本發(fā)明涉及(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Pro-Ala-Lys，涉及它的制備方法，涉及它治療缺血性中風(fēng)的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
缺血性中風(fēng)是一類(lèi)較常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點(diǎn)是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒(méi)有有效藥物的現(xiàn)實(shí)，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對(duì)中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開(kāi)式II的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa1和aa2可為同時(shí)存在，aa1存在但aa2不存在，或同時(shí)不存在；當(dāng)aa1和aa2同時(shí)存在時(shí)，aa1為R(Arg)，且aa2為G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa1存在但aa2不存在時(shí)，aa1為R(Arg)；aa3可為S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的取代咪唑啉結(jié)構(gòu)單元比較復(fù)雜需要簡(jiǎn)化。
發(fā)明人在經(jīng)過(guò)3年實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲?；媸絀I的取代咪唑啉結(jié)構(gòu)單元可以獲得結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和療效好意想不到的雙重技術(shù)效果。按照這個(gè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供下式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Pro-Ala-Lys。
本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供上式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Pro-Ala-Lys的合成方法，該方法包括：
(1)在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)存在下Boc-Pro在無(wú)水THF中與N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)縮合為Boc-Pro-OSu，在NaHCO3存在下Boc-Pro-OSu與Ala反應(yīng)生成Boc-Pro-Ala；
(2)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在無(wú)水THF中與Lys(Z)-OBzl縮合為Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(3)在氯化氫-乙酸乙酯溶液中Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl脫去Boc保護(hù)基生成Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(4)在稀硫酸存在下，甲醛與L-組氨酸在60℃下反應(yīng)，生成(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸；
(5)在DCC和HOBt存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸在無(wú)水四氫呋喃中與Lys(Boc)-OBzl縮合為(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl。
(6)在Pd/C存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl在甲醇溶液中脫去OBzl生成(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)；
(7)在DCC和HOBt存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)在無(wú)水四氫呋喃中與HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl縮合為(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl。
(8)將步驟(7)所制備的化合物脫去保護(hù)基，得到上式所示的化合物。
其中所述HOBt是N-羥基苯并三氮唑的縮略術(shù)語(yǔ)，DCC是二環(huán)己基羰二亞胺的縮略術(shù)語(yǔ)，Boc為叔丁氧羰基的縮略術(shù)語(yǔ)，Pd/C為鈀/碳。
本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)上式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Pro-Ala-Lys治療缺血性中風(fēng)的活性。
附圖說(shuō)明
圖1(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Pro-Ala-Lys的合成路線。
(i)H2SO4，HCHO，60℃；(ii)1N NaOH，(Boc)2O；(iii)DCC，HOBt，NMM；(iV)H2，Pd/C；(v)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；(vi)TFA/TFSA；(vii)HOSu，DCC。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1制備(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)
將10g(64.5mmol)L-His用80mL蒸餾水和20mL甲醛混合溶液溶解，然后往里滴加1mL濃H2SO4，60℃微波反應(yīng)5小時(shí)，冷卻到室溫，往反應(yīng)化合物中冰浴下滴加濃氨水調(diào)pH至7，有大量沉淀析出。過(guò)濾，得10.5g(97％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)167[M+H]+。
實(shí)施例2制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)
冰浴下將1.67g(10mmol)(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸溶于5ml2N氫氧化鈉水溶液。往該反應(yīng)液中加5.23g(24mmol)(Boc)2O與10mL二氧六環(huán)的溶液。室溫?cái)嚢瑁琓LC(CH2Cl2∶MeOH＝15∶1)監(jiān)控反應(yīng)原料點(diǎn)消失。反應(yīng)完成后，過(guò)濾，濾液減壓濃縮除去二氧六環(huán)。殘留的水層用飽和KHSO4水溶液酸化至pH值至2，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯層，并用少量水反洗，乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，減壓濃縮得到的淡黃色固體用乙酸乙酯浸泡磨洗，過(guò)濾，得1.55g(42％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)367[M+H]+。
