本發(fā)明屬于大蒜深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大蒜素合成阿霍烯的工藝方法及其制備方法。

背景技術(shù)：

大蒜素(大蒜新素、garlicin)為三硫代烯丙醚類化合物，天然存在于百合科植物大蒜的鱗莖中。對多種革蘭氏陽性和陰性菌均有抗菌作用，對桿菌(痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、百日咳桿菌)、真菌(白色念珠菌、隱球菌、煙曲霉菌)、病毒(巨細胞病毒)、阿米巴原蟲、陰道滴蟲、蟯蟲等均有抑制殺滅作用，尤其對大腸桿菌、痢疾桿菌等腸道細菌作用強。

但是，大蒜素極不穩(wěn)定，在常溫條件就會分解。阿霍烯作為源自于大蒜的一種活性成分，較之蒜素更加穩(wěn)定且不具有令人難以接受的蒜辣蒜臭氣味，具有抗血栓形成，誘導腫瘤細胞調(diào)亡及抗菌消炎等特別的生理功效，是一種天然高效的活性成分。但是大蒜素在在丙酮/水體系中，分解產(chǎn)物主要為e/z-阿霍烯。這些分解產(chǎn)物導致了大蒜素轉(zhuǎn)化為阿霍烯反應(yīng)的的復雜性，有大量的副反應(yīng)發(fā)生，不利于阿霍烯的合成。

發(fā)明的內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，大蒜素在在丙酮/水體系中，分解產(chǎn)物主要為e/z-阿霍烯。這些分解產(chǎn)物導致了大蒜素轉(zhuǎn)化為阿霍烯反應(yīng)的的復雜性，有大量的副反應(yīng)發(fā)生，不利于阿霍烯的合成。

為解決上述問題，本發(fā)明針對大蒜素裂解反應(yīng)的特點，項目采用絡(luò)合催化反應(yīng)的形式，將大蒜素用親水絡(luò)合物絡(luò)合以提高大蒜素的穩(wěn)定，在反應(yīng)時解絡(luò)合，這樣大蒜素及時反應(yīng)生成阿霍烯，避免了大量的副反應(yīng)發(fā)生。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種大蒜素合成阿霍烯的工藝方法，由以下步驟組成：

(1)蒜酶提?。簩⒓尤胨饷柑崛∫旱拇笏庥媚z體磨研磨得到大蒜漿，離心分離出上清液；在-5℃～5℃條件下，將硫酸銨加入上清液中，邊添加邊攪拌，然后分離出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，邊添加邊攪拌，離心分理出沉淀，重溶，離心后得到上清液；本發(fā)明根據(jù)固定化酶固定化工藝的要求和工業(yè)用酶的特定，建立合適大規(guī)模應(yīng)用的酶純化工藝。以酶活收率、酶比活力為指標考察蒜酶純化過程中浸提液組分,根據(jù)大蒜蒜酶的酶學性質(zhì)，分別選用鹽析法、有機聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；確定最適硫酸銨濃度、peg8000濃度。

(2)蒜酶純化：將步驟(1)得到的上清液超濾，清液依次經(jīng)分子量由大到小的分子超濾膜進行2-3級過濾分離，首次過濾使用的分子超濾膜為分子量200000，末級分子超濾膜的分子量為15000-5000；將現(xiàn)代超濾技術(shù)取代透析技術(shù)應(yīng)用于蒜酶的提取純化工藝。超濾工藝中主要在于根據(jù)粗酶液中蒜酶及其中雜蛋白分子量的大小，選擇一組或多組分子量的超濾膜，以達到去除各種雜蛋白的目的。另一方面，由于酶容易在劇烈條件下變性，在研究中，分別考察以離心泵、柱塞泵、隔膜泵為動力的分離條件下，對酶活力的影響來選擇適用于蒜酶超濾分離的泵。

(3)蒜酶固定化：分別將磷酸氫二鉀/鈉與氯化鈣分別溶于水中配成水溶液待用，再將步驟(2)得到的蒜酶加入到氯化鈣水溶液中，調(diào)節(jié)ph為5-9，攪拌均勻后，加入磷酸氫二鉀/鈉的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶；通過對蒜酶功能學的研究，以酶吸附率、固定化酶比活力、固定化酶穩(wěn)定性等指標，確定適合蒜酶的固定化方式。

(4)制備大蒜素：在-5℃～5℃、ph為4-6的條件下，將步驟(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比為1:1-1:5，得到的產(chǎn)物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素備用；將固定化蒜酶裝配成生物反應(yīng)器，通過正交試驗考察反應(yīng)溫度、ph等對蒜氨酸轉(zhuǎn)化率的影響，以確定最佳反應(yīng)條件。

