一種基于倍性分析儀快速鑒定仔魚倍性的方法，屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，用于快速鑒定仔魚倍性。

背景技術(shù)：

魚類倍性操控技術(shù)(雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo))在水產(chǎn)動(dòng)物育種中發(fā)揮著重要作用。目前，已經(jīng)陸續(xù)開展了鯉(cyprinuscarpio)、鯽(carassiusauratus)、水晶彩鯽(c.auratustransparentcolored)、白鯽(c.auratuscuvieri)、泥鰍(misgurnusanguillicaudatus)、鰱(hypophthalmichthysmolitrix)、虹鱒(salmogairdneri)、大鱗副泥鰍(paramisgurnusdabryanus)等近百種魚類的雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。不同倍性魚類存在生長差異，一般認(rèn)為三倍體魚類因其生殖細(xì)胞減數(shù)分裂異常，性腺不發(fā)育或發(fā)育不完全，從而生長速度較二倍體快。雌核發(fā)育生殖方式常常用來對優(yōu)良親本性狀進(jìn)行純化，比如鰱新品種“長豐鰱”以雌核發(fā)育方式對其親本生長快等優(yōu)良性狀進(jìn)行純化，能穩(wěn)定遺傳給后代。

目前，有關(guān)魚類倍性鑒定方法有多種，包括：染色體計(jì)數(shù)法、紅細(xì)胞及細(xì)胞核體積測量法、核仁組織區(qū)銀染計(jì)數(shù)法、體細(xì)胞dna相對含量法等。染色體計(jì)數(shù)法需要獲得魚類體細(xì)胞有絲分裂中期分裂相，是通過染色體計(jì)數(shù)與參考染色體組進(jìn)行比較鑒定魚類倍性的一種方法，是最為準(zhǔn)確的一種魚類倍性鑒定方法。同時(shí)，染色體計(jì)數(shù)法也是最常用的一種倍性鑒定方法。但因體細(xì)胞有絲分裂中期分裂相制備成功率低、步驟繁瑣等特點(diǎn)，在大規(guī)模的魚類倍性篩選中實(shí)用性不強(qiáng)。紅細(xì)胞及細(xì)胞核體積測量法和核仁組織區(qū)銀染計(jì)數(shù)法鑒定倍性準(zhǔn)確性較低，且不易用于批量后代的倍性鑒定。基于流式細(xì)胞術(shù)的體細(xì)胞dna相對含量法是目前最為快速、便捷的一種魚類倍性檢測方法。只需抽取少量外周血細(xì)胞或剪取少量鰭條組織即可快速進(jìn)行倍性鑒定，對魚體傷害小，特別是一些名貴魚類的倍性鑒定，基于流式細(xì)胞術(shù)的dna相對含量法鑒定魚類倍性具有其他方法無可比擬的優(yōu)勢。但利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定魚類倍性時(shí)要求待測樣本個(gè)體較大，能從體外抽出紅細(xì)胞或剪取足量的鰭條組織，同時(shí)不導(dǎo)致魚體死亡。目前，有關(guān)初孵仔魚的倍性鑒定多用染色體計(jì)數(shù)法，該方法步驟繁瑣、成功率較低，且不可進(jìn)行批量倍性鑒定。

在開展魚類倍性操控實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要對所設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件或方法進(jìn)行有效評(píng)估。目前，對魚類雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)結(jié)果的評(píng)估都是待后代生長至幼魚甚至成魚階段，再對其進(jìn)行倍性鑒定，繼而評(píng)估倍性操控實(shí)驗(yàn)時(shí)所選用的實(shí)驗(yàn)條件或方法的優(yōu)劣。這樣就存在一些缺陷：①由于利用雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)技術(shù)獲得的后代進(jìn)行倍性鑒定需待其生長至幼魚甚至成魚時(shí)，這就需要等待一段較長甚至相當(dāng)長的時(shí)間才能最終評(píng)估倍性操控實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；②由于評(píng)估倍性操控實(shí)驗(yàn)結(jié)果前，有一段較長的養(yǎng)殖過程。在這過程中因養(yǎng)殖環(huán)境或養(yǎng)殖技術(shù)等原因魚類一般會(huì)出現(xiàn)不同程度的死亡，因而幼魚或成魚階段倍性鑒定的結(jié)果并不能非常準(zhǔn)確地反映真實(shí)的利用雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)技術(shù)獲得的后代的倍性結(jié)果。所以，目前急切需要一種對初孵仔魚倍性進(jìn)行快速、批量鑒定的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于倍性分析儀快速、批量鑒定仔魚倍性的方法。針對上述現(xiàn)有技術(shù)中魚類倍性鑒定存在的問題，將倍性分析儀應(yīng)用到仔魚倍性鑒定中，建立仔魚倍性快速鑒定方法體系，從而提高仔魚的倍性鑒定效率，加速魚類育種材料的選育。

