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一種姜黃素衍生物的制備方法與流程

文檔序號:11703411閱讀:445來源:國知局
一種姜黃素衍生物的制備方法與流程
(一)
技術領域
本發(fā)明涉及一種姜黃素衍生物的制備方法。(二)
背景技術
:姜黃素為一種橙黃色粉末,難溶于水和乙醚,易溶于乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亞砜等,熔點為183℃,分子式為c21h20o6,相對分子質量為368.37。姜黃素的β二酮結構存在酮式互變異構,在酸性或中性條件下主要以酮式結構存在,相反,在堿性條件下主要以烯醇式結構存在,在ph2.5-7時,姜黃素呈亮黃色,而在ph>7時呈紅色,造成這種現(xiàn)象的原因是由于姜黃素的酚羥基在堿性條件下易電離成酚氧負離子,增強其供電性,同時供吸電子協(xié)調(diào)作用增強,這一系列作用導致顏色往深色轉換。姜黃素在酸性條件下相對穩(wěn)定,而在堿性或中性條件下容易被降解,研究發(fā)現(xiàn)在ph7.2的無血清磷酸緩沖液中,37℃條件下30min后有超過90%姜黃素被降解,其降解產(chǎn)物為阿魏酸、香蘭素等。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗hiv、抗凝血、抗高血壓、抗肝臟纖維化等多種生物活性,在臨床應用上潛力很大,但由于姜黃素存在水溶性差、在中性或堿性環(huán)境中易被降解、在機體內(nèi)藥效不持久、生物利用度低以及選擇性低等缺點,限制了其在臨床上的廣泛應用。目前許多學者在保留姜黃素原有藥效的基礎上,對其進行結構修飾,通過化學或生物方法制備得到性能更加好、更加穩(wěn)定的姜黃素衍生物。zhangxing等采用在華根霉(rhizopuschinensis)iffi03043培養(yǎng)液中直接加入底物姜黃素的生長培養(yǎng)轉化法制得兩種姜黃素衍生物--4'-o-β-d-葡萄糖苷姜黃素(產(chǎn)率為57%)和六氫姜黃素(產(chǎn)率為6.2%)(biocatalysisandbiotransformation,2010,28(5-6):380-386)。申請人在先專利申請201510289729.x提供了一株新菌種少孢根霉須狀變種zjph1308以及利用該菌種催化不對稱水解制備西他列汀中間體的方法。本發(fā)明提出了采用少孢根霉須狀變種zjph1308菌株生物轉化制備姜黃素得到兩種姜黃素衍生物的新方法。利用少孢根霉須狀變種zjph1308靜息細胞對姜黃素進行微生物轉化,不僅可消除培養(yǎng)基中的復雜成分對姜黃素生物轉化的影響,還為后期姜黃素轉化產(chǎn)物的分離純化提供了便利。本發(fā)明的菌種易培養(yǎng),含酶源細胞的制備成本低,并且其中的一個姜黃素衍生物--4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol系首次通過微生物轉化方法獲得。采用微生物轉化法對天然產(chǎn)物進行結構修飾具有區(qū)域選擇性和立體選擇性高,反應條件溫和、操作簡單、成本低廉,環(huán)境友好等優(yōu)點,且生物體系可產(chǎn)生多種性質與功能各異的酶,從而可催化姜黃素底物轉化生成具有不同取代方式的系列衍生物,有望從中找到活性更好或具有新結構的姜黃素衍生物,對姜黃素“構效關系”研究具有重要的意義。(三)技術實現(xiàn)要素:本發(fā)明目的是提供一種姜黃素衍生物的制備方法,特別是利用少孢根霉須狀變種zjph1308細胞生物轉化制備4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol和六氫姜黃素。利用少孢根霉須狀變種zjph1308靜息細胞轉化姜黃素制備其衍生物,不僅可以消除培養(yǎng)基成分對姜黃素生物轉化過程的影響,而且利于后續(xù)姜黃素轉化產(chǎn)物的分離純化。本發(fā)明采用的技術方案是:本發(fā)明提供一種姜黃素衍生物的制備方法,所述的方法為:以少孢根霉須狀變種(rhizopusmicrosporusvar.rhizopodiformis)zjph1308發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑,以姜黃素為底物,以ph值5.4~8.0磷酸緩沖液為反應介質構成轉化體系,在25~50℃、150~250rpm條件下進行轉化反應(優(yōu)選40℃、200rpm條件下轉化48h),反應結束后將轉化液分離純化,獲得4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol和六氫姜黃素。本發(fā)明所述少孢根霉須狀變種(rhizopusmicrosporusvar.rhizopodiformis)zjph1308保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址為中國,武漢,武漢大學,郵編430072,保藏編號為cctccno.m2014645,保藏日期2014年12月14日,該菌株已在先前的專利申請(申請?zhí)枮?01510289729.x,申請日2015年6月1日)中公開。進一步,所述濕菌體的用量以菌體干重計為2~25g/l轉化體系(優(yōu)選9.8g/l),所述姜黃素底物的初始濃度為20~300mg/l轉化體系(優(yōu)選50mg/l)。