(5)合成阿霍烯：配置β-環(huán)糊精水溶液，與步驟(4)得到的大蒜素混合，得到懸浮物，將混合物加熱反應(yīng)，然后烘干、粉碎過篩得到含阿霍烯包合物。

(6)阿霍烯純化：將步驟(5)得到的阿霍烯包合物用極性有機溶劑提取，回收溶劑得阿霍烯。

進一步的，所述步驟(1)中蒜酶提取液為含有絡(luò)合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液。

進一步的，所述步驟(1)中絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑為巰基丙醇；緩沖劑為磷酸鹽。

進一步的，所述步驟(1)中硫酸銨的添加量為20％-30％，聚乙二醇的添加量為30％-50％。

進一步的，所述步驟(1)離心條件3000-5000×g，30min。

進一步的，所述步驟(3)磷酸氫二鉀/鈉水溶液濃度濃度為1m，氯化鈣水溶液濃度為1m。

進一步的，所述步驟(5)中β-環(huán)糊精水溶液中β-環(huán)糊精與水的料液比為1:1-1:5，反應(yīng)溫度30℃～70℃。

進一步的，所述步驟(6)中極性有機溶劑為甲醇、乙醇、丙酮，提取料液比例為1:4-1:6，提取熱溫度30℃～90℃。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、采用固定化酶技術(shù)固定蒜酶，在生物反應(yīng)器中，催化蒜氨酸轉(zhuǎn)化為大蒜素，反應(yīng)專一性好，催化效率高，可以獲得高純度的大蒜素產(chǎn)品。

2、采用絡(luò)合催化反應(yīng)，避免大量副反應(yīng)產(chǎn)生，保證了阿霍烯的高收率。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1：

一種大蒜素合成阿霍烯的工藝方法，由以下步驟組成：

(1)蒜酶提?。簩⒓尤胨饷柑崛∫旱拇笏庥媚z體磨研磨得到大蒜漿，離心分離出上清液；在0℃條件下，將硫酸銨加入上清液中，邊添加邊攪拌，然后分離出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，邊添加邊攪拌，離心分理出沉淀，重溶，離心后得到上清液；本發(fā)明根據(jù)固定化酶固定化工藝的要求和工業(yè)用酶的特定，建立合適大規(guī)模應(yīng)用的酶純化工藝。以酶活收率、酶比活力為指標考察蒜酶純化過程中浸提液組分,根據(jù)大蒜蒜酶的酶學性質(zhì)，分別選用鹽析法、有機聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；確定最適硫酸銨濃度、peg8000濃度。所述步驟(1)中蒜酶提取液為含有絡(luò)合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液；絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑為巰基丙醇；緩沖劑為磷酸鹽。所述步驟(1)中硫酸銨的添加量為25％，聚乙二醇的添加量為40％。離心條件4000×g，30min。

(2)蒜酶純化：將步驟(1)得到的上清液超濾，清液依次經(jīng)分子量由大到小的分子超濾膜進行2級過濾分離，首次過濾使用的分子超濾膜為分子量200000，末級分子超濾膜的分子量為10000；

(3)蒜酶固定化：分別將磷酸氫二鉀/鈉與氯化鈣分別溶于水中配成水溶液待用，再將步驟(2)得到的蒜酶加入到氯化鈣水溶液中，調(diào)節(jié)ph為7，攪拌均勻后，加入磷酸氫二鉀/鈉的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶；所述步驟(3)磷酸氫二鉀/鈉水溶液濃度為1m，氯化鈣水溶液濃度為1m。

(4)制備大蒜素：在0℃、ph為5的條件下，將步驟(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比為1:3，得到的產(chǎn)物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素備用。

(5)合成阿霍烯：配置β-環(huán)糊精水溶液，與步驟(5)得到的大蒜素混合，得到懸浮物，將混合物加熱反應(yīng)，然后烘干、粉碎過篩得到含阿霍烯包合物。所述步驟(5)中β-環(huán)糊精水溶液中β-環(huán)糊精與水的料液比為1:3。