一種基于倍性分析儀快速鑒定仔魚倍性的方法，包括以下步驟：

1)將1-2尾脫膜初孵仔魚置于樣品管內(nèi)，用pbs緩沖液沖洗兩次，最后一次預(yù)留400-500μlpbs緩沖液，利用1ml一次性注射器對樣品管內(nèi)仔魚進(jìn)行抽吸，反復(fù)抽吸2-3次即可獲得仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液；

2)利用30μm孔徑濾網(wǎng)對仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液進(jìn)行過濾；

3)將上述過濾液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加800μl細(xì)胞核染色液進(jìn)行避光染色1-2分鐘；

4)將上述染色后的仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液進(jìn)行上機(jī)檢測，記錄熒光信號(hào)值，通過峰值圖均值比較確定檢測樣品倍性大小。

所述pbs緩沖液為含有以下成分：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo44.3mmol/l，kh2po41.4mmol/l。

所述濾網(wǎng)的孔徑為30μm。

所述細(xì)胞核染色液是濃度為1mg/ml的dapi。

1尾仔魚出現(xiàn)單峰，根據(jù)其峰值圖即可判斷仔魚倍性；2尾仔魚出現(xiàn)單峰，說明該2尾仔魚倍性相同，若出現(xiàn)雙峰則判定2尾仔魚倍性不同，根據(jù)峰值圖分別判定2尾仔魚倍性。

注意在進(jìn)行樣品檢測之前，以已知二倍性成魚血液作為參考，調(diào)節(jié)儀器電壓值使其熒光信號(hào)峰值圖位于合適位置。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明方法簡便可行。利用注射器針孔抽吸形成的負(fù)壓對仔魚微量肌肉細(xì)胞進(jìn)行分離，獲取仔魚肌肉單細(xì)胞成功率較高，細(xì)胞大小均一，倍性分析儀檢出率高，克服了一般組織樣品切割制備單細(xì)胞懸液樣品需求量大的缺點(diǎn)。

2.該方法倍性檢測靈敏度高。本方法除了能鑒定整數(shù)倍性后代，還可檢測非整數(shù)倍性后代，在魚類非正常配子形成機(jī)制研究中具有重要的實(shí)用價(jià)值。

3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明適用于各種魚類初孵仔魚的倍性鑒定，大大縮短了魚類雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)條件優(yōu)化所需的實(shí)驗(yàn)周期。

4.采用本發(fā)明所述方法可滿足批量樣本的倍性檢測。倍性檢測速度快，大大提高了仔魚倍性檢測的效率。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中二倍體泥鰍雌核發(fā)育后代單倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖2是實(shí)施例1中二倍體泥鰍雌核發(fā)育后代二倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖3是實(shí)施例2中泥鰍多倍體誘導(dǎo)后代三倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖4是實(shí)施例3中團(tuán)頭魴多倍體誘導(dǎo)后代三倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖5是實(shí)施例4中人工誘導(dǎo)獲得的雜種五倍體泥鰍雌魚與四倍體泥鰍雄魚雜交獲得的四倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖6是實(shí)施例4中人工誘導(dǎo)獲得的雜種五倍體泥鰍雌魚與四倍體泥鰍雄魚雜交獲得的五倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖7是實(shí)施例4中人工誘導(dǎo)獲得的雜種五倍體泥鰍雌魚與四倍體泥鰍雄魚雜交獲得的2.5倍體和四倍體仔魚dna含量峰值圖。

圖8是實(shí)施例4中人工誘導(dǎo)獲得的雜種五倍體泥鰍雌魚與四倍體泥鰍雄魚雜交獲得的3.5倍體仔魚dna含量峰值圖。

具體實(shí)施方式

下面給出幾個(gè)典型實(shí)施例，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例中。

實(shí)施例1

利用本發(fā)明方法對泥鰍雌核發(fā)育后代仔魚倍性進(jìn)行鑒定，具體操作如下：

1)對成熟的二倍體泥鰍雌性個(gè)體和團(tuán)頭魴雄性個(gè)體進(jìn)行催熟。按照常規(guī)雌核發(fā)育方法，將團(tuán)頭魴滅活精子與二倍體泥鰍成熟卵子混合進(jìn)行“人工授精”，啟動(dòng)雌核發(fā)育過程，并對其進(jìn)行染色體加倍處理。待二倍體泥鰍雌核發(fā)育后代孵化脫膜后，對初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定；