進一步,所述轉化反應液分離純化方法為:反應結束后,將轉化液離心,取上清液用乙酸乙酯萃取,將萃取液減壓蒸餾除去乙酸乙酯,取濃縮液進樣半制備液相進行分離,分別收集保留時間為25.9min和38.5min的流出液,蒸除溶劑后,再進行薄層層析分離,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下,分別收集rf值為0.275和0.475的顯色條帶,用無水甲醇浸洗三次,蒸除溶劑后,分別獲得六氫姜黃素和4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol。進一步,所述半制備液相分離條件為:儀器為島津lc-60ad,色譜柱為lunac18(2),5μm;檢測波長:280nm,流速:3ml/min,進樣量:500μl,流動相:乙腈-水溶液梯度洗脫,所述乙腈與水梯度洗脫體積分別為:20:80(0-10min)、35:65(10-20min)、40:60(20-42min)、從40:60改變?yōu)?00:0(42-50min)、從100:0改變?yōu)?0:80(50-65min)。進一步,所述薄層層析分離以體積比為25:25:1的二氯甲烷、正己烷和無水甲醇溶液為展開劑。進一步,所述濕菌體按如下方法制備:(1)斜面培養(yǎng):將少孢根霉須狀變種zjph1308接種至斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)4~5天,獲得斜面菌體;所述斜面培養(yǎng)基的終濃度為土豆200g/l、葡萄糖20g/l、瓊脂20g/l,溶劑為水,ph自然;(2)種子培養(yǎng):從斜面菌體挑選一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中,30℃、200rpm培養(yǎng)22h,獲得種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖20~30g/l、蛋白胨25~35g/l、(nh4)2so41~3g/l、kh2po40.5~1.5g/l、mgso4·7h2o0.5~1.5g/l,ph5~8,溶劑為水;優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖25g/l、蛋白胨27.5g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l,ph6.0,溶劑為水;(3)發(fā)酵培養(yǎng):以體積濃度2~10%(優(yōu)選6%)接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200rpm發(fā)酵培養(yǎng)24h,將菌體取出,蒸餾水洗滌三次,收集濕菌體;所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成:碳源20~30g/l、氮源25~35g/l、kh2po40.5~1.5g/l、mgso4·7h2o0.5~1.5g/l,ph5~8,溶劑為水;所述碳源為下列之一:麥芽糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、糊精或乳糖,優(yōu)選糊精;所述氮源為下列之一:酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、玉米漿、氯化銨或硫酸銨,優(yōu)選蛋白胨。進一步,所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:糊精20g/l、蛋白胨30g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l,ph6.0,溶劑為水。進一步,所述少孢根霉須狀變種zjph1308在生物轉化制備姜黃素衍生物中應用,具體為轉化制備4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol的應用按如下步驟進行:將少孢根霉須狀變種zjph1308發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體和姜黃素加入ph值為5.4~8.0磷酸緩沖液中構成轉化體系,在30℃、200rpm條件下進行轉化反應48h,轉化結束后,將轉化液離心,取上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,減壓濃縮至干除去乙酸乙酯,取濃縮物用色譜甲醇溶解,將溶解樣品進樣半制備液相進行分離,收集保留時間為38.5min的流出液,蒸除溶劑,再將樣品重溶于甲醇,再進行薄層層析分離,以體積比為25:25:1的二氯甲烷、正己烷和無水甲醇溶液為展開劑,經(jīng)多次展開后,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下(收集rf值為0.475的顯色條帶),用無水甲醇浸洗三次,蒸除溶劑,獲得所述姜黃素衍生物即為4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol,所述少孢根霉須狀變種zjph1308發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體的用量以菌體干重計為2~20g/l轉化體系,優(yōu)選9.8g/l,所述姜黃素底物的初始濃度為20~300mg/l轉化體系,優(yōu)選50mg/l。