(6)阿霍烯純化：取步驟(5)的含阿霍烯包合物，按料液比1:4加入乙醇，加熱至60℃攪拌提取1h，過濾，濾液減壓回收溶劑得阿霍烯，含量為82.3％。

實施例2：

一種大蒜素合成阿霍烯的工藝方法，由以下步驟組成：

(1)蒜酶提?。簩⒓尤胨饷柑崛∫旱拇笏庥媚z體磨研磨得到大蒜漿，離心分離出上清液；在-5℃條件下，將硫酸銨加入上清液中，邊添加邊攪拌，然后分離出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，邊添加邊攪拌，離心分理出沉淀，重溶，離心后得到上清液；本發(fā)明根據(jù)固定化酶固定化工藝的要求和工業(yè)用酶的特定，建立合適大規(guī)模應(yīng)用的酶純化工藝。以酶活收率、酶比活力為指標考察蒜酶純化過程中浸提液組分,根據(jù)大蒜蒜酶的酶學性質(zhì)，分別選用鹽析法、有機聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；確定最適硫酸銨濃度、peg8000濃度。所述步驟(1)中蒜酶提取液為含有絡(luò)合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液；絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑為巰基丙醇；緩沖劑為磷酸鹽。所述步驟(1)中硫酸銨的添加量為20％，聚乙二醇的添加量為30％-。離心條件5000×g，30min。

(2)蒜酶純化：將步驟(1)得到的上清液超濾，清液依次經(jīng)分子量由大到小的分子超濾膜進行2級過濾分離，首次過濾使用的分子超濾膜為分子量200000，末級分子超濾膜的分子量為15000。

(3)蒜酶固定化：分別將磷酸氫二鉀/鈉與氯化鈣分別溶于水中配成水溶液待用，再將步驟(2)得到的蒜酶加入到氯化鈣水溶液中，調(diào)節(jié)ph為5，攪拌均勻后，加入磷酸氫二鉀/鈉的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶。所述步驟(3)磷酸氫二鉀/鈉水溶液濃度濃度為1m，氯化鈣水溶液濃度為1m。

(4)制備大蒜素：在5℃、ph為4的條件下，將步驟(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比為1:5，得到的產(chǎn)物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素備用。

(5)配置β-環(huán)糊精水溶液，與步驟(5)得到的大蒜素混合，得到懸浮物，將混合物加熱反應(yīng)，然后烘干、粉碎過篩得到含阿霍烯包合物。所述步驟(5)中β-環(huán)糊精水溶液中β-環(huán)糊精與水的料液比為1:1。

(6)阿霍烯純化：取步驟(5)的含阿霍烯包合物，按料液比1:5加入乙醇，加熱至45℃攪拌提取1h，過濾，濾液減壓回收溶劑得阿霍烯，含量為78.8％。

實施例3：

一種大蒜素合成阿霍烯的工藝方法，由以下步驟組成：

(1)蒜酶提?。簩⒓尤胨饷柑崛∫旱拇笏庥媚z體磨研磨得到大蒜漿，離心分離出上清液；在5℃條件下，將硫酸銨加入上清液中，邊添加邊攪拌，然后分離出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，邊添加邊攪拌，離心分理出沉淀，重溶，離心后得到上清液；本發(fā)明根據(jù)固定化酶固定化工藝的要求和工業(yè)用酶的特定，建立合適大規(guī)模應(yīng)用的酶純化工藝。以酶活收率、酶比活力為指標考察蒜酶純化過程中浸提液組分,根據(jù)大蒜蒜酶的酶學性質(zhì)，分別選用鹽析法、有機聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；確定最適硫酸銨濃度、peg8000濃度。所述步驟(1)中蒜酶提取液為含有絡(luò)合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液；絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑為巰基丙醇；緩沖劑為磷酸鹽。所述步驟(1)中硫酸銨的添加量為30％，聚乙二醇的添加量為50％。離心條件3000×g，30min。

(2)蒜酶純化：將步驟(1)得到的上清液超濾，清液依次經(jīng)分子量由大到小的分子超濾膜進行2級過濾分離，首次過濾使用的分子超濾膜為分子量200000，末級分子超濾膜的分子量為15000。

(3)蒜酶固定化：分別將磷酸氫二鉀/鈉與氯化鈣分別溶于水中配成水溶液待用，再將步驟(2)得到的蒜酶加入到氯化鈣水溶液中，調(diào)節(jié)ph為9，攪拌均勻后，加入磷酸氫二鉀/鈉的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶。所述步驟(3)磷酸氫二鉀/鈉水溶液濃度濃度為1m，氯化鈣水溶液濃度為1m。

(4)制備大蒜素：在-5℃、ph為6的條件下，將步驟(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比為1:5，得到的產(chǎn)物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素備用。

(5)合成阿霍烯：與步驟(5)得到的大蒜素混合，得到懸浮物，將混合物加熱反應(yīng)，然后烘干、粉碎過篩得到含阿霍烯包合物。所述步驟(5)中β-環(huán)糊精水溶液中β-環(huán)糊精與水的料液比為1:1。

(6)阿霍烯純化：取步驟(5)的含阿霍烯包合物，按料液比1:3加入乙醇，加熱至30℃攪拌提取1h，過濾，濾液減壓回收溶劑得阿霍烯，含量為76.4％。