2)將1-2尾脫膜初孵仔魚置于樣品管內(nèi)，利用5ml塑料膠頭滴管抽吸pbs緩沖液(nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo44.3mmol/l，kh2po41.4mmol/l)沖洗兩次，最后一次預(yù)留400-500μlpbs溶液。將盛有仔魚的樣品管置于冰上對其進(jìn)行麻醉處理。利用干凈的1ml注射器對樣品管內(nèi)仔魚進(jìn)行抽吸，反復(fù)抽吸2-3次獲得仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液；

3)利用30μm孔徑濾網(wǎng)對上述仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液進(jìn)行過濾；

4)將上述過濾液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加800μl細(xì)胞核染色液(1mg/mldapi，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行避光染色1-2分鐘；

5)將上述樣品管內(nèi)液體體系進(jìn)行上機(jī)檢測，電腦記錄其熒光信號(hào)峰值圖，通過峰值圖均值比較確定檢測樣品倍性大小。

注意在進(jìn)行樣品檢測之前，以已知二倍性泥鰍血液作為參考，調(diào)節(jié)儀器電壓值使其熒光信號(hào)峰值圖位于合適位置。本研究中二倍體熒光信號(hào)峰值位于100。對100尾二倍體泥鰍雌核發(fā)育初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定，倍性檢出率為100％。其中，單倍體出現(xiàn)23尾(圖1)，二倍體出現(xiàn)77尾(圖2)，雌核發(fā)育誘導(dǎo)成功率為77％。

實(shí)施例2

利用本發(fā)明方法對泥鰍多倍體誘導(dǎo)后代仔魚倍性進(jìn)行鑒定，具體操作如下：

1)對成熟的二倍體泥鰍雌雄個(gè)體進(jìn)行催熟，人工授精獲得二倍體泥鰍自交受精卵，并進(jìn)行冷休克處理誘導(dǎo)多倍體后代。待泥鰍多倍體誘導(dǎo)后代孵化脫膜后，對初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定；

2)將1-2尾脫膜初孵仔魚置于樣品管內(nèi)，利用5ml塑料膠頭滴管抽吸pbs緩沖液沖洗兩次，最后一次預(yù)留400-500μlpbs溶液。將盛有仔魚的樣品管置于冰上對其進(jìn)行麻醉處理。利用干凈的1ml注射器對樣品管內(nèi)仔魚進(jìn)行抽吸，反復(fù)抽吸2-3次獲得仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液；

3)利用30μm孔徑濾網(wǎng)對上述仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液進(jìn)行過濾；

4)將上述過濾液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加800μl細(xì)胞核染色液(1mg/mldapi，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行避光染色1-2分鐘；

5)將上述樣品管內(nèi)液體體系進(jìn)行上機(jī)檢測，電腦記錄其熒光信號(hào)峰值圖，通過峰值圖均值比較確定檢測樣品倍性大小。

注意在進(jìn)行樣品檢測之前，以已知二倍性泥鰍血液作為參考，調(diào)節(jié)儀器電壓值使其熒光信號(hào)峰值圖位于合適位置。本研究中二倍體熒光信號(hào)峰值位于100。對100尾泥鰍多倍體誘導(dǎo)后代初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定，倍性檢出率為100％。其中，二倍體出現(xiàn)12尾，三倍體出現(xiàn)88尾(圖3)，泥鰍三倍體誘導(dǎo)成功率為88％。

實(shí)施例3

利用本發(fā)明方法對團(tuán)頭魴多倍體誘導(dǎo)后代仔魚倍性進(jìn)行鑒定，具體操作如下：

1)對成熟的二倍體團(tuán)頭魴雌雄個(gè)體進(jìn)行催熟，人工授精獲得團(tuán)頭魴自交受精卵，并進(jìn)行冷休克處理誘導(dǎo)多倍體后代。待團(tuán)頭魴多倍體誘導(dǎo)后代孵化脫膜后，對初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定。

