本發(fā)明涉及姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物，涉及它的制備方法，涉及它抗腫瘤細(xì)胞增殖的活性，涉及它抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲的作用，涉及它抑制S180荷瘤小鼠瘤體增重的活性，涉及它抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移的活性，進(jìn)一步涉及它抑制二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的活性，進(jìn)一步涉及它抑制大鼠血栓生成的活性。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，惡性腫瘤的死亡率僅次于心腦血管疾病，在所有疾病中居第二位。惡性腫瘤患者大都伴隨癌轉(zhuǎn)移、炎癥和血栓。癌轉(zhuǎn)移、炎癥和血栓使腫瘤患者面臨更為惡劣的預(yù)后。發(fā)明同時(shí)具有抗腫瘤、抗癌轉(zhuǎn)移、抗炎癥和抗血栓作用的藥物，是新藥發(fā)明的前沿課題。眾所周知，姜黃素是姜黃的主要成分，具有廣泛的藥理作用。例如姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗腫瘤和抗菌等作用?？墒?，由于穩(wěn)定性差、生物利用率低和水溶性差，目前仍然沒有同時(shí)具有抗腫瘤、抗癌轉(zhuǎn)移、抗炎癥和抗血栓作用的姜黃素衍生物。發(fā)明人曾經(jīng)公開2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-PAK肽是治療缺血性中風(fēng)的優(yōu)秀化合物，2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-RGD肽是抗血栓的優(yōu)秀化合物?？墒牵l(fā)明人公開的這些化合物都不是同時(shí)具有抗腫瘤、抗癌轉(zhuǎn)移、抗炎癥和抗血栓作用的化合物。經(jīng)過3年研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰Lys(The)與Arg-Gly-Asp-Ser偶聯(lián)生成的化合物同時(shí)具有抗腫瘤、抗癌轉(zhuǎn)移、抗炎癥和抗血栓作用。根據(jù)這些研究結(jié)果，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物的偶聯(lián)物。

本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供制備姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物的方法，該方法包括：

(1)制備(E)-6-(4-羥基-3-甲氧基苯基)己-5-烯-2，4-二酮；

(2)制備芐基-2-(4-甲?；?2-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯；

(3)由步驟1和2的產(chǎn)物制備芐基2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6- 二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯；

(4)將芐基2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯在4N NaOH水溶液中脫去芐酯基，得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸；

(5)將2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}羧酸與Lys(Boc)-OBzl縮合得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc)-OBzl；

(6)將2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc)-OBzl在冰浴下用4N HCl/EA脫除Boc保護(hù)基，得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl；

(7)將2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl與Boc-The縮合得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl；

(8)將2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl在2N NaOH水溶液中脫去甲酯保護(hù)基，得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)；

(9)將2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)與N端游離的側(cè)鏈最小保護(hù)的Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl，縮合，制備圖2所示的9；

(10)冰浴下先用4N NaOH水溶液中脫去芐酯保護(hù)基，再用4N氯化氫的乙酸乙酯溶液脫除Boc保護(hù)基，制備圖2所示的10；

本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。

本發(fā)明的第四個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物抑制A549細(xì)胞遷移的作用。

本發(fā)明的第五個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物抑制A549細(xì)胞的侵襲的的作用。

本發(fā)明的第六個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物抑制荷S180腫瘤小鼠的腫瘤生長的作用。

本發(fā)明的第七個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移的作用。

本發(fā)明的第八個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物對(duì)小鼠炎癥的抑制作用。

本發(fā)明的第九個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)姜黃素與寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶聯(lián)物在抑制SD大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓生成作用。

附圖說明

圖1肽的合成路線.i)DCC，HOBT，DMF和NMM；ii)4N氯化氫的乙酸乙酯溶液；iii)4N的NaOH水溶液。

圖2 2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(The)-Arg-Gly-Asp-Ser的合成路線.i)乙酰丙酮，硼酐，硼酸三正丁酯和正丁胺；ii)K₂CO₃和THF；iii)硼酐，硼酸三正丁酯和正丁胺；iv)4N NaOH水溶液；v)DCC，HOBT，DMF和NMM；vi)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液。

圖3 10對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響。

圖4 10對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備(E)-6-(4-羥基-3-甲氧基苯基)己-5-烯-2，4-二酮