進一步,所述少孢根霉須狀變種zjph1308在生物轉化制備姜黃素衍生物中應用,具體為轉化制備六氫姜黃素的應用按如下步驟進行:將少孢根霉須狀變種zjph1308發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體和姜黃素加入ph值為5.4~8.0磷酸緩沖液中構成轉化體系,在30℃、200rpm條件下進行轉化反應48h,轉化結束后,將轉化液離心,取上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,減壓濃縮至干除去乙酸乙酯,取濃縮物用色譜甲醇溶解,將溶解樣品進樣半制備液相進行分離,收集保留時間為25.9min的流出液,蒸除溶劑,將樣品重溶于甲醇,再進行薄層層析分離,以體積比為25:25:1的二氯甲烷、正己烷和無水甲醇溶液為展開劑,經(jīng)多次展開后,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下(收集rf值為0.275的顯色條帶),用無水甲醇浸洗三次,蒸除溶劑,獲得所述姜黃素衍生物即為六氫姜黃素,所述少孢根霉須狀變種zjph1308發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體的用量以菌體干重計為2~20g/l轉化體系,優(yōu)選9.8g/l,所述姜黃素底物的初始濃度為20~300mg/l轉化體系,優(yōu)選50mg/l。本發(fā)明所述經(jīng)少孢根霉須狀變種zjph1308濕菌體生物轉化后獲得的轉化反應液(實驗組),首先進行tlc法分析,與姜黃素標準品、對照組1(轉化反應體系中只加入底物姜黃素,不加入酶源細胞)和對照組2(轉化反應體系中不加入底物姜黃素,只加入酶源細胞)進行對照,確定實驗組的轉化液中是否產(chǎn)生新的顯色斑點,如果產(chǎn)生新的顯色斑點,則將轉化液離心,取上清液用乙酸乙酯萃取,將萃取液減壓濃縮至干,取旋蒸后所得濃縮物用色譜甲醇重新溶解、微濾(0.45μm)處理后進行hplc分析,確定是否出現(xiàn)新的特征峰(與姜黃素標準品、對照組1和對照組2相比)。如果出現(xiàn)新的特征峰,將生物轉化后獲得的轉化液離心,取上清液用乙酸乙酯萃取,將萃取液減壓濃縮后進樣半制備液相分離,收集保留時間為25.9min的流出液,蒸除溶劑,再進行薄層層析分離,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下(收集rf值為0.275的顯色條帶),經(jīng)無水甲醇浸洗三次,除去溶劑,獲得所述姜黃素衍生物之一(六氫姜黃素);收集保留時間為38.5min的流出液,蒸除溶劑,再將樣品重溶于甲醇后進行薄層層析分離,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下(收集rf值為0.475的顯色條帶),用無水甲醇浸洗三次后,除去溶劑,即獲得所述姜黃素衍生物之二(4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol)。分別采用高效液相色譜法分析其純度。取純度在95%以上的組分進行高分辨率質譜ms,1h-nmr和13c-nmr檢測,鑒定其結構。與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明利用少孢根霉須狀變種zjph1308靜息細胞為催化劑的生物轉化方法對姜黃素進行結構修飾,由此獲得相應的衍生物,其中六氫姜黃素產(chǎn)率為35.8%,4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol產(chǎn)率為33.9%,并且化合物4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol是首次通過微生物轉化姜黃素方法獲得。姜黃素結構修飾物的藥理或生物活性較修飾前的姜黃素底物有不同程度的改善;本發(fā)明生物轉化得到的化合物4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol與已報道的化學合成相比,工藝過程簡單,環(huán)境友好,生物催化劑為微生物菌體,成本低廉。(四)附圖說明圖1本發(fā)明利用少孢根霉須狀變種zjph1308微生物轉化制備姜黃素衍生物的流程圖。圖2實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物的tlc圖譜示意圖:a為tlc圖譜照片,b為a的示意圖,1為實驗組樣品,2為對照組1樣品,3為對照組2樣品;a,b為少孢根霉須狀變種zjph1308的姜黃素轉化產(chǎn)物的顯色斑點;c為對照組1樣品產(chǎn)生的斑點。圖3實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物的hplc圖譜:a為實驗組樣品;b為對照組1樣品;c為姜黃素標準品;d為對照組2樣品;峰1-峰4對應的時間分別為t1=23.785min,t2=29.403min,t3=35.896min,t4=45.346min。圖4實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物2(t=29.4min)的核磁氫譜圖(1h-nmr)。圖5實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物2(t=29.4min)的核磁碳譜圖(1c-nmr)。圖6實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)的高分辨率質譜圖(ms)。