實(shí)施例3制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl(3)
冰浴和攪拌下3.67g(10.0mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸，1.48g(11.0mmol)HOBt和2.47g(12.0mmol)DCC加50ml無(wú)水THF溶解，反應(yīng)液活化30分鐘。然后將3.91g(10.5mmol)Tos·Lys(Boc)-OBzl與50mL無(wú)水THF并用1.0mL NMM調(diào)節(jié)pH至9的懸浮液滴加到活化的反應(yīng)液中。撤去冰浴，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，濾除二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，再濾除DCU。濾液層依次用飽和NaHCO3溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和KHSO4溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和NaHCO3溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾、濾液減壓濃縮，殘留物經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮體系8∶1-2∶1)純化得3.97g(58％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體，ESI-MS(m/z)686[M+H]+。
實(shí)施例4制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)(4)
稱(chēng)取200mg(0.29mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl于50mL茄形瓶中，用10mL甲醇溶解后，加入20mg Pd/C，先用真空水泵抽走反應(yīng)瓶中的空氣，然后通入氫氣，如此反復(fù)三次，最后保持通氫氣狀態(tài)反應(yīng)12小時(shí)，利用TLC(石油醚∶丙酮＝3∶1)監(jiān)測(cè)至原料斑點(diǎn)消失后，減壓過(guò)濾，將濾液減壓濃縮至干得160mg(92％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體，ESI/MS(m/e)：596[M+H]+。
實(shí)施例5制備HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
5-1)制備Boc-Pro-Ala
冰浴下向1.075g(5.0mmol)Boc-Pro和20mL無(wú)水THF的溶液中加0.637g(5mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，并使完全溶解。往該溶液中加少量無(wú)水THF與1.236g(6.0mmol)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)的溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)監(jiān)測(cè)Boc-Pro消失。濾除DCU，濾液減壓濃縮除去THF。殘留物先用乙酸乙酯溶解，然后依次用飽和NaHCO3水溶及飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層減壓濃縮至干，殘留物加入適量THF溶解。往該溶液中加已溶于少量水的0.489g(5.5mmol)Ala溶液。得到的反應(yīng)液用NaHCO3固體調(diào)pH到9，室溫反應(yīng)12小時(shí)，減壓濃縮除去THF，殘留物加5mL水溶解，用飽和KHSO4水溶液調(diào)pH到2，用乙酸乙酯少量多次萃取，合并的乙酸乙酯層用飽和NaCl水溶液洗至中性，用無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾，濾液減壓濃縮得1.41g(98％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：285[M-H]-。
5-2)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
采用實(shí)施例3的方法從1.43g(5.0mmol)Boc-Pro-Ala和2.71g(5.0mmol)Lys(Z)-OBzl得3.09g(97％)標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/e)：639[M+H]+。
5-3)制備HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
將0.638g(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10mL乙酸乙酯。冰浴下向得到的溶液中加15mL濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝1∶1)顯示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合液在室溫下減壓濃縮，殘留物再用乙酸乙酯溶解并室溫減壓濃縮，如此反復(fù)3次，除凈游離氯化氫。殘留物用無(wú)水乙醚析晶，得0.516g(90％)標(biāo)題化合物，直接用于下步反應(yīng)。ESI-MS(m/e)：539[M+H]+。
實(shí)施例6制備3，5-二-Boe-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(5)
采用實(shí)施例5的方法從819mg(1.38mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑 [4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)和834mg(1.45mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl，純化得461mg(30％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體產(chǎn)物。ESI-MS(m/e)：1116[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.22-8.09(m，2H)，7.35-7.20(m，9H)，5.10(s，2H)，5.00(s，2H)，4.79(m，1H)，4.51-4.39(m，2H)，4.28-4.22(m，3H)，2.96-2.84(m，5H)，1.74-1.62(m，4H)，1.57(s，9H)，1.44(s，9H)，1.37(s，9H)，1.29-1.15(m，7H).