將30mL(100.0mmol)乙酰丙酮溶解于200mL乙酸乙酯中，于60℃加熱攪拌。在攪拌中加入12.6g(200mmol)硼酸酐(B₂O₃)攪拌1小時(shí)。隨后加入27mL(100.0mmol)硼酸三正丁酯和15.6g(100.0mmol)香草醛，加熱至70℃反應(yīng)30min。之后將10mL正丁胺用乙酸乙酯稀釋至100mL緩慢加入反應(yīng)中并升溫至100℃反應(yīng)2小時(shí)。待反應(yīng)完成后降溫至60℃加入100mL 2N鹽酸攪拌30分鐘。待沉淀物充分析出后，濾除沉淀物并至于分液漏斗中。用飽和硫酸氫鉀和飽和氯化鈉分別洗滌三次。乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)。過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯，4∶1)，得到8.4g(36％)標(biāo)題化合物，為淺黃色固體。ESI⁺-MS(m/e)：235[M+H]⁺。

實(shí)施例2制備芐基-2-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯

將15.6g(100.0mmol)香草醛用100mL無水四氫呋喃溶解，加入8.2g(60mmol)碳酸鉀攪拌2小時(shí)。隨后加入17.4mL(120mol)溴乙酸芐酯，60℃加熱反應(yīng)3天。待原料消失后，濾除不溶物，濾液減壓濃縮除去THF。殘留物用乙醚結(jié)晶，得到20.6g(69％)標(biāo)題化 合物，為無色固體。ESI⁺-MS(m/e)：301[M+H]⁺。

實(shí)施例3制備芐基2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯

將10g(42.7mmol)(E)-6-(4-羥基-3-甲氧基苯基)己-5-烯-2，4-二酮溶解于100mL乙酸乙酯，60℃加熱攪拌。在攪拌中加入5.4g(85.4mmol)硼酸酐(B₂O₃)，攪拌1小時(shí)。隨后加入12mL(42.7mmol)硼酸三正丁酯和6.7g(42.7mmol)芐基-2-(4-甲?；?2-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯，70℃加熱反應(yīng)30min。之后，緩慢加入4.2mL正丁胺與50mL乙酸乙酯的溶液。升溫至100℃反應(yīng)2小時(shí)。待反應(yīng)完成后降溫至60℃，加入42mL 2N鹽酸，攪拌30分鐘。待沉淀物充分析出后，濾除沉淀物。濾液用飽和硫酸氫鉀和飽和氯化鈉分別洗滌三次。乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)。過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯，3∶1)，得到4.2g(19％)標(biāo)題化合物，為淺黃色固體。ESI^--MS(m/e)：516[M-H]^-。

實(shí)施例4制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸

將8.0g(15.5mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯溶解在100mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(4M)，調(diào)節(jié)pH值到14，攪拌反應(yīng)6h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。加飽和KHSO₄調(diào)節(jié)pH值到7，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續(xù)用KHSO₄調(diào)節(jié)pH值到2，用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl萃洗三次，無水Na₂SO₄干燥8小時(shí)，過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物用二氯甲烷溶解，濾去不容物，得到3.2g(49％)標(biāo)題化合物，為紅色油狀物。ESI^--MS(m/e)：425[M-H]^-。

實(shí)施例5制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰酸-Lys(Boc)-OBzl

將2.13g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸溶解在20mL無水THF中，冰浴下加入0.81g(6.0mmol)HOBt和1.15g(6.0mmol)DCC。攪拌5分鐘后加入1.862g(5.0mmol)HCl·Lys(Boc)-OBzl的無水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 9，冰浴攪拌24小時(shí)。停止反應(yīng)，過濾除去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌3次。二氯甲烷層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)。過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CH₂Cl₂∶CH₃OH，100∶1)，得到2.125g(57％)標(biāo)題化合物，為黃色固體。ESI⁺-MS(m/e)：745[M+H]⁺。

實(shí)施例6制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl

將3.720g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc)-OBzl溶解在15mL氯化氫-乙酸乙酯(4mol/L)溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失。減壓除去乙酸乙酯，反復(fù)加少量乙醚磨洗，減壓除去產(chǎn)品中的氯化氫。最后加少量乙醚將產(chǎn)品研磨成固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。

實(shí)施例7制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl

將1.37g(5.0mmol)Boc-The溶解在20mL無水THF中，冰浴下加入0.81g(6.0mmol)HOBt和1.15g(6.0mmol)DCC。攪拌30分鐘后加入3.22g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl的無水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 9，冰浴攪拌10小時(shí)。停止反應(yīng)，濾去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌3次。二氯甲烷層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)。過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20∶1)，得到2.229g(50％)標(biāo)題化合物，為黃色固體。ESI⁺-MS(m/e)：901[M+H]⁺。

實(shí)施例8制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)