圖7實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)的核磁氫譜圖(1h-nmr)。圖8實施例1姜黃素轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)的核磁碳譜圖(1c-nmr)。(五)具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:實施例1:姜黃素轉化產(chǎn)物的制備(1)斜面培養(yǎng):將少孢根霉須狀變種zjph1308接種至斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)4~5天,即得到斜面菌種;所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:土豆200g/l、葡萄糖20g/l、瓊脂粉20g/l,ph自然,溶劑為水,121℃滅菌20分鐘,滅菌后冷卻、制成斜面;(2)種子培養(yǎng):從步驟(1)斜面菌體挑取一環(huán)菌體接種至裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中,30℃、200rpm培養(yǎng)22h,制備得到種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖25g/l、蛋白胨27.5g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l,ph6.0,溶劑為水,121℃滅菌20分鐘;(3)用于制備姜黃素衍生物酶源細胞的初始發(fā)酵培養(yǎng):以體積濃度6%接種量將種子液(步驟(2)制備)接種到裝有100ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中,30℃、200rpm培養(yǎng)24h,得到發(fā)酵液,離心,收集濕菌體;所述初始發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度同步驟(2)種子培養(yǎng)基終濃度組成;(4)生物轉化方法:實驗組:將步驟(3)獲得的濕菌體用蒸餾水洗滌后,將濕菌體移入含有20ml蒸餾水中,同時加入姜黃素底物構成轉化體系20ml,姜黃素初始濃度為50mg/l,濕菌體加量以菌體干重計為9.8g/l。設置對照組1:將姜黃素加入到蒸餾水20ml中,使其終濃度為50mg/l。設置對照組2:將步驟(3)獲得的濕菌體加入到蒸餾水20ml中,濕菌體加入量以菌體干重計為9.8g/l。將各組實驗樣品在30℃、200rpm條件下轉化48h,轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干除去乙酸乙酯,各組濃縮物用色譜甲醇溶解后待hplc檢測。(5)分析檢測①薄層層析檢測(tlc):用毛細點樣管分別吸取一定量的實驗組樣品、對照組1樣品、對照組2樣品和姜黃素標準品,分別點樣于預先活化的硅膠薄層板上,展層劑為二氯甲烷:正己烷:甲醇=25:25:1(v/v/v),于254nm紫外燈下將實驗組樣品與對照組樣品和標準品相比較,采用碘熏蒸法觀察是否產(chǎn)生新的顯色斑點。②高效液相色譜檢測(hplc):所有樣品進樣檢測前先用0.45μm微孔濾膜過濾,將實驗組樣品譜圖與對照組1樣品、對照組2樣品和姜黃素標準品進行比對,確定是否出現(xiàn)新的物質峰。儀器型號為安捷倫lc-1200,色譜柱為shim-packvp-ods(shimadzu),檢測波長:280nm,流速:0.5ml/min,進樣量:10μl,流動相:乙腈-水溶液,梯度洗脫條件如下表1:表1.hplc梯度洗脫條件實驗組樣品經(jīng)tlc檢測出現(xiàn)兩個新的顯色斑點(見圖2中的a(rf值為0.275)和b(rf值為0.475)所示),hplc法檢測得到四個微生物轉化產(chǎn)物(圖3中的峰1-峰4所示),其中hplc圖譜顯示產(chǎn)物2(t=29.4min,即tlc檢測時rf值為0.275時出現(xiàn)的顯色斑點)和產(chǎn)物4(t=45.3min,即tlc檢測時rf值為0.475時出現(xiàn)的顯色斑點)的峰面積較高,含量較多,為少孢根霉須狀變種zjph1308的兩個主要的姜黃素轉化產(chǎn)物。(6)轉化產(chǎn)物的分離純化:利用半制備液相對上述兩個姜黃素轉化主要產(chǎn)物(即轉化液經(jīng)離心、萃取、減壓濃縮后的濃縮物)進行分離。儀器型號為島津lc-60ad,色譜柱為lunac18(2)色譜柱(5μm),檢測波長:280nm,流速:3ml/min,進樣量:500μl,流動相:乙腈-水溶液,梯度洗脫條件如下表2:表2.半制備hplc梯度洗脫條件根據(jù)分析型液相色譜的出峰時間與峰型情況分析,推斷半制備液相分離時保留時間為25.9min的產(chǎn)物與分析型液相保留時間為29.4min的產(chǎn)物可能為同一個產(chǎn)物,為進一步驗證推斷結果,收集半制備液相保留時間為25.9min的流出液,蒸除溶劑,再將樣品重溶于色譜甲醇,之后,對該樣品進行分析液相檢測,確認其保留時間為29.4min,表明該物質確實為制備的目標產(chǎn)物2。