2)將1-2尾脫膜初孵仔魚置于樣品管內(nèi)，利用5ml塑料膠頭滴管抽吸pbs緩沖液沖洗兩次，最后一次預(yù)留400-500μlpbs溶液。將盛有仔魚的樣品管置于冰上對其進(jìn)行麻醉處理。利用干凈的1ml注射器對樣品管內(nèi)仔魚進(jìn)行抽吸，反復(fù)抽吸2-3次獲得仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液；

3)利用30μm孔徑濾網(wǎng)對上述仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液進(jìn)行過濾；

4)將上述過濾液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加800μl細(xì)胞核染色液(1mg/mldapi，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行避光染色1-2分鐘；

5)將上述樣品管內(nèi)液體體系進(jìn)行上機(jī)檢測，電腦記錄其熒光信號(hào)峰值圖，通過峰值圖均值比較確定檢測樣品倍性大小。

注意在進(jìn)行樣品檢測之前，以已知二倍性團(tuán)頭魴血液作為參考，調(diào)節(jié)儀器電壓值使其熒光信號(hào)峰值圖位于合適位置。本研究中二倍體熒光信號(hào)峰值位于200。對100尾團(tuán)頭魴多倍體誘導(dǎo)后代初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定，倍性檢出率為100％。其中，二倍體出現(xiàn)21尾，三倍體出現(xiàn)79尾(圖4)，團(tuán)頭魴三倍體誘導(dǎo)成功率為79％。

實(shí)施例4

利用本發(fā)明方法對人工誘導(dǎo)獲得的雜種五倍體泥鰍與四倍體泥鰍雜交產(chǎn)生的仔魚倍性進(jìn)行鑒定，具體操作如下：

1)對人工誘導(dǎo)獲得的雜種五倍體泥鰍雌性個(gè)體與野生四倍體泥鰍雄性個(gè)體進(jìn)行催熟，人工授精獲得受精卵。待其孵化脫膜后，對初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定。

2)將1-2尾脫膜初孵仔魚置于樣品管內(nèi)，利用5ml塑料膠頭滴管抽吸pbs緩沖液沖洗兩次，最后一次預(yù)留400-500μlpbs溶液。將盛有仔魚的樣品管置于冰上對其進(jìn)行麻醉處理。利用干凈的1ml注射器對樣品管內(nèi)仔魚進(jìn)行抽吸，反復(fù)抽吸2-3次獲得仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液；

3)利用30μm孔徑濾網(wǎng)對上述仔魚肌肉細(xì)胞懸濁液進(jìn)行過濾；

4)將上述過濾液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加800μl細(xì)胞核染色液(1mg/mldapi，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行避光染色1-2分鐘；

5)將上述樣品管內(nèi)液體體系進(jìn)行上機(jī)檢測，電腦記錄其熒光信號(hào)峰值圖，通過峰值圖均值比較確定檢測樣品倍性大小。

注意在進(jìn)行樣品檢測之前，以已知二倍性泥鰍血液作為參考，調(diào)節(jié)儀器電壓值使其熒光信號(hào)峰值圖位于合適位置。本研究中二倍體熒光信號(hào)峰值位于100。對100尾初孵仔魚進(jìn)行倍性鑒定，倍性檢出率為100％。初孵仔魚檢測到多種倍性，多為四倍體(圖5)，同時(shí)檢測到少量五倍體(圖6)和非整數(shù)倍性(圖7，圖8)。由此推測，人工誘導(dǎo)獲得的五倍體泥鰍可產(chǎn)生多種不同倍性成熟配子。對人工誘導(dǎo)獲得雜種五倍體泥鰍雌魚與四倍體泥鰍雄魚進(jìn)行雜交獲得的子代在其幼魚或成魚階段進(jìn)行倍性鑒定，均只能檢測到四倍體，根據(jù)這樣的鑒定結(jié)果就不能準(zhǔn)確地得出人工誘導(dǎo)獲得的五倍體泥鰍可產(chǎn)生多種不同倍性成熟配子的結(jié)論了。

從實(shí)施例1、2、3、4可以證明，本發(fā)明提供的一種基于倍性分析儀快速鑒定仔魚倍性方法具有快速方便、應(yīng)用范圍廣、倍性檢出率高、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用此法可大大縮短倍性操控實(shí)驗(yàn)的周期，并且還可更準(zhǔn)確地評(píng)估倍性操控實(shí)驗(yàn)。