將4.505g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl溶解在10mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(2M)，調(diào)節(jié)pH值到12，攪拌反應(yīng)1h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。加飽和KHSO₄調(diào)節(jié)pH值到7，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續(xù)用KHSO₄調(diào)節(jié)pH值到2，用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl萃洗三次，無水Na₂SO₄干燥8小時(shí)，過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到3.529g(87％)標(biāo)題化合物，為黃色固體。

實(shí)施例9制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(9)

將0.810g(1.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)溶解在20mL無水THF中，冰浴下加入0.135g(1.0mmol)HOBt和0.244g(1.2mmol)DCC。攪拌30分鐘后加入0.649g(1.0mmol)HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的無水THF溶液。反應(yīng)混合物用NMM調(diào)節(jié)pH 9，冰浴攪拌10小時(shí)。停止反應(yīng)，濾去沉淀出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶于二氯甲烷中，得 到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌3次。二氯甲烷層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)。過濾，濾液減壓濃縮除去二氯甲烷。殘留物用柱層析分離(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20∶1)，得到0.124g(9％)標(biāo)題化合物，為黃色固體。ESI⁺-MS(m/e)：1406.7[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.39-8.06(m，2H)，7.82-7.48(m，3H)，7.35(m，13H)，7.17-6.90(m，2H)，6.87-6.75(m，2H)，5.08(m，4H)，4.77-4.49(m，3H)，4.38-4.05(m，2H)，3.87-3.71(m，4H)，3.72-3.69(m，2H)，3.58-3.51(m，4H)，3.03(m，4H)，2.82(m，2H)，2.64(m，1H)，2.33-2.26(m，2H)，2.18(m，2H)，2.05-1.96(m，2H)，1.76-1.65(m，6H)，1.36-1.24(m，14H)，1.06(m，3H)。

實(shí)施例10制備2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(The)-Arg-Gly-Asp-Ser(10)

將100mg(0.07mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶解在10mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(1.5M)，調(diào)節(jié)pH值到12，攪拌反應(yīng)1h，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。加飽和KHSO₄調(diào)節(jié)pH值到7，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續(xù)用KHSO₄調(diào)節(jié)pH到2，用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl洗3次，無水Na₂SO₄干燥8小時(shí)，過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。隨后加入氯化氫-乙酸乙酯溶液(4M)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失。減壓除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚磨洗，減壓除去產(chǎn)品中的氯化氫。最后加少量乙醚將產(chǎn)品研磨成粉末。將所得化合物溶于少量水，調(diào)pH至7，經(jīng)Sephadex-G₁₀分離并冷凍干燥。得到0.021g(25％)標(biāo)題化合物，為黃色固體。 (c＝0.09，甲醇)；ESI⁺-MS(m/e)：1125.9[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.59(m，2H)，8.47(m，1H)，8.29(m，3H)，8.01(m，1H)，7.62(m，1H)，7.54-7.41(m，2H)，7.32-6.70(m，5H)，4.65-4.49(m，2H)，4.26(m，2H)，3.90-3.84(m，4H)，3.76(m，4H)，3.64-3.35(m，3H)，3.06(m，4H)，2.18(m，2H)，1.98-1.86(m，5H)，1.72-1.60(m，5H)，1.57(m，2H)，1.49(m，2H)，1.31-1.20(m，6H)，0.98(m，4H)；IR：3261，3063，2969，2938，1730，1657，1650，1511，1447，1423，1373，1250，1216，1140，1029，850，811；HPLC(甲醇∶水95％∶5％C₁₈1.0mL/min)純度為96％。

實(shí)施例11制備HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

用于制備9的HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl按照?qǐng)D1的路線，由標(biāo)準(zhǔn)接肽操作制備。它的前體Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl：ESI-MS(m/e)為714[M+H]⁺，HPLC純度＞95％，用氯化氫-乙酸乙酯溶液(4M)脫Boc不再純化，直接用于制備反應(yīng)?？偖a(chǎn)率為42％。

實(shí)驗(yàn)例1評(píng)價(jià)化合物10的細(xì)胞毒作用

將化合物10用PBS配置，共評(píng)價(jià)了它們對(duì)A549(人肺腺癌細(xì)胞)、MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、K562(人肝癌細(xì)胞)、U2OS(人骨肉瘤細(xì)胞)、HCT-116(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、S180(小鼠肉瘤細(xì)胞)和HaCaT(人正常皮膚細(xì)胞)6株腫瘤細(xì)胞和1株正常細(xì)胞的抑制作用。分別將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的A549、MCF-7、K562、U2OS、HCT-116、S180和HaCaT細(xì)胞以3×10⁴個(gè)/mL的密度接種于96孔板上，每孔加入100μL含細(xì)胞的培養(yǎng)液，在37℃、含5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，按照預(yù)設(shè)的濃度梯度加入待測(cè)、經(jīng)滅菌處理的樣品，每孔加入25μL10，對(duì)照組加入等體積的溶解樣品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，置于37℃、含5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時(shí)，小心去除上清液(懸浮細(xì)胞離心后除去上清液)。隨后每孔加入100μL DMSO溶液，振蕩約10min使沉淀完全溶解。立即在酶標(biāo)儀上以波長570nm檢測(cè)O.D.值。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