為進一步提高產(chǎn)物純度,對收集的保留時間為25.9min的流出液進行濃縮,并進行薄層層析分離,以體積比為25:25:1的二氯甲烷、正己烷和無水甲醇溶液為展開劑,經(jīng)多次展開后,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下(收集rf值為0.275的顯色條帶),用無水甲醇浸洗三次,蒸除溶劑,利用hplc法檢測純度(檢測條件同步驟(5)),經(jīng)過分離純化,得到產(chǎn)物2(t=29.4min)。步驟同上,收集半制備液相保留時間為38.5min的流出液,將其濃縮后進行薄層層析分離,在254nm紫外燈下觀察色譜帶并標記,將標記的色譜帶連同硅膠粉用刮刀從薄層板上刮下(收集rf值為0.475時的顯色條帶),用無水甲醇浸洗三次,蒸除溶劑,采用hplc法檢測純度(檢測條件同步驟(5)),經(jīng)過分離純化,得到產(chǎn)物4(t=45.3min)。對制備得到的2個姜黃素衍生物分別進行ms、1h-nmr和13c-nmr檢測,并對其進行結構鑒定。經(jīng)鑒定,推斷轉化產(chǎn)物2(t=29.4min)為六氫姜黃素,其結構式為:該化合物具有以下理化性質:白色結晶,推斷其分子式為c21h26o6。1h-nmr結果為:1h-nmr(meod):δ=1.71(2h,m,h-2);δ=2.60(4h,m,h-1,7);δ=2.78(4h,m,h-4,6);δ=3.83(3h,s,h-och3);δ=3.84(3h,s,h-och3);δ=4.02(h,m,h-3);δ=6.62(2h,d,h-6');δ=6.70(2h,dd,h-5');δ=6.77(2h,s,h-2'),如圖4所示。13c-nmr結果為:δ29.3(c-1),31.4(c-7),38.3(c-6),45.4(c-2),55.9(3',3″ome),66.9(c-5),111.1(c-2',2″),111.3(c-2',2″),114.4(c-5'/5″),120.7(c-6',6″),120.9(c-6',6″),132.5(c-1',1″),133.7(c-1',1″),143.7(c-4',4″),144.0(c-4',4″),146.4(c-3',3″),146.5(c-3',3″),211.3(c-3),如圖5所示。經(jīng)鑒定,推斷轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)為4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol,其結構式為:該化合物具有以下理化性質:淡黃色粉末,推斷其分子式為c21h28o5。通過高分辨率ms得到m/z為359.1855,因此,可推斷出其分子量為360,如圖6所示。1h-nmr結果為:1h-nmr(meod):δ=6.75(2×d,2h),δ=6.70(2×d,2h),δ=6.61(2×dd,2h),δ=3.83(2×s,6h),δ=3.45-3.57(m,1h),δ=2.63-2.72(m,1h),δ=2.50-2.60(m,4h),δ=1.21-1.85(m,8h),如圖7所示。13c-nmr結果為:δ=147.40(c),δ=144.03,δ=143.99,δ=134.19,δ=133.97,δ=120.39(2c),δ=114.70,δ=114.62,δ=111.83,δ=111.80,δ=70.28,δ=54.99(2c),δ=39.14,δ=36.79,δ=35.03,δ=31.52,δ=31.19,δ=24.86,如圖8所示。據(jù)報道,六氫姜黃素的生物活性和藥理活性較底物姜黃素都得到了較大的改善,穩(wěn)定性也有所提高。例如:pfeiffer等人將六氫姜黃素和姜黃素同時置于37℃,0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖液中,放置24h后,用hplc檢測兩者的降解率,研究發(fā)現(xiàn),姜黃素在1h內(nèi)降解率已達90%,而六氫姜黃素在24h內(nèi)沒有明顯的降解(pfeiffere,hoehlesi,walchsg,etal.curcuminoidsfromreactiveglucuronidesinvitro.journalofagriculturalandfoodchemistry,2007,55:538-544.)。針對4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol化合物的研究目前還報道很少,effienurtjahja-tjendraputra等人研究發(fā)現(xiàn)該化合物對于抑制cox-1酶有一定的活性,但是活性并不十分理想,還需要對該化合物進行結構的修飾改造。有關該化合物其他活性的研究尚未見報道,故關于該化合物以及該化合物衍生物的后續(xù)研究需要進一步開展(nurtjahja-tjendraputrae,ammitaj,roufogalisbd,etal.effectiveanti-plateletandcox-1enzymeinhibitorsfrompungentconstituentsofginger.thrombosisresearch,2003,111(4):259-265.)。實施例2-8碳源種類對轉化產(chǎn)物4得率的影響利用少孢根霉須狀變種zjph1308菌株,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,將葡萄糖分別替換為25g/l濃度的麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、糊精、乳糖作為唯一碳源,改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基,按實施例1步驟(4)的方法進行轉化,轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表3。