本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對(duì)天然動(dòng)植物的提取、化學(xué)合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學(xué)合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，開發(fā)一些傳統(tǒng)方法無法生產(chǎn)的新型煙用香原料。

微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應(yīng)條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補(bǔ)懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點(diǎn)。因此，近年來，微生物固定化技術(shù)的研究非?；钴S，發(fā)展較快，已應(yīng)用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護(hù)，新能源開發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個(gè)方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護(hù)中用于環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)廢水的處理；在新能源開發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識(shí)別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡單化、安全自動(dòng)化、無污染等方向發(fā)展，在能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的情況下，由此將推動(dòng)其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應(yīng)用，具有更加深遠(yuǎn)的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應(yīng)用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用月桂提取物卻未見報(bào)道。

月桂(學(xué)名：laurusnobilis)，樟科月桂屬小喬木或灌木植物。月桂原產(chǎn)于地中海一帶，中國浙江、江蘇、福建、四川、云南等地有引種栽培。以月桂為原料的月桂浸膏、月桂提取物、月桂精油等在卷煙中應(yīng)用廣泛，具有豐富煙香、增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣的作用。

醋酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量醋酸等有機(jī)酸細(xì)菌的通稱，醋酸菌廣泛應(yīng)用于食醋、果醋等釀造行業(yè)中，但在煙用天然香料的制備中卻很少報(bào)道。醋酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸，這些有機(jī)酸在卷煙中具有降低刺激性和柔和細(xì)膩煙氣的作用，同時(shí)，還能賦予卷煙特征的酸香風(fēng)格，因此，醋酸菌發(fā)酵在提升煙用天然香料的品質(zhì)方面具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，采用固定化醋酸菌發(fā)酵技術(shù)，開發(fā)了一種新型的月桂提取物，該提取物可以在卷煙中使用，能夠豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。

本發(fā)明提供一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，其特征在于具體包括以下步驟：

(1)取月桂根葉，加入其重量2～5倍的水，浸泡12～24h，在95～100℃下回流提取2～3次，每次提取時(shí)間為2～3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到月桂提取物a；

(2)將醋酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；

(3)醋酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2～5％的步驟(2)中制備的醋酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；

(4)將步驟(1)中制備的月桂提取物a與步驟(3)中制備的固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比5～10:1混合，在溫度為30～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1～5rpm的條件下發(fā)酵3～7d，然后置于4℃冷柜中保存7～14d；

(5)取步驟(4)中冷藏后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.30，得月桂提取物b；

(6)將步驟(5)的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進(jìn)料溫度為50℃～65℃，進(jìn)料速度為5～50ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為120～180rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質(zhì)量的百分比為10％～30％。

本發(fā)明中采用的醋酸菌為醋化醋桿菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno：m2016436。

本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物工藝的不足。

本發(fā)明以月桂根為原料，利用固定化醋酸菌發(fā)酵月桂提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用月桂提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性等作用，同時(shí)還賦予卷煙特色的酸香風(fēng)格；與懸浮醋酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的月桂提取物有機(jī)酸含量增加了2.15％～5.68％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。該方法替代了月桂提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對(duì)煙用月桂提取物的制備提供了一條新途徑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

本發(fā)明中采用的醋酸菌為醋化醋桿菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccno：m2016436。

本發(fā)明以下實(shí)施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸鈉)固定化醋酸菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸鈉(sa)對(duì)醋酸菌進(jìn)行固定化得到的：

(1)將醋酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中肉湯培養(yǎng)基為常用的普通肉湯培養(yǎng)基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1；

(2)醋酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％-10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％-3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2-5％的步驟(2)中制備的醋酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1-5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1-3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液的量和飽和na2so4溶液的量并無特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足醋酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要將小球完全浸泡便可；所述硼酸飽和溶液和飽和na2so4溶液均為飽和水溶液。

實(shí)施例1，一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，包括以下步驟：

(1)將月桂葉粉碎，加入其重量5倍的水浸泡12小時(shí)，然后在100℃下回流提取2次，每次提取時(shí)間為3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并兩次提取液，得到月桂提取物a，兩次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的月桂提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵4d，然后置于4℃冷柜中保存7d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵冷藏靜置后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量3倍的95％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25，得月桂提取物b；

(4)取步驟(3)中制備的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進(jìn)料溫度為50℃～65℃，進(jìn)料速度為5～50ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為120～180rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質(zhì)量的百分比為20％。

實(shí)施例1中制備的月桂提取物在卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。

實(shí)施例2，一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，包括以下步驟：

(1)將月桂葉粉碎，加入其重量3倍的水浸泡24小時(shí)，在98℃下回流提取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到月桂提取物a；三次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的月桂提取物a與制備的固定上述方法中制備的化醋酸菌小球按照質(zhì)量比8:1混合，在溫度為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為3rpm的條件下發(fā)酵5d，，然后置于4℃冷柜中保存10d；

(3)將步驟(3)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量4倍的80％酒精溶液，沉淀48小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.30，得月桂提取物b；

(4)取步驟(3)中制備的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進(jìn)料溫度為50℃～65℃，進(jìn)料速度為5～50ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為120～180rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質(zhì)量的百分比為30％。

實(shí)施例2中制備的月桂提取物具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。

實(shí)施例3，一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，包括以下步驟：

(1)將月桂葉粉碎，加入其重量2倍的水浸泡20小時(shí)，在95℃下回流提取3次，每次提取時(shí)間為3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到月桂提取物a；三次提取條件完全相同；

(2)將步驟(1)中的月桂提取物a與上述方法制備的固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比10:1混合，在溫度為36℃，攪拌轉(zhuǎn)速為4rpm的條件下發(fā)酵7，，然后置于4℃冷柜中保存14d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的95％酒精溶液，沉淀48小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.15，得月桂提取物b；

(4)取步驟(3)中制備的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進(jìn)料溫度為50℃～65℃，進(jìn)料速度為5～50ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為120～180rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質(zhì)量的百分比為40％。

實(shí)施例3中制備的月桂提取物具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人將本發(fā)明制備的月桂提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的月桂提取物、采用懸浮醋酸菌發(fā)酵制備的月桂提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進(jìn)行評(píng)吸，其評(píng)吸效果如下：

三種不同工藝制備的月桂提取在卷煙中的感官評(píng)價(jià)效果比較

從上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出來，本發(fā)明中制備的月桂提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮醋酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的月桂提取物有機(jī)酸含量增加了2.15％～5.68％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。