抑制率按照公式計(jì)算，以抑制率對(duì)化合物濃度作圖，計(jì)算本發(fā)明化合物10的IC₅₀(半數(shù)有效抑制濃度)值。結(jié)果列入表1。結(jié)果表明本發(fā)明的10對(duì)A549、MCF-7、U2OS、HCT-116、K562、S180等腫瘤細(xì)胞和正常永生化HaCaT細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。

表1 10對(duì)A549等8株細(xì)胞增殖的影響(IC₅₀，μM)

n＝3

實(shí)驗(yàn)例2用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)10抗A549細(xì)胞侵襲活性

將凍存在-20℃冰箱中的的matrigel放置于4℃冰箱過夜，等待變成matrigel液態(tài)后，吸取180μL Matrigel，加入720μL無血清DMEM培養(yǎng)基混勻。將配制好的Matrigel溶液加入至Transwell小室中的上室，每室加入100μL。之后放入37℃、含5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育5h。吸除小室中殘留液體，每孔加入50μL的1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30min。將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞消化離心，無血清A549培養(yǎng)基沖洗3次，配置成密度為5×10⁵個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，同時(shí)每 室加入25μL10，使其終濃度為20μM；在下室加入600μL含10％血清胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃含5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。用棉簽小心擦去上室內(nèi)的細(xì)胞；加入4％的多聚甲醛孵育30min將細(xì)胞固定。吸除固定液，用PBS洗滌3次；用0.1％結(jié)晶紫染色液染色30min，隨后吸除染色液，用PBS洗滌3次。侵襲數(shù)以每個(gè)小室選取6個(gè)大致相同的視野觀察，拍照，計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)以表示，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)均采用t檢驗(yàn)。結(jié)果列入圖3。結(jié)果表明本發(fā)明的化合物10抗細(xì)胞侵襲的能力顯著高。

實(shí)驗(yàn)例3用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)10抗A549細(xì)胞遷移能力

將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞消化離心，無血清A549培養(yǎng)基沖洗3次，配置成密度為5×10⁵個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，同時(shí)每室加入25μL10，使其終濃度為20μM；在下室加入600μL含10％血清胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃含5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。用棉簽小心擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，加入4％的多聚甲醛孵育30min將細(xì)胞固定。吸除固定液，用PBS洗滌3次。用0.1％結(jié)晶紫染色液染色30min，隨后吸除染色液，用PBS洗滌3次。遷移數(shù)以每個(gè)小室選取6個(gè)大致相同的視野觀察，拍照，計(jì)數(shù)；細(xì)胞數(shù)以表示，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)均采用t檢驗(yàn)。結(jié)果列入圖4。結(jié)果表明本發(fā)明的化合物10抗細(xì)胞遷移的能力顯著高。

實(shí)驗(yàn)例4評(píng)價(jià)化合物10的抗腫瘤活性

測(cè)定前將本發(fā)明的化合物10加吐溫80助溶，溶于生理鹽水。無菌條件下取接種于ICR小鼠7-10天的S₁₈₀肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為2×10⁷/mL，接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。腫瘤接種24h后，治療組小鼠每日腹腔注射0.2mL 10a-d的水溶液，連續(xù)給藥7天，劑量為1μmol/kg?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水。以阿霉素(腹腔注射劑量為2μmol/kg)作陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第8天，稱小鼠體重，并剖取各組小鼠的腫瘤稱重，以瘤重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表2。實(shí)驗(yàn)觀察到，在1μmol/kg的劑量下化合物10顯示出了良好的抗腫瘤活性，而姜黃素僅有微弱的抗腫瘤活性。

表2 10對(duì)荷S180小鼠腫瘤重量的影響^a

a)與生理鹽水，姜黃素及姜黃素+The+RGDS物理混合比p＜0.01；n＝15.