表3不同碳源對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響實施例碳源種類產(chǎn)物4得率/%2葡萄糖20.43麥芽糖17.14甘油9.75可溶性淀粉11.76蔗糖12.87糊精22.28乳糖16.2結論:由表3可知,最佳的碳源為糊精。實施例9-13糊精濃度對轉化產(chǎn)物4得率的影響在實施例7的基礎上,配制糊精濃度分別為10g/l、20g/l、25g/l、30g/l、40g/l的初始發(fā)酵培養(yǎng)基,改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基,按實施例1步驟(4)的方法進行轉化,轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表4。表4不同糊精濃度對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響結論:由表4可知,最佳的糊精濃度為20g/l。實施例14-20氮源種類對轉化產(chǎn)物4得率的影響在實施例10的基礎上,利用少孢根霉須狀變種zjph1308菌株,以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,將蛋白胨和(nh4)2so4分別替換為30g/l濃度的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、黃豆粉、玉米漿、氯化銨、硫酸銨作為唯一氮源,改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基,按實施例1步驟(4)的方法進行轉化,轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表5。表5不同氮源對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響實施例氮源種類產(chǎn)物4得率/%14蛋白胨28.715酵母膏13.316牛肉膏23.117黃豆粉5.218玉米漿11.819氯化銨1.220硫酸銨2.7結論:由表5可知,最佳的氮源為蛋白胨。實施例21-25蛋白胨濃度對轉化產(chǎn)物4得率的影響在實施例14的基礎上,配制蛋白胨濃度分別為10g/l、20g/l、25g/l、30g/l、40g/l的發(fā)酵培養(yǎng)基,改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基,按實施例1步驟(4)的方法進行轉化,轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表6。表6不同蛋白胨濃度對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響結論:由表6可知,最佳的蛋白胨濃度為30g/l。實施例26-31菌體濃度對轉化產(chǎn)物4得率的影響利用少孢根霉須狀變種zjph1308菌株,在實施例24的基礎上(發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:糊精20g/l、蛋白胨30g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l,ph6.0,溶劑為水),經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,將濕菌體加入裝有20ml蒸餾水的250ml錐形瓶中(濕菌體以菌體干重計分別為6.5g/l、9.8g/l、13.0g/l、16.3g/l、19.5g/l、22.8g/l)構成20ml轉化體系,底物姜黃素終濃度為50mg/l,于30℃,200rpm轉化48h。轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表7。表7不同菌體濃度對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響實施例菌體濃度(g/l)產(chǎn)物4得率/%266.526.8279.830.22813.027.92916.322.73019.520.83122.818.9結論:由表7可知,最佳的菌體濃度為9.8g/l。實施例32-36底物濃度對轉化產(chǎn)物4得率的影響利用少孢根霉須狀變種zjph1308菌株,在實施例24的基礎上,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,將濕菌體加入裝有20ml蒸餾水的250ml錐形瓶中(濕菌體以菌體干重計為9.8g/l)構成20ml轉化體系,底物姜黃素終濃度分別為25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l、150mg/l,于30℃,200rpm轉化48h。轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表8。表8不同底物濃度對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響實施例底物濃度(mg/l)產(chǎn)物4得率/%322532.8335029.8347522.53510018.73615010.6結論:由表8結果可知,底物濃度采用50mg/l更合適。