實(shí)施例7制備4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys-Pro-Ala-Lys(6)
冰浴下向100mg(0.089mmol)3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl中加3mL TFA和1mL TFMSA，攪拌30min后TLC(CH2Cl2∶MeOH＝1∶1)顯示原料點(diǎn)消失，停止反應(yīng)。反應(yīng)物用無(wú)水乙醚反復(fù)洗滌，減壓濃縮至干，殘留物用水溶解，用氨水調(diào)pH值至8。得到的溶液先用Sephadex G10除鹽，然后用制備柱T3 Prep OBDTM 5μm 30×150mm純化。相應(yīng)的餾分凍干得11mg(21％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：592[M+H]+；1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.768(m，1H)，8.593(s，1H)，8.015(m，1H)，7.972(m，1H)，7.782(m，3H)，7.733(m，2H)，4.519(m，1H)，4.368(m，1H)，4.280-4.230(m，4H)，4.146(m，1H)，3.625(m，1H)，3.551(m，1H)，3.322(m，1H)，2.765-2.726(m，5H)，2.008(m，1H)，1.907-1.833(m，3H)，1.715-1.678(m，2H)，1.589-1.490(m，6H)，1.424-1.394(m，2H)，1.353-1.307(m，2H)，1.211-1.197(m，3H)。
實(shí)驗(yàn)例1評(píng)價(jià)化合物6對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用
評(píng)價(jià)方法
SD雄性大鼠(280-300g)用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，從頸部正中略偏右部豎直開(kāi)約2cm長(zhǎng)切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開(kāi)口處和頸總動(dòng)脈近心端，在頸外動(dòng)脈剪一小口，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，松開(kāi)頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，取10μL血，取血之后再用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端。將取得的10μL血裝入1mLEP管中，先在常溫下放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時(shí)，使血液凝塊結(jié)實(shí)。1小時(shí)后取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水用鋼鏟把血液凝塊搗成大小比較均一的細(xì)小血栓，然后把細(xì)小血栓混懸液轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)備用。松開(kāi)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈夾的同時(shí)，將上述1mL注射器內(nèi)的血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，打開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈處得動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流。然后分離大鼠頸總靜脈，注入治療藥物，結(jié)扎靜脈，傷口處滴加3滴青霉素(40mg/10mL)，縫合傷口，等待動(dòng)物蘇醒。供試化合物的劑量為1nmol/kg(溶于生理鹽水)。大鼠蘇醒24小時(shí)后按Zealonga方法(Wen Wang，Jingdong Xu，Lei Li， Peichang Wang，Xunming Ji，Houxi Ai，Li Zhang，Lin Li，Neurolorotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats.Brain Research Bulletin，2010，83，196-201)評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無(wú)任何神經(jīng)功能缺失體征，1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展，2分表示向未損傷側(cè)行走，3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走，4分表示意識(shí)障礙無(wú)自主行走，5分表示死亡。將以上各組評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，并作t檢驗(yàn)。
大鼠蘇醒24小時(shí)Zealonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度后，用烏拉坦麻醉后迅速斷頭取腦，將腦組織置于-20℃冰箱2小時(shí)后，從前額極開(kāi)始行約2mm冠狀連續(xù)切片，共6片，然后置于2％TTC溶液中37℃避光孵育30min，并觀察腦切片的顏色變化，正常組織被TTC染成紅色，而缺血組織呈白色。然后用數(shù)碼相機(jī)照相，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算冠狀切片中梗死體積和正常組織的面積，統(tǒng)計(jì)各組的梗死體積百分比值，并做t檢驗(yàn)。
大鼠蘇醒后24小時(shí)，按Zealonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度，評(píng)分結(jié)果列入表1，大鼠腦梗死體積百分比如下表2。結(jié)果表明1nmol/kg化合物6能有效地保護(hù)中風(fēng)大鼠的腦神經(jīng)。因?yàn)椴幌褚呀?jīng)公開(kāi)的化合物需要5μmol/kg劑量，化合物6的劑量為1nmol/kg。這樣一來(lái)，1次劑量降低了5000倍。獲得了意想不到的技術(shù)效果。
表1 1nmol/kg化合物6治療大鼠蘇醒24h后評(píng)分
n＝10；a)與生理鹽水組比p＜0.01。
表2 1nmol/kg化合物6治療大鼠大腦梗死體積百分比
n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01，與t-PA比p＞0.05。