實(shí)驗(yàn)例5評(píng)價(jià)10的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性

取接種8-10天生長良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，頸椎脫臼，用75％乙醇浸泡消毒10min，在超凈工作臺(tái)上剝離瘤體，選擇生長良好的瘤組織，在無菌平皿中剪碎，放置于玻璃組織勻漿器內(nèi)，按瘤塊重(g)∶生理鹽水體積(mL)為1∶3的比例加入4℃預(yù)冷的生理鹽水輕輕研磨，制成細(xì)胞懸液，過200目尼龍網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×10⁷/mL。取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窩皮膚，右手持1mL無菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤細(xì)胞懸液0.2mL(含腫瘤細(xì)胞數(shù)約為1.5×10⁷/mL)。接種后8-10天可以生長成4-5mm大小的腫瘤。測(cè)量腫瘤體積，按腫瘤平均體積將小鼠隨機(jī)分組。從接種腫瘤第9天開始給藥，治療組小鼠每日腹腔注射0.2mL 10的水溶液，連續(xù)給藥11天，劑量為0.1μmol/kg?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水。以Arg-Gly-Asp-Ser和姜黃素(腹腔注射劑量為10μmol/kg)作陽性對(duì)照。每隔兩天測(cè)量并記錄腫瘤體積和體重。在第22天測(cè)量瘤體積后，稱取小鼠體重，摘眼球取血并脫頸椎處死小鼠，然后用鑷子固定住小鼠右腋腫瘤生長部位，剪開皮膚，暴露腫瘤，鈍性剝離腫瘤并稱重，以瘤重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表3。實(shí)驗(yàn)觀察到，腹腔給與0.1μmol/kg10可有效抑制小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移(p＜0.05)，而且與10μmol/kg Arg-Gly-Asp-Ser的活性相當(dāng)(p＞0.05，有效劑量下降了100倍)。數(shù)據(jù)還表明10在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的同時(shí)能夠抑制原發(fā)腫瘤生增長，與生理鹽水相比具有顯著性差異(p＜0.05)，而且與10μmol/kg姜黃素的活性相當(dāng)(p＞0.05，劑量下降了100倍)。

表3 10對(duì)Lewis肺癌小鼠原發(fā)瘤瘤重及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響

a)與生理鹽水相比p＜0.05，與RGDS相比p＞0.05；b)與生理鹽水相比p＜0.05，與姜黃素相比p＞0.05；n＝12。

實(shí)驗(yàn)例6評(píng)價(jià)10的抗炎癥活性

ICR雄性小鼠105只，體重18-22g，隨機(jī)分為10a-d，阿司匹林組和空白對(duì)照組，每組 12只。治療組小鼠腹腔注射0.2mL 10的水溶液，劑量為1μmol/kg?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水。以阿司匹林(口服給藥劑量為1100μmol/kg)作陽性對(duì)照。給藥30分鐘后，在小鼠左耳朵耳廓內(nèi)側(cè)均勻涂抹30μL二甲苯，2小時(shí)后乙醚麻醉頸椎脫臼處死小鼠，分別將左、右兩耳外耳廓剪下并重合疊放在一起，用直徑7mm的打孔器在同一位置打取圓形耳片，稱重并記錄并計(jì)算兩耳重量差并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；鼠耳腫脹度(mg)＝左耳片重-右耳片重。數(shù)據(jù)列入表4。實(shí)驗(yàn)觀察到，10在1μmol/kg劑量下可有效地抗炎，活性是阿司匹林的110倍。

表4腹腔注射10對(duì)小鼠炎癥的影響

a)與生理鹽水及110μmol/kg阿司匹林比p＜0.01；n＝12。

實(shí)驗(yàn)例7評(píng)價(jià)10的抗血栓活性

SD雄性大鼠105只，體重180-220g，隨機(jī)分組，阿司匹林組、姜黃素組和空白對(duì)照組，每組12只。治療組小鼠腹腔注射0.2mL 10的水溶液，劑量為1nmol/kg?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水。以阿司匹林(口服給藥劑量為167μmol/kg)作陽性對(duì)照。給藥30分鐘后，各組大鼠以20％烏拉坦麻醉，分離出頸總動(dòng)脈和頸總靜脈，以大鼠頸總動(dòng)脈-靜脈插管旁路循環(huán)絲線法造成大鼠動(dòng)脈血栓模型；循環(huán)15分鐘，取出旁路管中的帶栓的絲線，拭去表面浮血，稱量帶栓絲線濕重，減去絲線重量后，即得形成血栓的濕重，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)觀察到，1nmol/kg 10能抑制血栓形成，活性與167μmol/kg阿司匹林相當(dāng)(p＞0.05，劑量比阿司匹林下降了167000倍)。姜黃素在這個(gè)劑量下沒有血栓抑制活性。數(shù)據(jù)列入表5。

表5腹腔注射10對(duì)大鼠血栓的影響

a)與生理鹽水相比p＜0.01，與阿司匹林比p＞0.05；n＝12。