實施例37-42轉化溫度對轉化產(chǎn)物4得率的影響利用少孢根霉須狀變種zjph1308菌株,在實施例24的基礎上,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,將濕菌體加入裝有20ml蒸餾水的250ml錐形瓶中(濕菌體以菌體干重計為9.8g/l),底物姜黃素終濃度為50mg/l,分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃,200rpm轉化48h。轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,得上清液,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干,取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行檢測,檢測方法同實施例1步驟(5),根據(jù)面積歸一法計算產(chǎn)物4(t=45.3min)的得率。結果見表9。表9不同轉化溫度對轉化產(chǎn)物4(t=45.3min)得率的影響實施例轉化溫度(℃)產(chǎn)物4得率/%372520.7383031.1393532.8404033.9414527.6425011.4結論:由表9可知,最佳的轉化溫度為40℃。實施例43:棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810對姜黃素生物轉化活性的考察(1)棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc),地址為中國,武漢,武漢大學,郵編430072,保藏編號為cctccno:m209307,保藏日期2009年12月16日,該菌株已在先前的專利申請(申請?zhí)枮?00910155775.5,申請日2009年12月25日)中公開。(2)斜面培養(yǎng):將棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810接種至斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)4~5天,即得到斜面菌種;所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:土豆200g/l、葡萄糖20g/l、瓊脂粉20g/l,ph自然,溶劑為水,121℃滅菌20分鐘,滅菌后冷卻、制成斜面;(3)種子培養(yǎng):從步驟(2)斜面菌體挑取一環(huán)菌體接種至裝有100ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中,30℃、200rpm培養(yǎng)24h,制備得到種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖25g/l、蛋白胨27.5g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l,ph6.0,溶劑為水,121℃滅菌20分鐘;(4)發(fā)酵培養(yǎng):取種子液以體積濃度6%的接種量接種至裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中,30℃培養(yǎng)24h,獲得濕菌體;發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基配方。(5)姜黃素的生物轉化:實驗組:將棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810濕菌體移入裝有20ml0.1m的ph6.6磷酸鹽緩沖液的250ml錐形瓶中,同時加入姜黃素底物構成轉化體系,姜黃素初始濃度為50mg/l轉化體系,濕菌體加量以菌體干重計為9.8g/l轉化體系。設置對照組1(不添加濕菌體):將姜黃素加入到裝有20ml0.1m的ph6.6磷酸鹽緩沖液的250ml錐形瓶中構成反應體系,使其終濃度為50mg/l反應體系。設置對照組2(不添加底物):將棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810濕菌體加入到裝有20ml0.1m的ph6.6磷酸鹽緩沖液的250ml錐形瓶中構成反應體系,濕菌體加入量以菌體濕重計為9.8g/l反應體系。將各組實驗反應體系在30℃、200rpm條件下轉化反應48h,轉化結束后,將轉化液離心除去菌體,上清液用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,于50℃減壓濃縮至干除去乙酸乙酯,各組旋蒸后所得濃縮物用色譜甲醇重新溶解后,制成樣品,用實施例1步驟(5)中的hplc法進行檢測,未檢測到六氫姜黃素和4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol。結論:棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810不能轉化姜黃素制備得到六氫姜黃素和4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol。當前第1頁12
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